基因工程知识点全高等教育生物学_高等教育-生物学.pdf

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1、第一章 基因工程概述 1.什么是基因工程，基因工程的基本流程？基因工程（Genetic engineering）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素。1.分离目的基因 2.限制酶切目的基因与载体 3.目的基因和载体 DNA 在体外连接 4.将重组 DNA 分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养 5.选择、筛选含目的基因的克隆 6.培养、观察目的基因的表达 第二章 基因工程的载体和工具酶 1.基因工程载体必须满足哪些基本条件

2、？具有对受体细胞的可转移性或亲和性。具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。具有合适的筛选标记。分子量小，拷贝数多。具有安全性。2.质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？1、自主复制性 2、可扩增性 3、可转移性 4、不相容性 主要类型有 1.克隆质粒 2.测序质粒 3.整合质粒 4.穿梭质粒 5.探针质粒 6.表达质粒 3.质粒的构建（1）删除不必要的 DNA 区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源 DNA 片段的装载量。一般来说，大于 20Kb 的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定。（2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的 mob

3、基因，杜绝重组质粒扩散污染环境，保证 DNA 重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数（3）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。（4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的 DNA 序列，即 多克隆接头（Polylinker），便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。（5）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。4.什么是人工染色体载体？将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、

4、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体 5.什么是穿梭载体？人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体。6.入-噬菌体载体及构建-DNA 为线状双链 DNA 分子，长度为，在分子两端各有 12 个碱基的单链互补粘性末端。1 缩短长度提高外源 DNA 片段的有效装载量删除重复的酶切位点 引入单一的多酶切位点接头序列，增加外源 DNA 片段克隆的可操作性 灭活某些与裂解周期有关基因。使-DNA 载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，以避免可能出现的污染现象的发生。加装选择标记，便于重组体的检测 单链噬菌体 DNA 载体 过定点诱变技术封闭重复的

5、重要限制性酶切口。引入合适的选择性标记基因，如含有启动子、操作子和半乳糖苷酶氨基端编码序列（lacZ ）的乳糖操纵子片段（lac）、组氨酸操纵子片段（his）以及抗生素抗性基因等。将人工合成的多克隆位点接头片段插在 lacZ 标记基因内部，使得含有重组子的噬菌斑呈白色，而只含有载体 DNA 的混浊噬菌斑呈蓝色。（4）在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的 DNA 测序引物序列，使得重组 DNA 分子的单链形式经分离纯化后，可直接进行测序反应。8.II类限制性内切核酸酶的特点 限制性核酸内切酶（Restriction endonucleases）是一类能在特异位点上催化双链DNA 分子的断裂，

6、产生相应的限制性片段的核酸水解酶。识别位点的特异性：每种酶都有其特定的 DNA 识别位点，通常是由 4、5 或 6 核苷酸组成的特定序列（靶序列）。识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。切割位点的规范性：双链 DNA被酶切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平末端的 DNA 分子）。同位酶：一部分酶识别相同的序列，但切点不同，这些酶称为同位酶。同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶 同尾酶（Isocandamers）：识别位点不同，但切出的 DNA 片段具有相同的末端序列，这些酶称为同尾酶。9.甲基化酶 类限制性内

7、切酶有相应甲基化酶伙伴，甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同，并在识别序列内使某位碱基甲基化，从而封闭该酶切口。甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的同时，却产生出另一种酶的切口 甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列，从而使 DNA免受相应的限制性核酸内切酶的切割。甲基化酶的用途就是在必要时可以封闭某一限制性核酸内切酶的酶切位点。连接酶连接作用的特点:DNA连接酶需要一条 DNA链的 3末端有一个游离的羟基（-OH），另一条 DNA链的 5末端有一个磷酸基（-P）的情况下，只有在这种情况下，才能发挥连接 DNA 分子的作用。只有当 3OH和 5P 彼此相邻，并且各自位于与互补链上的互补碱基配对

8、的两个脱氧核苷酸末端时，DNA 连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键。DNA 连接酶不能连接两条单链的 DNA 分子或环化的单链 DNA 分子，被连接的 DNA 链必须是双螺旋 DNA 分子的一部分。DNA连接酶只能封闭双螺旋 DNA上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口（nick），而不能封闭双链 DNA 的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口（gap）。由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应，因此，DNA 连接酶在进行连接反应时，还需要提供一种能源分子（NAD 或 ATP）11.大肠杆菌 DNA聚合酶和 Klenow大片段各有什么作用？DNA 聚合酶作用的特点：要有底物

9、4 种 dNTP为前体催化合成 DNA。接受模板指导。需要有引物（3羟基）的存在。不能起始合成新的 DNA 链。催化 dNTP加到生长中的 DNA 链 3-OH末端。催化 DNA 的合成方向是 53。Klenow 酶的基本性质：或多种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状因此供体受体和载体称为基因工程的三大要素分离目的基因限制酶切目的基因与载体目的基因和载体在体基因工程的载体和工具酶基因工程载体必须满足哪些基本条件具有对受体细胞的可转移性或亲和性具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有

10、合适的筛选标记分子量小拷贝多具有整合质粒穿梭质粒探针质粒表达质粒质粒的构建删除不必要的区域尽量缩小质粒的分子量以提高外源片段的装载量一般来说大于的质粒很难导入受体细胞而且极不稳定灭活某些质粒的编码基因如促进质粒在细菌种间转移的基因杜绝 大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的 C末端 604 个氨基酸残基片段,即 Klenow 酶。分子量为 76kDa。Klenow 酶仍拥有 53的 DNA聚合酶活性和 53的核酸外切酶活性，但失去了 53的核酸外切酶活性。Klenow 酶的基本用途：修复由限制性核酸内切酶造成的 3 凹端，使 之成为平头末端。以含有同位素的脱氧核

11、苷酸为底物，对 DNA 片段进行标记。用于催化 cDNA 第二链的合成。用于双脱氧末端终止法测定 DNA 的序列。聚合酶 T4-DNA 聚合酶酶的基本特性：有 35的核酸外切酶活性和 53的 DNA 聚合酶活性。在无 dNTP时，可以从任何 3-OH端外切。在只有一种 dNTP时，外切至互补核苷酸。在四种 dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。T4-DNA 聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的 3粘性末端 13.影响连接效率的因素有：温度（最主要的因素）离子浓度 ATP的浓度(10M-1M)连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）反应时间（通常连接过夜）插入片段和载体片段的摩尔比 DNA 末端

12、性质 DNA 片段的大小 14.如何将不同 DNA 分子末端进行连接？1.相同粘性末端的连接 如果外源 DNA 与载体 DNA 均用相同的限制性内切酶切割，则不管是单酶酶解还是双酶联合酶解，两种 DNA 分子均含有相同的粘性末端，因此混合后能顺利的连接成一个重组 DNA分子 2.平头末端的连接 T4-DNA 连接酶在 ATP和高浓度酶的条件下，能连接具有完全碱基配对的平末端 DNA 分子，但平末端连接效率不高，基因操作不经常采用。3.不用粘性末端的连接 3端的粘性末端用 T4-DNA 聚合酶切平 5端的粘性末端用 klenow 酶补平，或者用 S1 核酸酶切平 最后用 T4-DNA 连接酶进行

13、平末端连接 15.碱性磷酸酶有什么作用？1.该酶用于载体 DNA的 5末端除磷操作，以提高重组效率；2.用于外源 DNA 片段的 5端除磷，则可有效防止外源 DNA 片段之间的连接。16.末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用？给载体或目的 DNA 加上互补的同聚物尾。DNA 片段 3末端的同位素标记。17.2、细菌转化的步骤：感受态的形成。感受态时细胞表面出现各种蛋白质和酶类，负责转化因子的结合、切割及加工。感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子，其功能是与细胞表面受体结合，诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质（如细菌溶素）的合成，使细菌胞壁部分溶解，局部暴露出细胞膜上的 DNA 结合蛋白和

14、核酸酶等。转化因子的结合。受体菌细胞膜上的 DNA 结合蛋白可与转化因子的双链 DNA 结构特或多种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状因此供体受体和载体称为基因工程的三大要素分离目的基因限制酶切目的基因与载体目的基因和载体在体基因工程的载体和工具酶基因工程载体必须满足哪些基本条件具有对受体细胞的可转移性或亲和性具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有合适的筛选标记分子量小拷贝多具有整合质粒穿梭质粒探针质粒表达质粒质粒的构建删除不必要的区域尽量缩小质粒的分子量以提高外源片段的装载量一

15、般来说大于的质粒很难导入受体细胞而且极不稳定灭活某些质粒的编码基因如促进质粒在细菌种间转移的基因杜绝异性结合，单链 DNA 或 RNA 双链 RNA 以及 DNA/RNA 杂合双链都不能结合在膜上。转化因子的吸收。双链 DNA 分子与结合蛋白作用后，激活邻近的核酸酶，一条链被降解，而另一条链则被吸收到受体菌中。整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链 DNA 与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合复合物前体结构，它能有效地保护单链 DNA免受各种胞内核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色体 DNA 处。转化因子单链 DNA的整合。供体单链 DNA片段通过同源重组，置换受体染色体 DNA的同源区域，

16、形成异源杂合双链 DNA结构。+诱导转化原理：在 0的 Cacl2 低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时 Cacl2 使细胞膜磷脂层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。Ca2+能与加入的 DNA 分子结合，形成抗 DNA 酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当 42热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为 DNA 分子提供了进入细胞的通道。Mg2+对 DNA 分子有很大的稳定性作用，因此利用 Mgcl2 与 Cacl2 共同处理大肠杆菌细胞，可以提高 DNA 的转化效率。但该法要求

17、条件高，对外界污染物极为敏感，通常很少采用。介导细菌的原生质体转化 PEG是乙二醇的多聚物,存在不同分子量的多聚体,它可改变各类细胞的膜结构,使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组,此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能,从而造成细胞之间发生融合。20.电穿孔法 是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，在质膜上形成纳米大小的微孔，DNA 直接通过这些微孔或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通过质膜进入细胞质中，这种方法称为电穿孔法。P52 接合转化，入噬菌体感染未归纳 21.转化率的影响因素.载体及重组 DNA 方面 载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率

18、不同。载体的空间构象：与受体细胞亲和性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体。插入片段大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低。重组 DNA 分子的浓度和纯度 受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配 转化操作的影响 22.转化细胞的扩增 转化细胞的扩增操作：指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：Ca2+诱导转化后的 37培养一个小时 原生质体转化后的再生过程 噬菌体转染后的 30培养等，均属扩增操作扩增操作的目的 增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序。扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选。表达外源基因，便于筛选和鉴定。

19、23.抗药性筛选法 这是利用载体 DNA 分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法。抗药性筛选法的基本原理：抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源 DNA 片段插在 EcoRI 位点：非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcr 将外源 DNA 片段插在 BamHI位点：非重组子呈 Apr、Tcr 或多种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状因此供体受体和载体称为基因工程的三大要素分离目的基因限制酶切目的基因与载体目的基因和载体在体基因工程的载体和工具酶基因工程载体必须满足哪些基本条件具有对受体细胞的可转

20、移性或亲和性具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有合适的筛选标记分子量小拷贝多具有整合质粒穿梭质粒探针质粒表达质粒质粒的构建删除不必要的区域尽量缩小质粒的分子量以提高外源片段的装载量一般来说大于的质粒很难导入受体细胞而且极不稳定灭活某些质粒的编码基因如促进质粒在细菌种间转移的基因杜绝 重组子呈 Apr、Tcs 抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有 Ap的平板 再将 Ap平板上的转化子影印至含有 Tc 的平板上 在 Ap平板上生长，但在 Tc 平板上不长的转化子即为重组子 P56 抗药性标记插入失活选择法 经过上述抗药性筛选获得的大量转化子中既

21、包括需要的重组子，也含有不需要的非重组子。为了进一步筛选出重组子，可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选。如果外源基因插入在载体的抗药性基因中间使得该抗药性基因失活，这种抗药性标记就会消失，从而筛选出阳性重组子。24.什么是蓝白斑筛选法？这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。主要是在载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌半乳糖苷酶的基因片段，携带有lac 基因片段的载体转入lac 的宿主菌后，在含有 5溴4氯3引哚D半乳糖苷(X-gal)平板上形成浅蓝色的噬菌斑。外源基因插人 lac(或 lac 基因部分被取代)后，重组的噬菌体将丧失分解 X-gal 的能力，转入lac-宿主菌后，在含有 5溴4

22、氯3引哚D半乳糖苷(X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。筛选法 利用合适的引物，以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行 PCR，通过对 PCR产物的电泳分析，确定目的基因是否插入到载体中。由于在载体 DNA 分子中，外源 DNA 插入位点的两侧序列多数是已知的，可以设计合成相应的PCR引物，以待鉴定的转化子或重组子的 DNA 为模板进行 PCR反应，反应产物经琼脂糖凝胶电泳，若出现特异性扩增 DNA 带，并且其分子量同预期的一致，则可确定含此重组 DNA 分子的重组子是期待的重组子。第三章 基因工程的常规技术 1.探针有哪些类型？探针标记有哪些方法？类型：同

23、源或部分同源探针 cDNA探针 人工合成的寡核苷酸探针 标记方法：5端标记法反转录标记法缺刻前移标记法ABC标记法 4.什么是 ABC 荧光（显色酶）标记法？ABC 标记法。A为 Avidin（生物素抗性蛋白），每个 Avidin 分子可结合 3-4 个生物素分子；B为 Biotin（生物素），每个 Biotin分子可结合 2 个 Avidin 分子；C为 Complex，首先将 Biotin共价结合在探针分子上，荧光胺标记在 Avidin 上，两者形成复合物，即可将荧光胺标记在探针上，发出的荧光也能使普通胶片感光。如果将某一生色酶接在 Avidin 上，并辅以合适底物，则杂交反应还可直接以颜

24、色反应检测，这一技术称为酶标技术 5.亚克隆法 亚克隆：是将克隆片段进一步片段化后再次进行的克隆。一般是将重组 DNA分别用几种限制性核酸内切酶切割后，将所得各片段分别重组到载体上再转化宿主细胞，然后通过转化细胞的表型鉴定或鉴定，获得含有目的基因的重组子。此时，该重组分子中的无关 DNA 区域以被大量删除。6.菌落（嗜菌斑）原位杂交的基本原理、流程 该项技术是直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使 DNA暴露出来并与滤膜原位结合再与特异性 DNA 探针杂交,筛选出含有插入序列菌落。操作步骤：菌落生长 转移到 NC膜上 DNA 释放和变性 或多种生物体供体的基因与载体在体外进

25、行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状因此供体受体和载体称为基因工程的三大要素分离目的基因限制酶切目的基因与载体目的基因和载体在体基因工程的载体和工具酶基因工程载体必须满足哪些基本条件具有对受体细胞的可转移性或亲和性具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有合适的筛选标记分子量小拷贝多具有整合质粒穿梭质粒探针质粒表达质粒质粒的构建删除不必要的区域尽量缩小质粒的分子量以提高外源片段的装载量一般来说大于的质粒很难导入受体细胞而且极不稳定灭活某些质粒的编码基因如促进质粒在细菌种间转移的基因杜绝 （变成单链 DNA）：10S

26、DS NaOH 中和 Tris-HCl pH 固定 80 120 杂交（包括预杂交，加探针 DNA 杂交）放射自显影 对照比较，选出重组克隆 7.鸟枪法 鸟枪法：将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的 DNA 片段，分别连接到载体 DNA上，转化受体细胞，形成一套重组克隆，从中筛选出含有目的基因的期望重组子。鸟枪法制备目的基因的主要步骤 目的基因组 DNA 片段的制备 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端。（原核生物的基因长度大都在 2Kb以内，真核生物的基因长度变化很大，最大的基因可达100Kb以上)。全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不

27、可控。部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。DNA 片段与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体。重组 DNA 分子导入受体细胞 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞。筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）。目的基因的定位 利用鸟枪法获得的期望重组子只是含有目的基因的 DNA 片段，必须通过次级克隆或插入灭活，在已克隆的 DN

28、A 片段上准确定位目的基因，然后对目的基因进行序列分析，搜寻其编码序列以及可能存在的表达调控序列。法 酶促逆转录主要用于合成分子质量较大，转录产物 mRNA 易分离的目的基因。这种方法以目的基因的 mRNA 为模板，在逆转录酶的作用下合成互补的 DNA，即 cDNA，然后在 DNA 聚合酶的催化下合成双链 cDNA片段，与适当的载体重组后转入受体菌扩增，获得目的基因的 cDNA克隆。的分离纯化 绝大多数的真核生物 mRNA 在其 3端都存在一个多聚腺苷酸的尾巴，利用它可以迅速的将 mRNA 从细胞总的混合物中分离出来，将寡聚脱氧胸腺嘧啶共价交联在纤维素分子上，制成亲和层析柱，然后将细胞总的 R

29、NA混合物上层析柱分离，mRNA 会挂在层析住上，后洗脱即可分离 10.简述 PCR 技术的基本原理，PCR 反应体系的主要成分与主要程序是怎样的？PCR技术的基本原理：类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。过程：PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 93左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板 DNA 与引物的退火(复性)：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55左右，引物与模板 DNA 单链的互补序

30、列配对结合；引物的延伸：DNA 模板-引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP为反应原料，或多种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状因此供体受体和载体称为基因工程的三大要素分离目的基因限制酶切目的基因与载体目的基因和载体在体基因工程的载体和工具酶基因工程载体必须满足哪些基本条件具有对受体细胞的可转移性或亲和性具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有合适的筛选标记分子量小拷贝多具有整合质粒穿梭质粒探针质粒表达质粒质粒的构建删除不必要的区域尽量缩小质粒的分子量以提高外源片

31、段的装载量一般来说大于的质粒很难导入受体细胞而且极不稳定灭活某些质粒的编码基因如促进质粒在细菌种间转移的基因杜绝靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24 分钟，2 3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。11.什么是基因组文库？其构建方法是怎样的？是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中，以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因，这种保存基因遗传信息的材料，就称为基因文库又称 DNA

32、文库。基因组文库构建的一般步骤 载体的选择和制备。高纯度、大分子量基因组 DNA 的提取。基因组 DNA 的部分酶切与分级分离。载体与 DNA 片段的连接。转化或侵染宿主细胞。筛选鉴定基因组及保存。12.基因组 DNA 文库的质量标准 除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因组 DNA 文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分 隔克隆。克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以 利于克隆排序。克隆片段易于从载体分子上完整卸下。重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。基因文库的构建通常采用鸟枪法和 cDNA法 13.外源 DNA 片段

33、的切割原则 片段之间要有一定的重叠序列 片段大小要均一 文库构建的步骤 细胞总 RNA 的提取和 mRNA 的分离 第一链 cDNA合成 第二链 cDNA合成 双链 cDNA的分级分离 双链 cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖 重组体的筛选与鉴定 第四章 基因在大肠杆菌、酵母的高效表达 1.启动子 启动子：是 DNA 链上一段能与 RNA 聚合酶结合并 能起始转录的序列，其大小在 20300 个碱基，是控制基因转录的重要调控元件。在一定条件下 mRNA 的合成速率与启动子的强弱密切相关，而 转录又在很大程度上影响基因的表达。启动子的特征：序列特异性方向性位置特 性种属特异性 2.启

34、动子类型 或多种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状因此供体受体和载体称为基因工程的三大要素分离目的基因限制酶切目的基因与载体目的基因和载体在体基因工程的载体和工具酶基因工程载体必须满足哪些基本条件具有对受体细胞的可转移性或亲和性具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有合适的筛选标记分子量小拷贝多具有整合质粒穿梭质粒探针质粒表达质粒质粒的构建删除不必要的区域尽量缩小质粒的分子量以提高外源片段的装载量一般来说大于的质粒很难导入受体细胞而且极不稳定灭活某些质粒的编码基因如促进质粒在细菌种

35、间转移的基因杜绝 组成型启动子：是指在该类启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织、部位表达水平没有明显差异。组织特异启动子：又称器官特异性启动子。在这类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。诱导型启动子：是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。目前已经分离了光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等。3.终止子 终止子：是位于结构基因下游的一段 DNA 序列，基因转录时，该序列被转录为 mRNA 的一部分，

36、并形成特殊的二级结构，由此终止基因的转录。序列 SD序列：mRNA 中起始密码子上游 8-13 个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序，它可以与30S 亚基中的 16S rRNA 3端富含嘧啶的尾部互补，形成氢键结合，有助于 mRNA 的翻译从起始密码子处开始 5.密码子 不同生物对密码子的偏爱性 1.生物体基因组中的碱基含量 2.密码子与反密码子的相互作用的自由能 3.细胞内 tRNA的含量 6.密码子偏爱性对外源基因表达的影响 由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，

37、有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：外源基因全合成 同步表达相关 tRNA编码基因 7.包涵体及其性质 在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体 8.包涵体的形成机理 折叠状态的蛋白质集聚作用。非折叠状态的蛋白质集聚作用 蛋白折叠中间体的集聚作用。9.包涵体的分离检测 包涵体的分离主要包括菌体破碎、离心收集以及清洗三大操作步骤。10.分泌型目的蛋白表达系统的构建 包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将 蛋白质直接分泌到胞外，但有些革兰氏阴性菌能将 细菌的抗菌蛋白（细

38、菌素）分泌到培养基中，这一 过程严格依赖于细菌素释放蛋白，它激活定位于内 膜上的磷酸酯酶 A，导致细菌内外膜的通透性增大 因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个 合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞。此 时，用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的 基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并 使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可 实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。11融合蛋白表达质粒的构建原则：受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物 或多种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状因此供体受体和载体称为

39、基因工程的三大要素分离目的基因限制酶切目的基因与载体目的基因和载体在体基因工程的载体和工具酶基因工程载体必须满足哪些基本条件具有对受体细胞的可转移性或亲和性具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有合适的筛选标记分子量小拷贝多具有整合质粒穿梭质粒探针质粒表达质粒质粒的构建删除不必要的区域尽量缩小质粒的分子量以提高外源片段的装载量一般来说大于的质粒很难导入受体细胞而且极不稳定灭活某些质粒的编码基因如促进质粒在细菌种间转移的基因杜绝 可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融 合蛋白提供终止密码子。在某些情况下，并不需

40、要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合 蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，为目的 蛋白分离回收创造条件。两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺。两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架。12.理想变性剂的特点 1.变形溶解速度快 2.对包含体中残留细胞碎片的分离没有干扰 3.无温度依赖性 4.对蛋白酶没有抑制作用 5.对蛋白质的氨基酸侧链基团无化学反应活性 13.哺乳动物细胞的物理转化法 1.磷酸钙共沉淀法 2.电击转化法 3.脂质体介导法 4.显微注射法 第五章 基因治疗 1.基因治疗的概念与策略是什么？基因治疗：指应用 DNA 重组技术，将外源正常基

41、因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗的目的。为达到这一目的，实施相应的策略。基因治疗策略：直接基因治疗和间接基因治疗 2.基因治疗的基本程序是怎样的？基因治疗包括基因诊断、基因分离、载体构建和基因转移四项基本内容。3.基因治疗的分子机制 正常基因：从健康人体内分离克隆，它或通过同源重组方式置换病变基因，或依靠其表达产物弥补病变基因的非功能性蛋白的生理作用。这类基因通常用于矫正各种基因缺陷型的遗传病，如血友病、地中海贫血病以及由腺苷脱氨酶（ADA）基因缺陷所致的重度联合免疫缺陷症等。反义基因：用于治疗病毒感染或肿瘤疾病。反义基因的体内表达产物（反义 RNA）或与病毒的

42、激活因子编码基因互补（如艾滋病毒 HIV），或与肿瘤基因的 mRNA 互补（如食道癌癌基因 cmyc），从而阻断其表达。自杀基因：用于治疗癌症。很早人们就发现在病毒、细菌和真菌中存在一些酶，它们能将细胞中一些原本无毒的代谢物转化为毒性化合物，而这些酶在动物体内是不存在的。如果将它们转入肿瘤细胞，再辅以原代谢物或药物，就能杀灭癌细胞。因此这类酶称为自杀酶，相应的基因则为自杀基因。第八章 途径工程 1.途径工程定义 根据底物在代谢反应中对通用性酶和特异性酶的使用要求，可将细胞内所有的生物分子分成两大类：一级基因产物，如 tRNA、rRNA、多糖、酯类、蛋白质和核酸等，其生物合成和分解只需要有限的几

43、种通用性的酶及蛋白因子，包括 RNA 聚合酶、RNA 剪切酶、DNA 聚合酶、糖苷酶、脂酶、氨酰基-tRNA合成酶、肽基转移酶、核酸酶等 二级基因产物，如氨基酸、维生素、抗生素、核苷酸等小分子化合物，它们的生物全合成和降解少则涉及几个基因多则需要几十个基因所编码的酶系，而且这些酶大都具有使用的特异性。上述合成和分解二级基因产物的酶系及其催化的生化反应，或多种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状因此供体受体和载体称为基因工程的三大要素分离目的基因限制酶切目的基因与载体目的基因和载体在体基因工程的载体和工具酶基因工程载体必须满足哪

44、些基本条件具有对受体细胞的可转移性或亲和性具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有合适的筛选标记分子量小拷贝多具有整合质粒穿梭质粒探针质粒表达质粒质粒的构建删除不必要的区域尽量缩小质粒的分子量以提高外源片段的装载量一般来说大于的质粒很难导入受体细胞而且极不稳定灭活某些质粒的编码基因如促进质粒在细菌种间转移的基因杜绝构成了一个个相互联系的代谢网络。它们均由若干个串联和并联的简单子途径组成，其中各子途径的并联交汇点称为节点。细胞代谢途径实质上就是与一组特定的流入和流出代谢物质相联系的任何一个合理可观察的生化反应序列。途径工程（Pathway Engine

45、ering）：是一门利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络、并通过 DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰、进而完成细胞特性改造的应用性学科。2.途径工程基本过程 靶点设计 根据代谢流分布和控制的分析结果确定途径操作的合理靶点，通常包括拟修饰基因的靶点、拟导入途径的靶点或者拟阻断途径的靶点等。值得强调的是，靶点设计对途径工程的成败起着关键作用，任何精细的靶点选择都必须经得起细胞生理特性以及代谢网络热力学平衡的检验。基因操作 利用途径工程战略修饰改造细胞代谢网络的核心是在分子水平上对靶基因或基因簇进行遗传操作，其中最典型的形式包括基因或基因簇的克隆、表达、修饰、敲除、调控以及重组基因在目标

46、细胞染色体 DNA 上的稳定整合。效果分析 对新途径进行全面的效果分析，由初步途径操作构建出来的细胞所表现出的限制与缺陷可以作为新一轮实验的改进目标。正像蛋白质工程实验所采用的研究策略，如此反复进行遗传操作即可获得优良物种。或多种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组然后转入另一种生物体受体内使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状因此供体受体和载体称为基因工程的三大要素分离目的基因限制酶切目的基因与载体目的基因和载体在体基因工程的载体和工具酶基因工程载体必须满足哪些基本条件具有对受体细胞的可转移性或亲和性具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有合适的筛选标记分子量小拷贝多具有整合质粒穿梭质粒探针质粒表达质粒质粒的构建删除不必要的区域尽量缩小质粒的分子量以提高外源片段的装载量一般来说大于的质粒很难导入受体细胞而且极不稳定灭活某些质粒的编码基因如促进质粒在细菌种间转移的基因杜绝