细胞实验操作基本流程医学心理学基础医学_高等教育-大学课件.pdf

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1、细胞实验操作基本流程(基于明确的细胞试验计划)1.实验物品准备 1.1实验耗材准备 书面准备：明确列出使用物品名称、数量，报请老师批准。操作准备：物品清洗、干燥、打包灭菌、合理放置。1.2实验试剂准备 书面准备：明确列出使用物品名称、数量，报请老师批准。操作准备：选择合适的物品存放地点；使用前集中放置；需要配制的试剂根 据有无灭菌需要提前配好；需要无菌配制的试剂在无菌操作要求下配制。2.实验预约 2.1操作预约：401室在预约本上登记；分析测试中心向屈老师交申请单后在预 约本上登记。2.2细胞冻存复苏预约：每周定时开放液氮罐，由负责同学在群里通知。2.3细胞检测预约：填写申请单，向主管老师申请

2、。3.细胞房环境检査 3.1清洁消毒：操作前后有无清洁台面、地面，并行紫外线杀菌10-15分钟。3.2仪器设备：运行是否正常，有无灯光闪烁报警或标志警示，有无异常状况。3.3台面：是否洁净无污垢，有无多余物品放置，必要物品是否放置齐备。4.清沽准备 4.1洗手：肥皂洗5%。新洁尔灭泡手1()秒70%酒精喷手 4.2台面物品放置：正中：酒精灯；左侧：吸管及其他耗材盒于；右侧：试管架、大银于、酒精棉球瓶、打火机、移液器；左上方：试剂瓶；右上方：废液缸 5.实验操作 5.1基本操作：换液、传代、冻存、接板、复苏、细胞计数、细胞观察 5.2垃圾处理：培养基、缓冲液等使用过的无害废液用废液缸装；固体垃圾

3、丢入 垃圾筐中 6.实验善后 6.1可回收实验耗材处理：吸管、试管、离心管等可反复使用的耗材按标准流程 清洗。6.2不可回收实验废物处理 6.2.1酸碱类废液分类倒入废液瓶存放，由学院通知处理 6.2.2无害废液弃入水槽，大量流水冲洗 6.2.3固体垃圾放入垃圾袋，丢入垃圾桶 6.3种子细胞处理：实验过程中需要保种或实验完成后仍有未用完的种于细胞，按标准流程进行细胞冻存，以待后续使用。6.4实验试剂处理：未用完的试剂重新放回合适的存放地点；如试剂污染或变质,按实验废物处理。6.5报备：耗材、试剂如需补充，需要向老师申请批准购买；仪器设备如有损坏,需要告知负责同学或老师进行维修。报请老师批准操作

4、准备物品清洗干燥打包灭菌合理放置实验试剂准备书面准备明确列出使用物品名称数量报请老师批准操作准备选择合适的物品存放地点使用前集中放置需要配制的试剂根据有无灭菌需要提前配好需要无菌配制的试细胞冻存复苏预约每周定时开放液氮罐由负责同学在群里通知细胞检测预约填写申请单向主管老师申请细胞房环境检査清洁消毒操作前后有无清洁台面地面行紫外线杀菌分钟仪器设备运行是否正常有无灯光闪烁报警或标志警示有无喷手台面物品放置正中酒精灯左侧吸管及其他耗材盒于右侧试管架大银于酒精棉球瓶打火机移液器左上方试剂瓶右上方废液缸实验操作基本操作换液传代冻存接板复苏细胞计数细胞观察垃圾处理培养基缓冲液等使用过的无害废液用7.清洁值

5、周和安全检査 7.1清洁值周：轮流进行，以导师分组，每日例行清洁和周二、周五大扫除，需 要按要求进行清沽并在值周表上登记及拍照。7.2安全检査：清洁值周的同时需要每天巡视细胞房、准备间内的电器设备，有 情况需要及时上报。注意事项：1、试验计划三原则：要做什么、为什么这么做、准备怎么做 2、实验操作三原则：多看、多问、多想 3、突发事件处理：及时向负责同学、老师汇报情况 细胞操作相关仪器设备使用 恒温干燥箱使用注意事项 注意事项（一）干燥箱恒温干燥时恒温室下方的散热板上，不能放置物品，以免烤坏物 品或引起燃烧。（二）放入箱內的物品不应过多、过挤。（三）严禁把易燃、易爆、易挥发的物品放入箱内，以免

6、发生事故。（四）如果发现干燥箱箱门下方红灯报警必须尽快切断电源。（五）放置物品干燥时间不超过24小时。报请老师批准操作准备物品清洗干燥打包灭菌合理放置实验试剂准备书面准备明确列出使用物品名称数量报请老师批准操作准备选择合适的物品存放地点使用前集中放置需要配制的试剂根据有无灭菌需要提前配好需要无菌配制的试细胞冻存复苏预约每周定时开放液氮罐由负责同学在群里通知细胞检测预约填写申请单向主管老师申请细胞房环境检査清洁消毒操作前后有无清洁台面地面行紫外线杀菌分钟仪器设备运行是否正常有无灯光闪烁报警或标志警示有无喷手台面物品放置正中酒精灯左侧吸管及其他耗材盒于右侧试管架大银于酒精棉球瓶打火机移液器左上方试

7、剂瓶右上方废液缸实验操作基本操作换液传代冻存接板复苏细胞计数细胞观察垃圾处理培养基缓冲液等使用过的无害废液用二氧化碳培养箱使用 箱门应轻开轻闭，避免粗暴开关。取出细胞时应避免箱门长时间敞开，以免培养 箱内环境不稳定，孵箱中的水盆应定期（每 2 周左右）更换无菌双蒸水，并擦洗 水盆，紫外照射 30 分钟。二氧化碳气瓶更换 先关闭总阀和分压阀，更换后先开总阀，再慢慢调蜒分压阀，指针总阀在 5 分钟 左右，分压阀指针在 0.15 左右。超净台使用 使用超净台工作 15 分钟前开紫外灯进行照射灭菌，在进入操作之前应关掉紫外 灯，10分钟左右后进入。超净台上力求简洁，以利于保持无菌状态，每一步操 作均应

8、用酒精擦拭，不宜对着超净台说话。倒宣相差显微镜使用 分为 3 点：1.相差装置的调换与安装.卸下普通显微镜使用的聚光锯，将环状光阑装在聚 光器支架上，把绿色滤光片放在上面，它可以吸收红色和蓝色光，使波长范 围小的单色光线进行照明，并有吸热作用，能使相差观察获得良好的效果。再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。2.调焦。打开光源，旋转激光器装盘将对准林示孔，使普逋聚光器部分进 进光路。先使用低倍相差物镜，按普通显微镜操纵方法进行对光和调焦。旋 转环状光阑，使光阑的直径和孔宽与所使用的相差物镜相适应。3.合铀调養。拔出目镜，插进合铀看远镜，一边从看远镜内内观察，并用左手 报请老师批准操作准备物品

9、清洗干燥打包灭菌合理放置实验试剂准备书面准备明确列出使用物品名称数量报请老师批准操作准备选择合适的物品存放地点使用前集中放置需要配制的试剂根据有无灭菌需要提前配好需要无菌配制的试细胞冻存复苏预约每周定时开放液氮罐由负责同学在群里通知细胞检测预约填写申请单向主管老师申请细胞房环境检査清洁消毒操作前后有无清洁台面地面行紫外线杀菌分钟仪器设备运行是否正常有无灯光闪烁报警或标志警示有无喷手台面物品放置正中酒精灯左侧吸管及其他耗材盒于右侧试管架大银于酒精棉球瓶打火机移液器左上方试剂瓶右上方废液缸实验操作基本操作换液传代冻存接板复苏细胞计数细胞观察垃圾处理培养基缓冲液等使用过的无害废液用固定其外筒；一边用

10、右手转动看远镜内筒使其下降，当对准焦点就能看到环 状光阑的亮环和相板的黑环，此时可将看远镜固定住。再升降集光器并调节 其下的螺旋使亮环的大小与黑环一致，然后左右前后调节环状光阑聚光器上 的调节钮，使两环完全重合，如亮环比黑环小而位于内侧时，应降低集光器 使亮环放大；反之，则应升高聚光器，使亮环缩小。如若升到最高限度仍不 能完全重合，则可能是载玻片过厚之故，应更换。合抽调數完毕，抽出看远 镜，换回目镜，按常规要领进行观察.在更换不同倍率的相差物镜时，每一 次都要使用相匹配的环状光阑和重新合抽调蠡。使用油镜时，集光器上透镜 表面与载玻片之间要同时加上香柏油。極离心机使用 将需要离心的样品对称放入离

11、心机内，关好盖子，接上电源，调蠡转速和运转时 间，按离丿金。待转速降至 0000 后，打开盖子，取出样品。餾窗使用 每扇门旁设面板一块，面板有一只 LED 显示灯，一只开门按钮和一只杀菌灯开 关。显示灯为绿色时，为开门指示灯，灭表示对面的门卫开状态，禁止此门打开,按开门按钮无法打开门。亮表示允许开门，按开门按钮，门锁打开，开门传递物 件。杀菌开关可以控制箱内的杀菌灯的亮和灭。酸缸、酸筒使用 酸缸分为内缸和外缸,外缸里面放液体，内缸里面放要清洗的器皿，浸泡结束后,将内缸向上提出，内缸上面有很多的小孔，液体从内缸体小孔流出，取出物品,盖上盖子。移液器使用 一、标准操作 适用的液体：水、缓冲液、稀释

12、的盐溶液和酸碱溶液。1）按到第一档，垂直进入液面 35 毫米.2）缓慢松开控制按钮,否则液体进入吸头过速会导致液体倒吸人移液器内部吸人 体积减少。3）打出液体时贴壁并有一定角度，先按到第一档，稍微停顿Is 后，待剩余液体 聚集后，再按到第二档将剩余液体全部压出.二、黏稠或易挥发液体的移取 在移取黏稠或易挥发的液体时,很容易导致体积误差较大。报请老师批准操作准备物品清洗干燥打包灭菌合理放置实验试剂准备书面准备明确列出使用物品名称数量报请老师批准操作准备选择合适的物品存放地点使用前集中放置需要配制的试剂根据有无灭菌需要提前配好需要无菌配制的试细胞冻存复苏预约每周定时开放液氮罐由负责同学在群里通知细

13、胞检测预约填写申请单向主管老师申请细胞房环境检査清洁消毒操作前后有无清洁台面地面行紫外线杀菌分钟仪器设备运行是否正常有无灯光闪烁报警或标志警示有无喷手台面物品放置正中酒精灯左侧吸管及其他耗材盒于右侧试管架大银于酒精棉球瓶打火机移液器左上方试剂瓶右上方废液缸实验操作基本操作换液传代冻存接板复苏细胞计数细胞观察垃圾处理培养基缓冲液等使用过的无害废液用为了提高移液准确性,建议采取以下方法：1）移液前先用液体预湿吸头内部，即反复吸打液体几次使吸头预湿，吸液或排出 液体时最好多停留几秒。尤其对于移取体积大的液体如 1000-1）,建议将吸头预 湿后再移取。2）采用反相移液法：吸液时按到第二档，慢慢松开控

14、制按钮，打液时按到第二档,部分液体残留在吸头内。微量移液器使用 使用方法同移液器的使用。细胞计数板使用 分 3 点:将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置 3min,注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。计数板四大格细胞总数，压线细胞只计算左侧和上方的。然后按照公式计算：细 胞数/m 匸四大格细胞总数/4 叙 0 高压灭菌锅使用 分为 6 点：1.首先将内层灭菌简取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相 平为宜。2放回灭菌简，并装入待灭菌物品。3.加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌筒的排气槽内。再

15、以两两对称的方 式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。4用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待 冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。报请老师批准操作准备物品清洗干燥打包灭菌合理放置实验试剂准备书面准备明确列出使用物品名称数量报请老师批准操作准备选择合适的物品存放地点使用前集中放置需要配制的试剂根据有无灭菌需要提前配好需要无菌配制的试细胞冻存复苏预约每周定时开放液氮罐由负责同学在群里通知细胞检测预约填写申请单向主管老师申请细胞房环境检査清洁消毒操作前后有无清洁台面地面

16、行紫外线杀菌分钟仪器设备运行是否正常有无灯光闪烁报警或标志警示有无喷手台面物品放置正中酒精灯左侧吸管及其他耗材盒于右侧试管架大银于酒精棉球瓶打火机移液器左上方试剂瓶右上方废液缸实验操作基本操作换液传代冻存接板复苏细胞计数细胞观察垃圾处理培养基缓冲液等使用过的无害废液用5灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，压力 降为 0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物体.6将取出的灭菌培养基放入 37C 恒温培养箱内培养 24 小时，经检验无杂菌生 长，即可待用。酶标仪使用 冰箱使用 冰箱中试剂药品分类放置，关闭冰箱时检査是否关好。液氮罐便用 使用前，检査容器内部是否清沽

17、干燥，充液氮前要用少量液氮预冷。不能在容眾 盖上放置物体和密封颈口，放进或取出冷冻物品时，要尽量使罐口打开时间短,以减少液氮消耗，也不要把提桶完全提出来。严防冲击和碰 SL 严谨用硬物清除 颈管内的冻霜，以免损伤颈管.超低温冰箱使用 1.F制冷温度设置为60 度，过滤网每个月必须清洗一次。2存取样品时门开得不要过大，存取时间尽量要短。3.注意经常要存取的样品放在上面两层，需要长期保存不经常存取的样品放在 下面两层，保证开门时冷气不过度损耗。4定期除霜。报请老师批准操作准备物品清洗干燥打包灭菌合理放置实验试剂准备书面准备明确列出使用物品名称数量报请老师批准操作准备选择合适的物品存放地点使用前集中

18、放置需要配制的试剂根据有无灭菌需要提前配好需要无菌配制的试细胞冻存复苏预约每周定时开放液氮罐由负责同学在群里通知细胞检测预约填写申请单向主管老师申请细胞房环境检査清洁消毒操作前后有无清洁台面地面行紫外线杀菌分钟仪器设备运行是否正常有无灯光闪烁报警或标志警示有无喷手台面物品放置正中酒精灯左侧吸管及其他耗材盒于右侧试管架大银于酒精棉球瓶打火机移液器左上方试剂瓶右上方废液缸实验操作基本操作换液传代冻存接板复苏细胞计数细胞观察垃圾处理培养基缓冲液等使用过的无害废液用细胞实验基本液体配制 培养基配制 PBS配制 成分配比为：1%（w/v）Naa0.025%Ka,0.144%Na2HP4,0.025%KH

19、2P4.调數 pH 为 7.2,在高压蕉汽灭菌锅中 121 C（15psi）处理 15 分钟后室温下保存 冻存液配制 90%血清、10%DMSO 戊二醛固定液配制 2.5%戊二醛（用 PBS 0BS）多聚甲醛固定液配制 2%多聚甲醛（用PBS配置）新洁尔灭洗手液配制 0 1%新洁尔灭（融水配制）稀盐酸配制 浓硫酸配制（此文档部分内容來源于网络，如有侵权请告知删除，文档可自行编辑修改内容,供参考，感谢您的配合和支持）报请老师批准操作准备物品清洗干燥打包灭菌合理放置实验试剂准备书面准备明确列出使用物品名称数量报请老师批准操作准备选择合适的物品存放地点使用前集中放置需要配制的试剂根据有无灭菌需要提前配好需要无菌配制的试细胞冻存复苏预约每周定时开放液氮罐由负责同学在群里通知细胞检测预约填写申请单向主管老师申请细胞房环境检査清洁消毒操作前后有无清洁台面地面行紫外线杀菌分钟仪器设备运行是否正常有无灯光闪烁报警或标志警示有无喷手台面物品放置正中酒精灯左侧吸管及其他耗材盒于右侧试管架大银于酒精棉球瓶打火机移液器左上方试剂瓶右上方废液缸实验操作基本操作换液传代冻存接板复苏细胞计数细胞观察垃圾处理培养基缓冲液等使用过的无害废液用