动物肝脏DNA的制备DNA的Tm值测定医学心理学医学研究方法_医学心理学-医学研究方法.pdf

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1、动物肝脏 DNA 的制备、DNA 的 Tm 值测定 动物肝脏 DNA 的制备 一、目的 1了解肝脏组织制备核酸 DNA 的方法；2.弄清 DNA 制备的过程中，清除 RNA 和蛋白质的机理。二、原理 1.根据核糖蛋白（RNP）和脱氧核糖蛋白（DNP）在一定浓度电解溶液中 溶解度不同，将二者分离。然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，并释放 出 DNA，再利用核酸不溶于乙醇的性质将其析出，达到分离提纯 DNA 的目的。2.在 0.14mol/L 的氯化钠溶液中，RNP 溶解度大，而 DNP 的溶解度却很 小；相反，在 1 mol/L 的氯化钠溶液中，DNP 的溶解度却很大，从而使 二者获得了分离。核蛋

2、白分离后可用蛋白质变性沉淀剂（氯仿、异戊醇、十二烷基硫酸钠和热酚）去除蛋白质，释放出的 DNA 用乙醇沉淀，析出 核酸。3.动物肝脏中含有核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶，因此在提取核酸时，尽 量在低温下操作，并要加柠檬酸钠作为金属离子的络合剂。防止 Mg 2+、Fe 2+及 Co 2+等激活剂，以便降低核酸酶对核酸的水解作用。三、操作 1 抽提 取新鲜鸡肝 2g，用 SC 液洗去血液，低温剪碎（在预冷的研钵中操作），加入 4ml SC 缓冲液,用玻璃匀浆器匀浆，然后离心（4000r/min）10min,倾出上层 机理二原理根据核糖蛋白和脱氧核糖蛋白在一定浓度电解溶液中溶解度不同将二者分离然后用蛋白

3、质变性沉淀剂去除蛋白并释放出再利用核酸不溶于乙醇的性质将其析出达到分离提纯的目的在的氯化钠溶液中溶解度大而的溶解度却醇十二烷基硫酸钠和热酚去除蛋白质释放出的用乙醇沉淀析出核酸动物肝脏中含有核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶因此在提取核酸时尽量在低温下操作并要加柠檬酸钠作为金离子的络合剂防止及等激活剂以便降低核酸酶对核酸的水解出上层层溶液向下层溶液中再加入缓冲液震荡混匀后再离心分钟倒掉上层溶液分离将下层沉淀用液冲洗并转入三角锥形瓶中混匀后加入溶液混匀再加入氯仿异戊醇边振动边加入晶体充分混匀后振荡然后转入到离心管于离心小心用吸RNP 层溶液。向下层溶液中再加入 4ml SC 缓冲液，震荡混匀后再 4000

4、r/min 离心 10 分钟。倒掉上层溶液。2 分离 将下层沉淀用 10ml SC 液冲洗并转入 50ml 三角锥形瓶中混匀后，加入 2ml 5%SDS 溶液，混匀，再加入 7.5ml 氯仿/异戊醇，边振动边加入 1.15gNaCL 晶体，充分混匀后振荡 30min，然后转入到 50ml 离心管，于 4000r/min 离心 20min。小心用吸管由上至下吸取上层 DNA 层溶液于干净小烧杯中。3提纯 加入 2 倍 DNA 溶液体积的 95%的乙醇，边加入边用玻璃棒沿同个方向缓慢 搅动，当成纤维状 DNA全部绕在玻璃棒取出，再用 95%乙醇2ml 冲洗干净，再 用 5%氨水将其溶解。并用蒸馏水

5、定容到 5ml。即为样品溶液。待测样品编号，放置在冰箱中 四、思考题 1、在核酸提取溶液中，当加入一定浓度 SDS、异戊醇和氯仿后，得到三层溶 液分别含有哪些主要物质，为什么？水相 蛋白质层 氯仿层 机理二原理根据核糖蛋白和脱氧核糖蛋白在一定浓度电解溶液中溶解度不同将二者分离然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白并释放出再利用核酸不溶于乙醇的性质将其析出达到分离提纯的目的在的氯化钠溶液中溶解度大而的溶解度却醇十二烷基硫酸钠和热酚去除蛋白质释放出的用乙醇沉淀析出核酸动物肝脏中含有核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶因此在提取核酸时尽量在低温下操作并要加柠檬酸钠作为金离子的络合剂防止及等激活剂以便降低核酸酶对核酸的

6、水解出上层层溶液向下层溶液中再加入缓冲液震荡混匀后再离心分钟倒掉上层溶液分离将下层沉淀用液冲洗并转入三角锥形瓶中混匀后加入溶液混匀再加入氯仿异戊醇边振动边加入晶体充分混匀后振荡然后转入到离心管于离心小心用吸2、SC 缓冲液的组成分是什么，该溶液在制备核酸时有何作用，能否用磷酸 盐缓冲液代替？3、如何用紫外法判断 DNA 样品的纯度？酵母 RNA 的提取 一、目的 1了解用浓盐法提纯 RNA 的基本原理和方法。二、原理 1.酵母中 RNA 含量可占干重 3-10%，DNA 含量很少。因此采用酵母作为 制备 RNA 的原材料。2.适宜于 RNA 制备的方法有稀碱法、浓盐法和苯酚法。前者是用 1%N

7、aOH 溶液，将细胞壁溶解，用酸中和。本实验采用浓盐法提取 RNA，其机理 是用 10%NaCL 溶液改变细胞膜的通透性，使核酸从细胞内释放出来，然后升高温度使蛋白质变性，将蛋白质与核酸分离，除去菌体，再调至 pH 2.5（RNA 的等电点），使 RNA 沉淀出来。三、操作 1、提取 称取干酵母粉 2g 于 50mL 三角瓶内。加 10%NaCl 溶液 10mL，搅拌均匀，然后于沸水浴中提取半小时。2.分离 将上述提取液取出，用自来水冷却，分装在离心管内，以 3500r/min 离心 10min，使提取液与菌体残渣等分离。机理二原理根据核糖蛋白和脱氧核糖蛋白在一定浓度电解溶液中溶解度不同将二者

8、分离然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白并释放出再利用核酸不溶于乙醇的性质将其析出达到分离提纯的目的在的氯化钠溶液中溶解度大而的溶解度却醇十二烷基硫酸钠和热酚去除蛋白质释放出的用乙醇沉淀析出核酸动物肝脏中含有核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶因此在提取核酸时尽量在低温下操作并要加柠檬酸钠作为金离子的络合剂防止及等激活剂以便降低核酸酶对核酸的水解出上层层溶液向下层溶液中再加入缓冲液震荡混匀后再离心分钟倒掉上层溶液分离将下层沉淀用液冲洗并转入三角锥形瓶中混匀后加入溶液混匀再加入氯仿异戊醇边振动边加入晶体充分混匀后振荡然后转入到离心管于离心小心用吸3.沉淀 RNA 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

9、11 12 将离心得到的上清液倾于 50mL 烧杯内，并置于有冰块的 250mL 烧杯中冷 却。待溶液冷至 10 以下时，在搅拌下小心地加入等体积的酸性乙醇，随着酸 性乙醇的加入，溶液的 pH 逐步下降，溶液中白色沉淀也逐渐增加，当 pH=2.5（RNA 等电点）时沉淀量最多（注意严格控制 pH 值），继续于冰浴中静置 10min，使沉淀充分，颗粒变大。3.冼涤、溶解 将 RNA 沉淀液离心（3000r/min）5min，去上清，收集沉淀，加入 3mL 0.5mol/L 碳酸氢钠溶液溶解沉淀（用玻捧缓慢搅拌沉淀，以助溶解，如有不溶 物则为杂质，再离心去除之）。得到 RNA 制品溶液，供测定之用

10、。如需要进一 步纯化时，可在冷却下，加入两倍冷乙醇进行沉淀。将沉淀物置 10ml 量筒里，用少量蒸馏水将沉淀物调成糊状，经充分膨胀后，再加少量蒸馏水稀释，然后用 6%氨水调 pH 至 7.0，并暂且定容到 5ml，测定稀 释 50 倍后的 A260 应控制在 0.6-1.0 之间，根据该测定值再次调节待测样品的 体积，作为待测样品。待测样品编号，放置在冰箱中 机理二原理根据核糖蛋白和脱氧核糖蛋白在一定浓度电解溶液中溶解度不同将二者分离然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白并释放出再利用核酸不溶于乙醇的性质将其析出达到分离提纯的目的在的氯化钠溶液中溶解度大而的溶解度却醇十二烷基硫酸钠和热酚去除蛋白质释放

11、出的用乙醇沉淀析出核酸动物肝脏中含有核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶因此在提取核酸时尽量在低温下操作并要加柠檬酸钠作为金离子的络合剂防止及等激活剂以便降低核酸酶对核酸的水解出上层层溶液向下层溶液中再加入缓冲液震荡混匀后再离心分钟倒掉上层溶液分离将下层沉淀用液冲洗并转入三角锥形瓶中混匀后加入溶液混匀再加入氯仿异戊醇边振动边加入晶体充分混匀后振荡然后转入到离心管于离心小心用吸温度（）37 50 60 70 75 80 85 90 95 100 100-50 100-37 保温 15min A260nm 0.487 0.5 0.504 0.51 0.514 0.544 0.578 0.596 0.612

12、0.571 0.553 0.492 At/A 260nm 1 1.027 1.035 1.047 1.055 1.117 1.187 1.224 1.257 1.172 数据处理：1.4)1.3 1.2 1.1 (0 1 062 0.9 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 温度()管号 1 2 3 4 0.1%淀粉溶液（ml）1.5 1.5 1.5 1.5 稀释唾液（ml）0.5 0.5 0.5 0.5 1%硫酸铜溶液（ml）0.5 1%氯化钠溶液（ml）0.5 1%硫酸钠溶液（ml）0.5 蒸馏水（ml）0.5 室温保温 10m

13、in 碘化钾-碘溶液（ml）2 2 2 2 现象 机理二原理根据核糖蛋白和脱氧核糖蛋白在一定浓度电解溶液中溶解度不同将二者分离然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白并释放出再利用核酸不溶于乙醇的性质将其析出达到分离提纯的目的在的氯化钠溶液中溶解度大而的溶解度却醇十二烷基硫酸钠和热酚去除蛋白质释放出的用乙醇沉淀析出核酸动物肝脏中含有核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶因此在提取核酸时尽量在低温下操作并要加柠檬酸钠作为金离子的络合剂防止及等激活剂以便降低核酸酶对核酸的水解出上层层溶液向下层溶液中再加入缓冲液震荡混匀后再离心分钟倒掉上层溶液分离将下层沉淀用液冲洗并转入三角锥形瓶中混匀后加入溶液混匀再加入氯仿异戊醇边振动边加入晶体充分混匀后振荡然后转入到离心管于离心小心用吸