基因工程总结高等教育生物学_高等教育-生物学.pdf

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1、第一章绪论 1 基因工程的含义：按照人们的意愿，进行严密的设计，通过体外 DNA 重组和转基因等技术，有目的 地改造生物种性，使现有的物种在较短时间内趋于完善，创造出更符合人们需求 的新的生物类型。2、基因工程的优点：打破物种间基因交流的隔离界限；克服常规育种的周期长，效率低的缺点，定向改造生物性状；可按照人的意愿去改造物种。3、基因工程理论依据：不同基因具有相同的物质基础；基因是可分割的；基因是可以转移的；多肽与基因之间存在对应关系；遗传密码是通用的；基因可以通过复制传递 给下一代。注：基因工程及其应用的图解看看 第二章 DNA 重组的相关技术及原理 1、重组 DNA 技术的原理 重组 DN

2、A 技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然 后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物 或新性状的 DNA体外操作程序 2、碱性 SDS 法提取质粒 DNA 原理：强碱使所有 DNA 变性沉淀，而 pH 为中性时，质粒 DNA 复性快，形成闭合 环状从沉淀物中分离。3、提取 DNA 总的原则 保证核酸一级结构的完整性；其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；其他核酸分子，如 RNA 也应尽量去除。4、核酸鉴定 浓度鉴定纯度鉴定完整性鉴定 5、限制性核酸内切酶

3、：是一类能够识别双链 DNA 分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp)，并使每条链的一个磷酸二酯键断幵的内脱氧核糖核酸酶。6、限制性内切酶的命名 用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成 3 个字母的略语表示寄主菌的 物种名。大肠杆菌(Escherichia coli)Eco 流感嗜血菌(Haemophilus in flue nzae)Hin 用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如 Ecok,ECOR(现在都写成平行，如 EccR)。如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制性内切酶，用罗马字母表示。如 EcoRI，EccRV)属名 种名 株名 使现有的物种在较短时间内趋于完善创造出更符合人们需

4、求的新的生物类型基因工程的优点打破物种间基因交流的隔离界限克服常规育种的周期长效率低的缺点定向改造生物性状可按照人的意愿去改造物种基因工程理论依据不同基通过复制递给下一代注基因工程及其应用的图解看看第二章重组的相关技术及原理重组技术的原理重组技术是指将一种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使之按照人们的意愿稳定遗并表达出沉淀物中分离提取总的原则保证核酸一级结构的完整性其他生物大分子如蛋白质多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子其他核酸分子如也应尽量去除核酸鉴定Haemophilus influenzae

5、 D 嗜血流感杆菌 D 株 Hind III EcoRI Escherichia coli RI Hindm Haemophilus influensae d 川 Sad(II)Streptomyces achromagenes I(n)7、限制性核酸内切酶的作用机制 以环状和线形的双链 DNA 为底物，在适合的反应条件下，识别一定的核苷酸序列，使两条核糖链上特定位置的磷酸二酯键断幵，产生具有 3-0H 基团和 5-P 基团的片段。8、同裂酶：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶 完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。如Hi nd m和Hsul。不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。如X

6、ma和Sma。9、同尾酶:识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BarHI、Bgl n、BclI、Xhon 等 10、酶活性单位(U):在最适反应条件下，一个 DNA 分子上含有一个酶切位点，60 min 内切割 1?g 入 DNA 所需的酶量称为一个单位。11、星号(*)活性：如果改变反应条件就会影响酶的识别位点专一性和切割效 率，称为星号(*)活性。12、基因工程的其他酶(1)DNA 连接酶:DNA 连接酶能催化双链 DNA 切口处的 5-磷酸和 3-羟基生 成磷酸二酯键。；使现有的物种在较短时间内趋于完善创造出更符合人们需求的新的生物类型基因工程的优点打破物种间基因交流的隔离界限克服

7、常规育种的周期长效率低的缺点定向改造生物性状可按照人的意愿去改造物种基因工程理论依据不同基通过复制递给下一代注基因工程及其应用的图解看看第二章重组的相关技术及原理重组技术的原理重组技术是指将一种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使之按照人们的意愿稳定遗并表达出沉淀物中分离提取总的原则保证核酸一级结构的完整性其他生物大分子如蛋白质多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子其他核酸分子如也应尽量去除核酸鉴定(2)DNA 聚合酶(Klenow fragment)性质5?3 聚合酶活性。3?5 外切酶活性。(失去了

8、 5?3 外切酶活 性)用途 3端补平 DNA 的 3 末端标记，在 3 隐蔽端加上标记的 dNTP cDNA 第二链的合成双脱氧末端终止法测定 DNA 序列（3）核酸酶 S1 催化反应类型:ss-DNA；ss-RNA；双螺旋变性区 13、聚合酶链式反应 PCR:PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大 量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。加入 4 种物质：（1）作为模板的 DNA 序列；（2）与被分离的目的基因两条链 各自 5 端序列相互补的 DNA 引物（20 个左 右碱基的短 DNA 单链）；（3）TaqDNA 聚合酶；（4）dNTP（dATP,dTTP,dGTP 和 dCTP。1

9、4、PCR 技术的原理（1）DNA 模板变性（2）DNA 模板与引物复性（3）DNA 链的延伸 15、PCR 的过程 第一步 预变性（pre-denature）90-95 C 下 5 分钟，模板 DNA 双链完全 变性成单链。使现有的物种在较短时间内趋于完善创造出更符合人们需求的新的生物类型基因工程的优点打破物种间基因交流的隔离界限克服常规育种的周期长效率低的缺点定向改造生物性状可按照人的意愿去改造物种基因工程理论依据不同基通过复制递给下一代注基因工程及其应用的图解看看第二章重组的相关技术及原理重组技术的原理重组技术是指将一种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使

10、之按照人们的意愿稳定遗并表达出沉淀物中分离提取总的原则保证核酸一级结构的完整性其他生物大分子如蛋白质多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子其他核酸分子如也应尽量去除核酸鉴定第五步 第二步 变性（denature）双链完全变性成单链 第三步 复性（anneal）37-60 C 下 1 分钟，引物优先与模板复性。引 物的浓度高引物的链短。第四步 延伸（extend）72 C 下 1-2分钟，TaqDNA 聚合酶在引物的 3 端 上加上核苷酸。变性进入循环重复 94 C 下 1 分钟，新合成的 DNA 双链又变性成单 链模板。16、PCR

11、扩增特异性 DNA 片段的主要条件(1)TaqDNA 聚合酶(2)引物(primer)(4)模板(template)(5)dNTPs(6)Mg 2+的浓度 17、PCR 的特点(1)特异性强(2)敏感性高(3)快速(4)简便(5)可以扩增 mRNA 18、电泳的基本原理 DNA 在中性或偏碱性的缓冲液中带负电，在电泳过程中处于凝胶靠负极端的 DNA 通过凝胶分子筛向正极端移动。19、电泳迁移率：与 DNA 分子的构型和大小有关 与 DNA 分子中的碱基组成和顺序无关 DNA 分子的构象(型)：1型：超螺旋环状 U型：带切口环状 川型：线 状 相同分子量的 DNA:闭合环状卷曲超螺旋迁移最快；线

12、性分子次之；伸展开环 状最慢 使现有的物种在较短时间内趋于完善创造出更符合人们需求的新的生物类型基因工程的优点打破物种间基因交流的隔离界限克服常规育种的周期长效率低的缺点定向改造生物性状可按照人的意愿去改造物种基因工程理论依据不同基通过复制递给下一代注基因工程及其应用的图解看看第二章重组的相关技术及原理重组技术的原理重组技术是指将一种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使之按照人们的意愿稳定遗并表达出沉淀物中分离提取总的原则保证核酸一级结构的完整性其他生物大分子如蛋白质多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离

13、子其他核酸分子如也应尽量去除核酸鉴定20、影响连接反应的因素(1)插入片段与载体的浓度比例(1020 倍 增加插入片段与载体的接触机 会，减少载体自我连接的现象。)(2)反应温度(一般 1416C)(3)反应缓冲液 第三章基因的克隆载体 1、载体：在基因工程操作中，携带目的基因、实现目的基因进入受体细胞，并 在其中得以无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些 DNA 分子。2、按功能划分：克隆载体(cloning vector):使目的片段能在细菌细胞中复制的载体。表达载体(expression vector):使目的基因能在细菌细胞中表达为 RNA 或蛋 白质的载体。3、基因克隆载体的必备条

14、件：多克隆位点；能自我复制，有一个复制起点；选择性标记；安全。4、标记基因的作用：指示外源 DNA 分子(载体或重组分子)是否进入宿主细 胞；指示外源 DNA 分子是否插入载体分子形成了重组子。这种指示也可以是选 择性的，也可以是非选择性的，绝大多数为后者。5、质粒：独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状 DNA 分子。6、质粒的空间构型：共价闭合环状 DNA(cccDNA);幵环 DNA(ocDNA):线形 DNA(IDNA)7、质粒空间构型与电泳速率:scDNA 最快、L DNA 次之、ocDNA 最慢。8、质粒的不亲和性(不相容性)：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不 使现有的

15、物种在较短时间内趋于完善创造出更符合人们需求的新的生物类型基因工程的优点打破物种间基因交流的隔离界限克服常规育种的周期长效率低的缺点定向改造生物性状可按照人的意愿去改造物种基因工程理论依据不同基通过复制递给下一代注基因工程及其应用的图解看看第二章重组的相关技术及原理重组技术的原理重组技术是指将一种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使之按照人们的意愿稳定遗并表达出沉淀物中分离提取总的原则保证核酸一级结构的完整性其他生物大分子如蛋白质多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子其他核酸分子如也应尽量去除核酸鉴定能

16、同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不亲和性或不相容性，这两种质 粒称为不亲和性质粒，组成不亲和性群；而彼此能够共存于一个细胞中称为亲和 性质粒，亲和质粒则属于不同的不亲和群。9、天然质粒的局限性:分子量大，拷贝数低；筛选标记不理想；单一酶切位点少或无 10、质粒载体的构建策略：提高质粒载体的拷贝数；引入多克隆位点 MCS;引入抗性标记基因；克 隆载体 DNA 分子应尽可能小；在克隆载体中组装“元件”。10、筛选重组子的示意图重点 11、?互补：蓝白斑选择原理：X-gal:?-半乳糖苷酶的显色反应；lac Z 的？互补。12、穿梭质粒载体：人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在

17、两 种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。13、Ti质粒载体：存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤 形成，又称肿瘤诱导质粒。14、Ti质粒作为载体的可能性：能够自发地整合到植物的染色体上；能转化多种植物；强启动子一一 T-DNA 的 opine 合成酶基因上游有一个强启动子，能启动外源基因的表达。15、天然 Ti 质粒作载体的缺点：分子量太大（200kb）;限制性酶切位点太多。被转化的植物细胞成为肿瘤，不能再分化。在大肠杆菌中不能复制。16、Ti质粒的改造：使现有的物种在较短时间内趋于完善创造出更符合人们需求的新的生物类型基因工程的优点打破物种间基因交流的隔离界限克服常规育种

18、的周期长效率低的缺点定向改造生物性状可按照人的意愿去改造物种基因工程理论依据不同基通过复制递给下一代注基因工程及其应用的图解看看第二章重组的相关技术及原理重组技术的原理重组技术是指将一种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使之按照人们的意愿稳定遗并表达出沉淀物中分离提取总的原则保证核酸一级结构的完整性其他生物大分子如蛋白质多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子其他核酸分子如也应尽量去除核酸鉴定保留 T-DNA的转移功能部分（vir 基因，左右边界）。减少限制性酶切位点，引入单一插入位点。取消 T-DNA的

19、致瘤基因，使被转化的植物细胞不再成为肿 瘤，能正常分化。冠瘿碱合成对于植物无意义。应剔除掉。加入大肠杆菌的 ori 和选择标记。加上真核生物的转录信号和结束信号以及添加 polyA 的信号使现有的物种在较短时间内趋于完善创造出更符合人们需求的新的生物类型基因工程的优点打破物种间基因交流的隔离界限克服常规育种的周期长效率低的缺点定向改造生物性状可按照人的意愿去改造物种基因工程理论依据不同基通过复制递给下一代注基因工程及其应用的图解看看第二章重组的相关技术及原理重组技术的原理重组技术是指将一种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使之按照人们的意愿稳定遗并表达出沉淀物中

20、分离提取总的原则保证核酸一级结构的完整性其他生物大分子如蛋白质多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子其他核酸分子如也应尽量去除核酸鉴定序列。17、Ti 载体的类型：共整合载体一一需要同源重组才能插入外源基因；双 元载体一既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个穿梭载体。18、cos 位点：？DNA 两端各有 12bp 的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为 cos 位点。19、天然？噬菌体作为载体的局限性：？噬菌体的非必需区太长；非必需区段上常用的单一限制酶切点少；选择 标记基因少；载体的安全性 20、？噬菌体载体的构建：构建策略

21、：删除？噬菌体的非必需区，在这个非必需区内制造限制酶切点，删 除？DNA 必需区段上常用的限制酶切点；在非必需区引进选择标记基因。建 立？DNA 重组分子体外包装系统 21、cosmid 载体（粘粒）：一类由人工构建的含有入噬菌体 DNA 勺 cos 序列和质 粒复制子的特殊类型的质粒载体，cos site carry ing vectors。22、酵母人工染色体：YAC 的特点：（1）只能在酵母细胞中扩增。（2）克隆容量大，为 230kb-1700kb。（3）构建原理，按染色体结构构建。YAC 的组成结构：（1）着丝粒区（Cen）;（2）端粒（Tel）；（3）复制起点（Ori）；（4）克隆位

22、点；（5）在酵母中的标记基因；（6）在细菌中操作；第四章目的基因的制备 1、基因组文库：将某种生物整个基因组 DNA 切割成大小合适的片段，并将所有使现有的物种在较短时间内趋于完善创造出更符合人们需求的新的生物类型基因工程的优点打破物种间基因交流的隔离界限克服常规育种的周期长效率低的缺点定向改造生物性状可按照人的意愿去改造物种基因工程理论依据不同基通过复制递给下一代注基因工程及其应用的图解看看第二章重组的相关技术及原理重组技术的原理重组技术是指将一种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使之按照人们的意愿稳定遗并表达出沉淀物中分离提取总的原则保证核酸一级结构的完整性

23、其他生物大分子如蛋白质多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子其他核酸分子如也应尽量去除核酸鉴定讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，也称为基因文库 2、基因组文库构建的一般步骤：基因组 DNA 片段的制备；载体的准备一一相应的酶切，脱磷酸化等处理阻止 载体自连；载体与基因组 DNA 片段的连接-粘性末端直接连接；人工接头法；同聚物 加尾；转化细胞和克隆选择。3、cDNA 文库：利用某种生物的总 mRNA 合成 cDNA 再将这些 cDNA 与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称 cDNA 文库(cDNAibrary)，也称

24、基因文库(gene library)。4、cDNA 文库的特点：以 mRNA 为材料，是 RNA 病毒进行基因克隆的唯一途径。不含内含子序列，可以在细菌中直接表达。克隆数比 DNA 文库小的多，容易筛选。常来自结构基因，包含了所有编码蛋白质的基因，筛选的假阳性率低。结构基因的表达具有器官、代谢阶段特异性，由不同器官提取的 mRNA 所组建 的 cDNA 文库也就不同。在同一个 cDNA 文库中，不同类型的 cDNA 分子的数目是大不相同的，表现不均 匀性。5、不对称 PCR(asymmetric PCR)目的：扩增产生特异长度的单链 DNA 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非

25、限制性引物，其最佳 比例一般是 50:1 或 100:1,关键是限制性引物的绝对量。使现有的物种在较短时间内趋于完善创造出更符合人们需求的新的生物类型基因工程的优点打破物种间基因交流的隔离界限克服常规育种的周期长效率低的缺点定向改造生物性状可按照人的意愿去改造物种基因工程理论依据不同基通过复制递给下一代注基因工程及其应用的图解看看第二章重组的相关技术及原理重组技术的原理重组技术是指将一种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使之按照人们的意愿稳定遗并表达出沉淀物中分离提取总的原则保证核酸一级结构的完整性其他生物大分子如蛋白质多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度核酸样

26、品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子其他核酸分子如也应尽量去除核酸鉴定6、差别杂交：需要两种不同的细胞群体(目的基因正常表达、目的基因不表达)，分别制备两种不同 mRNA 提取物，以两种总 mRNA 探针平行杂交，对有表达目的基 因的总 mRNA 反转录构建的 cDNA 文库进行筛选。7、差别杂交的局限性：杂交灵敏度低，对于低丰度的 mRNAt 为明显；工作量大，需大量的杂交滤 膜和鉴定大量的噬菌斑；重复性差，两套平行滤膜之间的 DNA 保有量有差别，导致杂交信号不一致。8、消减杂交：原理：通过 DNA 复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建消减文库的方式 来分离目的基

27、因。有 mRNA 肖减杂交和基因组消减杂交。前者适合分析两样本中 差异表达的基因，后者适合克隆两样本特异性存在的基因。9、mRNAg 异显示 PCR(DD RT-PCR:用 3 -端锚定引物和反转录酶合成 cDNA 的第一链；用 3 -端锚定引物和 5-端 10-mer 随机引物组成引物对，以反转 录第一链为模板进行 PCR 扩增(mRNA differe ntial display RT-PCR,DDRT-PCR，在标准的序列胶中电泳 23 小时，可显示出 50100 条长度在 1005000 bp 之间的 DNA 条带。10、染色体步移(chromosome walking)：首先以已知基

28、因或分子标记为探针从 基因组文库中筛选与其有共同序列的克隆，再以该克隆为探针从文库中筛选与其 有部分重叠序列而且更靠近目的基因的新克隆，同理，再以新克隆为探针依次筛 选新克隆，直至所需克隆的目的基因。使现有的物种在较短时间内趋于完善创造出更符合人们需求的新的生物类型基因工程的优点打破物种间基因交流的隔离界限克服常规育种的周期长效率低的缺点定向改造生物性状可按照人的意愿去改造物种基因工程理论依据不同基通过复制递给下一代注基因工程及其应用的图解看看第二章重组的相关技术及原理重组技术的原理重组技术是指将一种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使之按照人们的意愿稳定遗并表

29、达出沉淀物中分离提取总的原则保证核酸一级结构的完整性其他生物大分子如蛋白质多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子其他核酸分子如也应尽量去除核酸鉴定11、基因芯片技术(gene chip)特点：高度并行性：提高实验进程、利于显示图谱的快速对照和阅读；多样性：可 进行样品的多方面分析，提高精确性，减少误差；微型化：减少试剂用量和反 应液体积，提高样品浓度和反应速率；自动化：降低成本，保证质量。第五章目的基因导入受体细胞 1、DNA 体外连接应注意的事项：插入片段与载体的酶切位点互补 DNA 插入的方向正确 插入基因的幵放阅读框（ORF 正

30、确（1）DNA 定位插入载体（2）起始 密码 防止载体自身环化连接（1）提高插入片段的用量（2）用碱性磷酸酶处 理载体 2、大肠杆菌受体细胞的选择 重组缺陷型：避免与受体基因组进行同源重组，便于重组 DNA 独立存在 限制缺陷型：避免修饰和降解，使重组 DNA 稳定存在易于转化或转导：提高细 胞的通透性，较高的转化率 遗传互补型：有明显的选择性差异，有利于重组体筛选具有较好的翻译后加 工，有利于真核基因表达 感染缺陷型：防止感染，安全性高，无致病基因 3、感受态大肠杆菌的制备 使现有的物种在较短时间内趋于完善创造出更符合人们需求的新的生物类型基因工程的优点打破物种间基因交流的隔离界限克服常规育

31、种的周期长效率低的缺点定向改造生物性状可按照人的意愿去改造物种基因工程理论依据不同基通过复制递给下一代注基因工程及其应用的图解看看第二章重组的相关技术及原理重组技术的原理重组技术是指将一种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使之按照人们的意愿稳定遗并表达出沉淀物中分离提取总的原则保证核酸一级结构的完整性其他生物大分子如蛋白质多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子其他核酸分子如也应尽量去除核酸鉴定制备原理：当细菌处于 0C、二价阳离子（如 CaT、Mg+等）低渗溶液中时，细 菌细胞膨胀成球形，处于感受态；此

32、时转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，重组 DNA 在 42 C短时间热冲击后吸附在细胞表 面而利于进入，在丰富培养基中生长数小时后，球状细胞恢复原状并繁殖。4、外源 DNA 导入细菌的几种方法（1）转化（2）转染（3）转导 5、重组质粒导入受体的转化方法（1）热激法或热休克转化法（2）电转化法（3）平板培养细菌 6、重组 DNA 导入真核细胞（1）酵母细胞 利用原生质体进行转化 利用 Li+盐进行转化（2）植物细胞 农杆菌介导法 电击法 基因枪法（3）哺乳动物细胞 磷酸钙沉淀法 脂质体（lipofectin）载体法 显 微注射法 DEAE-葡聚糖转染

33、法 7、重组体克隆的筛选和鉴定 遗传表型直接筛选法 DNA 电泳检测法 核酸杂交检测法 免疫化学检测法 转译筛选法 真核生物常用的重组基因选择方法 DNA 序列测 疋 8、根据载体的抗药性标记进行筛选 PBR322 抗菌素标记选择（图已省-打出来黑的）四环素抗性基因 使现有的物种在较短时间内趋于完善创造出更符合人们需求的新的生物类型基因工程的优点打破物种间基因交流的隔离界限克服常规育种的周期长效率低的缺点定向改造生物性状可按照人的意愿去改造物种基因工程理论依据不同基通过复制递给下一代注基因工程及其应用的图解看看第二章重组的相关技术及原理重组技术的原理重组技术是指将一种生物体供体的基因与载体在体

34、外进行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使之按照人们的意愿稳定遗并表达出沉淀物中分离提取总的原则保证核酸一级结构的完整性其他生物大分子如蛋白质多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子其他核酸分子如也应尽量去除核酸鉴定 氨苄青霉素抗性基因?-半乳糖苷酶显色反应选择法 9、核酸杂交检测法 Souther n hybridizatio n 原理 根据毛细血管作用的原理，使在凝胶电泳中分离的 DNA 片段转移并结合到适当的 滤膜上，然后通过同已标记的单链 DNA 或 RNA 探针进行杂交，以检测被转移 DNA 片段，成为 DNA 印迹杂交技术。

35、也称 Southern杂交 Norther n hybridization _ 原理 指根据毛细管作用的原理，使在凝胶电泳中已分离的 RNA 专移并结合到适当的滤 膜上，然后通过同已标记的单链 DNA 或 RNA 探针进行杂交，以检测被转移 RNA 片 段，称为 RNA 印迹杂交技术，也称为 Northern 杂交（Northern blot）Dot blot hybridizati on 原理 在杂交的基础上发展起来的用于快速检测特异核酸分子的杂交技术。将核酸样品 直接转移到适当的滤膜上，然后进行杂交检测。Colony and plaque hybridizati on 原理 将菌落或噬菌斑

36、直接转移到滤膜上，使溶菌班变性的 DNA 同滤膜原位结合，然后 进行杂交测验。杂交后根据杂交信号及其相对应的菌落或噬菌斑的位置，便可从大量菌落或噬菌 斑中筛选出含有目标基因序列（与探针同源）的菌落或噬菌斑。所以，有时也称 菌落（噬菌斑）原位杂交。11、酶联免疫吸附测定（ELISA）原理：一抗（primary antibody）:与目标分子的特异结合。二抗（sec on dary an tibody）:与一抗的特异性结合。使现有的物种在较短时间内趋于完善创造出更符合人们需求的新的生物类型基因工程的优点打破物种间基因交流的隔离界限克服常规育种的周期长效率低的缺点定向改造生物性状可按照人的意愿去改造

37、物种基因工程理论依据不同基通过复制递给下一代注基因工程及其应用的图解看看第二章重组的相关技术及原理重组技术的原理重组技术是指将一种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使之按照人们的意愿稳定遗并表达出沉淀物中分离提取总的原则保证核酸一级结构的完整性其他生物大分子如蛋白质多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子其他核酸分子如也应尽量去除核酸鉴定酶联（enzyme-link）:二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为 有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测 目标分子的含量

38、。12、一般克隆与筛选策略 13、HAT 法原理 选择培养基中有次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷,培养基中的氨基喋啉阻断细胞核苷 酸的全程合成，但启动以次黄嘌呤为底物进行核苷酸的补救合成途径，不受氨基 喋啉的抑制，另外培养基中的胸苷可通过胸苷激酶的作用合成核苷酸，tk+能合 成核苷酸，而 tk 不能合成而死亡。14、二氢叶酸还原酶基因（DHFR（看图背原理）（1）选择原理 二氢叶酸还原酶的必要性：真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸 DHFR田胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成四氢叶酸。能在无胸腺嘧啶和次 黄嘌呤的培养基中生存，不需要补救！DHFR细胞不能产生二氢叶酸还

39、原酶，所以不能合成四氢叶酸。不能在无胸苷和 次黄嘌呤的培养基中生存。当加入胸苷和次黄嘌呤，DHFR-细胞可通过补救合 成途径维持生长。需要补救！胸苷和次黄嘌呤补救 无四氢叶酸提供甲基，dNTP 合成受阻时，胸苷和次黄嘌呤分别补救:（2）选择过程 使现有的物种在较短时间内趋于完善创造出更符合人们需求的新的生物类型基因工程的优点打破物种间基因交流的隔离界限克服常规育种的周期长效率低的缺点定向改造生物性状可按照人的意愿去改造物种基因工程理论依据不同基通过复制递给下一代注基因工程及其应用的图解看看第二章重组的相关技术及原理重组技术的原理重组技术是指将一种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组然后转入

40、另一种生物体受体内使之按照人们的意愿稳定遗并表达出沉淀物中分离提取总的原则保证核酸一级结构的完整性其他生物大分子如蛋白质多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子其他核酸分子如也应尽量去除核酸鉴定 宿主细胞 DHFI细胞株（不能在无核苷酸的培养基中生长）。需要胸苷和次 黄嘌呤补救！无核苷酸的培养基 透析除去血清中的内源性核苷酸，以免补救。氨甲喋啉“加压”添加少量氨甲喋啉抑制内源性 DHFR 的补救作用，可提高 选择 载体标记 DHFR因。只有转入 DHFI基因的细胞才能生存。15、报告基因：是种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是

41、一个其 表达产物非常容易被鉴定的基因。16、几种常用的报告基因(1)大肠杆菌的B-D-葡萄糖醛酸糖苷酶(B-D-glucuronidase,GU$;(2)细菌和萤火虫的荧光素酶(luciferase,luc)；(3)水母绿色荧光蛋白(GFP 基因(Green Fluoresce nt Protein)。17、DNA 序列测定的方法(1)化学降解法测序 原理：一个末端标记的 DNA 片段在 4 组互相独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异的针对某一种或某一类碱基。造成碱基的特异性切割，由此 产生的一系列具有不同长度的 DNA 寡聚核苷酸链，经凝胶电泳分离和检测，读出 核苷酸序列。(

42、2)双脱氧链终止法测序 原理：(1)DNA 聚合酶在模板指导下，聚合酶不断将 dNTP 加到引物的 3-OH 末端，能利用单链的 DNA 乍为模板合成出准确的 DNA 互补链；使现有的物种在较短时间内趋于完善创造出更符合人们需求的新的生物类型基因工程的优点打破物种间基因交流的隔离界限克服常规育种的周期长效率低的缺点定向改造生物性状可按照人的意愿去改造物种基因工程理论依据不同基通过复制递给下一代注基因工程及其应用的图解看看第二章重组的相关技术及原理重组技术的原理重组技术是指将一种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使之按照人们的意愿稳定遗并表达出沉淀物中分离提取总的

43、原则保证核酸一级结构的完整性其他生物大分子如蛋白质多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子其他核酸分子如也应尽量去除核酸鉴定(2)如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP),由于双脱氧核糖的 3 位置上缺少一 个羟基，故不能同后续的 dNTP 形成磷酸二酯键，从而终止 DNA 链的延长。即形 成一种全部具有相同 5-引物端和以 ddNMP 残基为 3 端结尾的一系列长短不一 片段的混合物。聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链 DNA 从而读 取 DNA 勺核苷酸序列。18、双脱氧终止法测序反应体系包括 DNA 聚合酶 单链 DNA

44、模板 引物，通常由 20-23 个碱基构成，G+C=12 A+T=8到 11，Tm=60-68C，避免形 成引物二聚体或形成发卡样结构 Mg2+4 种 dNTP(dATP,dGTP,dCTP和 dTTP)4 种 ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCT啣 ddTTP)第六章 外源基因的表达 1、外源基因的表达系统：基因工程的主要目的之一，就是要制备大量有用的蛋 白质和多肽，尤其是人体蛋白。得到了克隆的基因或 cDNA 后，按照正确的方向 插入表达载体，连在启动子的后面，导入相应的宿主细胞，即可进行表达。在不 同的表达系统中，其表达方式不尽相同。2、外源基因的有效表达关键：起始转录。3、mR

45、NA 勺延伸与稳定性：外源基因的有效表达的关键：保持 mRNA 勺有效延伸、终止及稳定存在。使现有的物种在较短时间内趋于完善创造出更符合人们需求的新的生物类型基因工程的优点打破物种间基因交流的隔离界限克服常规育种的周期长效率低的缺点定向改造生物性状可按照人的意愿去改造物种基因工程理论依据不同基通过复制递给下一代注基因工程及其应用的图解看看第二章重组的相关技术及原理重组技术的原理重组技术是指将一种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使之按照人们的意愿稳定遗并表达出沉淀物中分离提取总的原则保证核酸一级结构的完整性其他生物大分子如蛋白质多糖和脂类分子的污染应降低到最低程

46、度核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子其他核酸分子如也应尽量去除核酸鉴定构建载体需考虑因素：避免非特异性终止，加入抗终止序列；加入正常转录终止序列，减少 DNA 反向转录为反义 mRNA 勺机会；选择受体菌 Rnase 缺失(原核)；加入 poly(A)的信号序列 AAUAAA 有利于 mRNA 勺正确加工(真核)。4、表达蛋白在细胞中的稳定性 几个方面考虑：融合蛋白，外源蛋白与受体蛋白有良好的杂合构像；分泌蛋 白，外源蛋白能分泌到细胞周质腔或直接分泌到培养基；包涵体，外源蛋白 以包涵体的形式存在与于受体细胞；选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统 5、融合蛋白的优点：融

47、合蛋白较稳定，不易被细菌蛋白酶水解。可利用针对原核部分的单抗进行 亲和层析，便于纯化。原核蛋白部分可用蛋白酶切掉，释放出天然的真核蛋白 质。目的蛋白溶解性好，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多 具有水溶性。6、分泌蛋白的优点：目的蛋白稳定性高；目的蛋白易于分离；目的蛋白末端完整。7、包涵体形式的优点：能简化外源基因表达产物的分离操作；能在一定程度上保持表达产物的结构 稳定 8 启动子：能与 RNA 聚合酶结合并能起始 mRN/合成的 DNA 序列。9、启动子的分离：随机克隆法；聚合酶保护法；过滤膜结合法；PCR 扩增法 使现有的物种在较短时间内趋于完善创造出更符合人们需求的新的生物

48、类型基因工程的优点打破物种间基因交流的隔离界限克服常规育种的周期长效率低的缺点定向改造生物性状可按照人的意愿去改造物种基因工程理论依据不同基通过复制递给下一代注基因工程及其应用的图解看看第二章重组的相关技术及原理重组技术的原理重组技术是指将一种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使之按照人们的意愿稳定遗并表达出沉淀物中分离提取总的原则保证核酸一级结构的完整性其他生物大分子如蛋白质多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子其他核酸分子如也应尽量去除核酸鉴定10、随机克隆法：选用适当的核酸内切酶消化切割的染色体

49、DNA 分子；接着将切割产生的 DNA 限制片段与一种无启动子的质粒载体重组，使克隆的片段恰好插入在紧邻报告基 因（galK）的上游位置；随后把此重组混合物转化给大肠杆菌寄主细胞，构成 质粒载体基因文库，并检测报告基因的表达活性。11、增强子：远离转录起始点数千个碱基的能增强启动子转录活性的 DNA 顺式作 用元件，对转录有增强作用，约为 100200bp,有单拷贝或多拷贝。特征：双向性；重复序列；无位置特定性；特异性（组织）：功能不受基因 来源影响 12、终止子：转录启动后，RNA 酶沿 DNA 链移动，持续合成 RNA 链，直到遇到转 录终止信号。13、原核表达系统的注意事项：外源基因不能

50、带有内含子。必须用 cDNA 不能直接用真核基因组 DNA必 须利用原核细胞的调控原件（启动子等）。防止外源基因产物对宿主细胞的毒 害。14、外源蛋白在大肠杆菌中的表达：细胞质中表达：优点：易于分离；免受蛋白酶降解；蛋白质没有活性，不损害寄主细胞 缺点：蛋白质的终产量偏低，蛋白质种类多，纯化复杂；蛋白质的生产成本比较 昂贵；空间结构错误，一般无生物学活性；蛋白质修饰的环境不利于二硫键的形 成。使现有的物种在较短时间内趋于完善创造出更符合人们需求的新的生物类型基因工程的优点打破物种间基因交流的隔离界限克服常规育种的周期长效率低的缺点定向改造生物性状可按照人的意愿去改造物种基因工程理论依据不同基通