实验报告荧光蛋白基因的原核表达医学心理学病毒学_高等教育-大学课件.pdf

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1、题目：荧光蛋白基因的原核表达 实验目的:1.学习细菌质粒的提取与检测的原理和方法。2.学习制备感受态细胞并将质粒导入工程菌的原理和方法。实验原理 1.感受态细胞的制备：将快速生长的大肠杆菌置于经低温（oc）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞 膨胀，同时 Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分 核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞，细胞膜通透性发生变化，极易 与外源 DNA 相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物。联合其它的二价金属离子（如 Mn Co）、DMS（或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高 100 1000

2、 倍。2.质粒的导入 在冰上融化感受态细胞，经过 42 度短暂热激后，由于细胞膜处于液晶态产生裂缝，外源 DNA 黏附于细胞表面，而后立即冰浴，促使细胞膜愈合。然后将菌体放入适宜的培养基中培 养，以促进细胞的愈合恢复。3.阳性转化的培养基筛选方法。普通的大肠杆菌难以在含有 Kana 的 LB 培养基上存活繁殖，但由于载体质粒含有 Kana 霉 素的抗性基因，所以成功导入载体质粒的大肠杆菌能够在含有 Kana 的 LB 培养基上形成菌 落，即转化阳性，但是由于成功导入的质粒不一定携带了目的基因，所以可能会出现伪阳 性，故需要进行 PCF 鉴定。实验材料及设备 入工程菌的原理和方法实验原理感受态细

3、胞的制备将快速生长的大肠杆菌置于经低温预处理的低渗氯化钙溶液中便会造成细胞膨胀同时会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来离开所羟基磷酸钙复合物合其它的二价金属离子如或还原剂等物质处理细菌则可使转化率提高倍质粒的导入在冰上融化感受态细胞经过度短暂热激后由于细胞膜处于液晶态产生裂缝外源黏附于细胞表面而后立即冰浴促使细胞膜愈合然后将养基上存活繁殖但由于载体质粒含有霉素的抗性基因所以成功导入载体质粒的大肠杆菌能够在含有的培养基上形成菌落即转化阳性但是由于成功导入的质粒不一定携带了目的基因所以可能会出现伪阳性故需要进行鉴定实验材料及设1.实验材料：(1)已完成转化

4、的 GFP与RFP质粒阳性克隆 DH5a大肠杆菌。(2)冰冻的感受态 DH5a大肠杆菌。2.实验仪器：恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000卩L取液器各一 支，台式高速离心机，制冰机，漩涡器；3.实验试剂：(1)质粒的转化与转化导入 入工程菌的原理和方法实验原理感受态细胞的制备将快速生长的大肠杆菌置于经低温预处理的低渗氯化钙溶液中便会造成细胞膨胀同时会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来离开所羟基磷酸钙复合物合其它的二价金属离子如或还原剂等物质处理细菌则可使转化率提高倍质粒的导入在冰上融化感受态细胞经过度短暂热激后由于细胞膜处于液晶态产

5、生裂缝外源黏附于细胞表面而后立即冰浴促使细胞膜愈合然后将养基上存活繁殖但由于载体质粒含有霉素的抗性基因所以成功导入载体质粒的大肠杆菌能够在含有的培养基上形成菌落即转化阳性但是由于成功导入的质粒不一定携带了目的基因所以可能会出现伪阳性故需要进行鉴定实验材料及设a.溶液I,溶液，溶液川；c.卡那霉素(50mg/mL);d.抽提液(饱和酚：氯仿：异 戊醇=25:24:1)作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离。平衡酚密度大，可是 DNA在上 清中。异戊醇防止抽提液起泡。e.无水乙醇 作用：除去DNA 水化层，使DNA沉淀。f.70%乙醇 作用：纯化质粒 DNA g.TE缓冲液或ddH2O

6、 作用：溶解DNA 入工程菌的原理和方法实验原理感受态细胞的制备将快速生长的大肠杆菌置于经低温预处理的低渗氯化钙溶液中便会造成细胞膨胀同时会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来离开所羟基磷酸钙复合物合其它的二价金属离子如或还原剂等物质处理细菌则可使转化率提高倍质粒的导入在冰上融化感受态细胞经过度短暂热激后由于细胞膜处于液晶态产生裂缝外源黏附于细胞表面而后立即冰浴促使细胞膜愈合然后将养基上存活繁殖但由于载体质粒含有霉素的抗性基因所以成功导入载体质粒的大肠杆菌能够在含有的培养基上形成菌落即转化阳性但是由于成功导入的质粒不一定携带了目的基因所以可能会出现伪阳性

7、故需要进行鉴定实验材料及设e.LB培养液:胰蛋白胨(Tryptone)10g,酵母提取物(Yeast extract)5g,NaCI5g，琼脂(固体培养基)15g,用 1N NaOH调 pH7.5;四.实验方法及步骤 实验流程图 1.质粒DNA的提取CaClj 入工程菌的原理和方法实验原理感受态细胞的制备将快速生长的大肠杆菌置于经低温预处理的低渗氯化钙溶液中便会造成细胞膨胀同时会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来离开所羟基磷酸钙复合物合其它的二价金属离子如或还原剂等物质处理细菌则可使转化率提高倍质粒的导入在冰上融化感受态细胞经过度短暂热激后由于细胞膜处

8、于液晶态产生裂缝外源黏附于细胞表面而后立即冰浴促使细胞膜愈合然后将养基上存活繁殖但由于载体质粒含有霉素的抗性基因所以成功导入载体质粒的大肠杆菌能够在含有的培养基上形成菌落即转化阳性但是由于成功导入的质粒不一定携带了目的基因所以可能会出现伪阳性故需要进行鉴定实验材料及设a）将带有质粒的DH5a大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉 素50卩g/mL）,37C培养过夜；b）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpmX 2min，弃上 清液；c）加入100卩L溶液I,漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min;d）加入200卩L新配制的溶液，轻轻翻转 23次，使之混匀，冰 上放

9、置5 min;e）加入150卩L冰冷的溶液川，盖紧后，温和颠倒 3-5次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置 15 min;f）10000rpmX 5 min，取上清液于另一干净的离心管中；g）向上清液中加入等体积（约400卩L）酚：氯仿/异戊醇（25:24:1,v/v）,振荡混匀，10000rpm x 10 min，将上清液转移至新的离 心管中；h）加入等体积（约370卩L）氯仿/异戊醇（24:1）,混匀，10000rpm x 2min,取上清液于新离心管中；i）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h；j）12000rpm x 5 min，倒去上清液，吸干液体；k）力口 800卩

10、L70%乙醇，离心12000rpm x 1 min，倒尽上清液，吸 水纸吸干液体，室温自然干燥 30min，直至变得透明无乙醇味 l）加20卩L ddH2O，混匀使DNA溶解完全，取5卩L做电泳检测，剩余的入工程菌的原理和方法实验原理感受态细胞的制备将快速生长的大肠杆菌置于经低温预处理的低渗氯化钙溶液中便会造成细胞膨胀同时会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来离开所羟基磷酸钙复合物合其它的二价金属离子如或还原剂等物质处理细菌则可使转化率提高倍质粒的导入在冰上融化感受态细胞经过度短暂热激后由于细胞膜处于液晶态产生裂缝外源黏附于细胞表面而后立即冰浴促使细胞膜

11、愈合然后将养基上存活繁殖但由于载体质粒含有霉素的抗性基因所以成功导入载体质粒的大肠杆菌能够在含有的培养基上形成菌落即转化阳性但是由于成功导入的质粒不一定携带了目的基因所以可能会出现伪阳性故需要进行鉴定实验材料及设溶液保存备用。2.转化质粒的导入 a）取出感受态细胞 DH5a让其在冰上自然解冻，每100卩L解冻的感 受态细胞加入整管连接产物，混匀后冰浴 30min。b）42 C热冲击45秒，立即置于冰浴5min。c）热激法：使用化学试剂（如 CaCI2）制备的感受态细胞，细胞膜 通透性发生变化，极易与外源DNA想粘附并在细胞表面形成脱氧 核糖酸酶的羟基-磷酸钙复合物。此时，将该体系转移到 420

12、C下 做短暂的热刺激，细胞膜的液晶结构会发生剧烈运动，并随机出 现许多间隙，外源 DNA就可能被细胞吸收；d）冰浴过程中不要摇动 EP管；（使破裂的菌体自然恢复）e）再在感受态细胞混合物中加入 0.8mL的LB培养基，于37C摇床 中培养1h。目的：使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性 基因；f）涂布于含有kana的LB固定培养基表面，37 C培养过夜。入工程菌的原理和方法实验原理感受态细胞的制备将快速生长的大肠杆菌置于经低温预处理的低渗氯化钙溶液中便会造成细胞膨胀同时会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来离开所羟基磷酸钙复合物合其它的二价

13、金属离子如或还原剂等物质处理细菌则可使转化率提高倍质粒的导入在冰上融化感受态细胞经过度短暂热激后由于细胞膜处于液晶态产生裂缝外源黏附于细胞表面而后立即冰浴促使细胞膜愈合然后将养基上存活繁殖但由于载体质粒含有霉素的抗性基因所以成功导入载体质粒的大肠杆菌能够在含有的培养基上形成菌落即转化阳性但是由于成功导入的质粒不一定携带了目的基因所以可能会出现伪阳性故需要进行鉴定实验材料及设五.实验结果 图 1 表达红色荧光蛋白的 BL21 图 2 表达绿色荧光蛋白的 BL21 菌落生长情况:可以看到，在培养基的边缘分别有明显的绿色和红色菌落。绿色荧光蛋白表达大肠杆菌菌落较小，数量较多。大部分菌落都有明显的目的

14、基因表达表型。但仍然可见少量的假阳性 菌落。菌落分布不均，可能是倒置培养基过早或菌液过多导致菌液流动。入工程菌的原理和方法实验原理感受态细胞的制备将快速生长的大肠杆菌置于经低温预处理的低渗氯化钙溶液中便会造成细胞膨胀同时会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来离开所羟基磷酸钙复合物合其它的二价金属离子如或还原剂等物质处理细菌则可使转化率提高倍质粒的导入在冰上融化感受态细胞经过度短暂热激后由于细胞膜处于液晶态产生裂缝外源黏附于细胞表面而后立即冰浴促使细胞膜愈合然后将养基上存活繁殖但由于载体质粒含有霉素的抗性基因所以成功导入载体质粒的大肠杆菌能够在含有的培养基

15、上形成菌落即转化阳性但是由于成功导入的质粒不一定携带了目的基因所以可能会出现伪阳性故需要进行鉴定实验材料及设六.结果讨论与结论:1.实验结论：通过导入DH5a扩增的质粒，以及用ITPG诱导，我们成功实现了 目的荧光蛋白基因在 BL21中的大量表达。从菌落外观可以直接看出 表达的荧光蛋白。2.讨论一：BL21与DH5a等感受态细菌特点及应用的特征，用处。（1）DH5a和BL21都可以作为表达宿主。（2）BL21是蛋白酶缺陷株，表达出来的蛋白不会被降解，做蛋白表达是比较适合用的，。BL21生长要比DH5a快，这是他们的又一区别，在高密度发酵 BL21表达蛋白时，需要控制它的表达条件，使得高密度且高

16、表达。（3）DH5a复制稳定的特点，所以它是核酸疫苗通常使用的宿 主株。DH5a中表达时外源基因的启动子必须被大肠杆菌的 RNA POLYMERAS职别，比较好用的载体有 PLPR可诱导的启动子。而 带有T7启动子的载体则不能在其中表达，因为识别T7启动子的 T7 RNA POLYMERAS在 DH5a中没有。对于BL21,已将T7 RNA POLYMERAS的编码基因整合到了菌的基 因组上，能识别 T7启动子，从而可容纳外源基因在此 T7启动子 入工程菌的原理和方法实验原理感受态细胞的制备将快速生长的大肠杆菌置于经低温预处理的低渗氯化钙溶液中便会造成细胞膨胀同时会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶

17、结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来离开所羟基磷酸钙复合物合其它的二价金属离子如或还原剂等物质处理细菌则可使转化率提高倍质粒的导入在冰上融化感受态细胞经过度短暂热激后由于细胞膜处于液晶态产生裂缝外源黏附于细胞表面而后立即冰浴促使细胞膜愈合然后将养基上存活繁殖但由于载体质粒含有霉素的抗性基因所以成功导入载体质粒的大肠杆菌能够在含有的培养基上形成菌落即转化阳性但是由于成功导入的质粒不一定携带了目的基因所以可能会出现伪阳性故需要进行鉴定实验材料及设的带动下表达。3.讨论二：IPTG在实验中的作用 Lac阻抑物是一种具有 4个相同亚基的四级结构蛋白，都有一个 与诱导剂集结合的位点。在没有乳

18、糖存在时，lac操纵子处于阻抑 状态，LAC阻抑物能与操纵基因 0结合，阻抑 RNA聚合酶与P序 列结合，阻止了转录的路径，从而抑制转录启动。而当有诱导剂（IPTG）存在时，诱导剂可与阻抑蛋白结合，使阻抑蛋白构象发生 变化，导致阻抑物从操纵基因 0上解离下来，RNA聚合酶不再受阻 碍，启动子P开始发生转录，启动反应开始发生转录，启动反应 开始发生转录。在这个操纵子体系中，真正的诱导剂是乳糖本身。乳糖进入细胞，经酶催化，转变为半乳糖-即生理上的诱导剂。而 在实验中，通常选用IPTG作为诱导剂，IPTG是一种作用极强的诱 导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。4.讨论三：为什么会出现

19、假阳性，为什么部分菌落的荧光蛋 白表达量高于其他菌落。由于导入质粒到 DH5u时，没有携带目的基因片段的载体也能使大 肠杆菌在卡那霉素中存活，所以经过简单筛选的菌体也可能会被 扩增，如果这些没有携带完整目的基因片段的载体再进入到 BL21 中，就会产生实验结果中的假阳性。为什么从菌落外观上看，荧光蛋白的表达量不一：入工程菌的原理和方法实验原理感受态细胞的制备将快速生长的大肠杆菌置于经低温预处理的低渗氯化钙溶液中便会造成细胞膨胀同时会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来离开所羟基磷酸钙复合物合其它的二价金属离子如或还原剂等物质处理细菌则可使转化率提高倍质粒

20、的导入在冰上融化感受态细胞经过度短暂热激后由于细胞膜处于液晶态产生裂缝外源黏附于细胞表面而后立即冰浴促使细胞膜愈合然后将养基上存活繁殖但由于载体质粒含有霉素的抗性基因所以成功导入载体质粒的大肠杆菌能够在含有的培养基上形成菌落即转化阳性但是由于成功导入的质粒不一定携带了目的基因所以可能会出现伪阳性故需要进行鉴定实验材料及设1.导入质粒的基数不一，有的导入多，有的导入少，造成菌落菌 体中质粒数量不同，从而影响表达。2.大肠杆菌基因组发生突变，导致表达量提高。3.荧光蛋白基因发生突变，导致表达的荧光蛋白颜色发生变化。入工程菌的原理和方法实验原理感受态细胞的制备将快速生长的大肠杆菌置于经低温预处理的低渗氯化钙溶液中便会造成细胞膨胀同时会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来离开所羟基磷酸钙复合物合其它的二价金属离子如或还原剂等物质处理细菌则可使转化率提高倍质粒的导入在冰上融化感受态细胞经过度短暂热激后由于细胞膜处于液晶态产生裂缝外源黏附于细胞表面而后立即冰浴促使细胞膜愈合然后将养基上存活繁殖但由于载体质粒含有霉素的抗性基因所以成功导入载体质粒的大肠杆菌能够在含有的培养基上形成菌落即转化阳性但是由于成功导入的质粒不一定携带了目的基因所以可能会出现伪阳性故需要进行鉴定实验材料及设