细胞培养兼转染步骤医学心理学基础医学_医学心理学-基础医学.pdf

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1、细胞复苏 1 准备好超净台、吸管、离心管、40C的水 2.从液氮中取出要复苏的细胞，置于准备好的37 C中速溶（剧烈摇晃）3.5ml的离心管中加入4ml的完全培养液（DMEM+抗+血清）即平时用于传代 的10%FBS勺培养液，再加入溶解的细胞液 4.lOOOrpm,5min,离心，平时常用 900rpm 5min.5弃上清，加入4ml的完全培养液，吹散细胞 6.分装两瓶中，然后每瓶补充培养液至卫nl/瓶 7.37 C二氧化碳培养箱松盖培养，48h|n做传代 二.细胞传代 1.培养48h内的细胞，若瓶壁上已长满细胞则应进行传代 2.吸去瓶内的培养液 3.加入lml的EDTA让EDTA可以铺过所有

2、细胞，约作用10s 4.吸去EDTA加入lml的0.25%的胰酶，让胰酶没过所有细胞（可轻轻晃动）,作用 约2mino在显微镜下观察细胞，若已由成片的细胞变成单个细胞，则消 化完成 5.吸去胰酶，加入4ml的培养液。用lml的吸管吹打瓶壁，让细胞脱落，吹打成 单 个细胞悬液 6.将细胞悬液分成两瓶，并将每瓶培养液补充至5ml 7.37 C二氧化碳培养箱松盖培养，48h后做传代 细胞冻存 传代至数瓶的细胞且长满瓶壁即可传代和冻存 1 把细胞消化（与细胞传代步骤相同），计数。把细胞悬液合并到5ml离心管中，混匀、lOOOrpm,离心 5min 2.弃上清，依细胞数加入培养液（冻存管每管细胞数要达到

3、 4X ICT个）3.分装到冻存管内（冻存管要预先冷却）4.细胞冻存液的成分为：DMSO 100ul培养液600 ul（细胞悬液），血清300ul 5.将分好的冻存管细胞标上名称、日期等放到冻存盒内拧好 的完全培养液抗血清即平时用于传代的勺培养液再加入溶解的细胞液离心平时常用弃上清加入的完全培养液吹散细胞分装两瓶中然后每瓶补充培养液至卫瓶二氧化碳培养箱松盖培养做传代二细胞传代培养内的细胞若瓶壁上已长满细轻晃动作用约在显微镜下观察细胞若已由成片的细胞变成单个细胞则消化完成吸去胰酶加入的培养液用的吸管吹打瓶壁让细胞脱落吹打成单个细胞悬液将细胞悬液分成两瓶并将每瓶培养液补充至二氧化碳培养箱松盖培养后

4、做传代细混匀离心弃上清依细胞加入培养液冻存管每管细胞要达到个分装到冻存管内冻存管要预先冷却细胞冻存液的成分为培养液细胞悬液血清将分好的冻存管细胞标上名称日期等放到冻存盒内拧好先置于冻存盒内冰箱中过夜再转到液氮中6.先置于冻存盒内-80 C冰箱中过夜，再转到液氮中冻存 四分细胞 传代培养至一定数目且生长旺盛的细胞即可分到 12孔板内培养，为下一步转 染做准备 1.把细胞消化成单细胞悬液计算细胞数 2.把细胞分到12孔板中，每孔细胞数至少要达到3X 10$个/ml,并补充培养液 至lml/孔 3.37 T二氧化碳培养箱松盖培养，24h内做转染（看细胞状况）六转染（瞬时转染）12孔板中培养24h内的

5、细胞用于做转染 1.吸去完全培养基，加入无血清无双抗的950ul DMEM加入时应轻轻从侧壁加入 2.加入50ul的转染液（不可晃动）3培养至4-8个小时后换成完全培养液，换液时应轻柔，不可晃动 4.37 T二氧化碳培养箱松盖培养，72h后细胞裂解 五.酶切 酶切体系:酶切条件:电泳鉴定 出0 10X NEB Buffer BspQl Seal Piasmid 37 C 50 r 35卩 10卩 3卩 2卩 50卩 10小时 过夜 的完全培养液抗血清即平时用于传代的勺培养液再加入溶解的细胞液离心平时常用弃上清加入的完全培养液吹散细胞分装两瓶中然后每瓶补充培养液至卫瓶二氧化碳培养箱松盖培养做传代

6、二细胞传代培养内的细胞若瓶壁上已长满细轻晃动作用约在显微镜下观察细胞若已由成片的细胞变成单个细胞则消化完成吸去胰酶加入的培养液用的吸管吹打瓶壁让细胞脱落吹打成单个细胞悬液将细胞悬液分成两瓶并将每瓶培养液补充至二氧化碳培养箱松盖培养后做传代细混匀离心弃上清依细胞加入培养液冻存管每管细胞要达到个分装到冻存管内冻存管要预先冷却细胞冻存液的成分为培养液细胞悬液血清将分好的冻存管细胞标上名称日期等放到冻存盒内拧好先置于冻存盒内冰箱中过夜再转到液氮中（2）转染液：新印管中lOOul无血清培养基，2ug的质粒，4ul Fugene 七.细胞裂解 转染72h后应取细胞培养液和细胞裂解液检测转染是否成功 1.吸

7、出细胞培养液到一新的印管中，-20 C保存，待做ELISA 2.用1ml/孔的IX PBS洗孔，从侧壁加入，轻轻晃动，除去PBS 3.加入（PBS+O.3%NP40 500ul每孔，晃动，细胞裂解，此即为细胞裂解液 4.把细胞裂解液吸到一新的印管中，4500rpm 5min离心，除去细胞碎片和杂质 5.离心后吸上清（450ul）到一新管中，-20 C保存，待做QT-PCR 注：做QT-PCF前准备（释放HBV DNA PCRt 中：buffer 60ul,细胞裂解液 40ul PCR 仪中：65 C 35min,94 C 17min.八鉴定 HBsAg和HBeAg的检测 采用ELISA方法检测

8、HBsAg和HBeAg的表达 荧光定量PCR检测HBV DNA（避光操作）用蛋白酶K法提取病毒核心颗粒 PCR反应体系：Mix 12.5 卩 引物1 0.5 卩 1 0.5 卩 1 0.5 卩 注:（1）计算质粒的量,每孔达到lug 的完全培养液抗血清即平时用于传代的勺培养液再加入溶解的细胞液离心平时常用弃上清加入的完全培养液吹散细胞分装两瓶中然后每瓶补充培养液至卫瓶二氧化碳培养箱松盖培养做传代二细胞传代培养内的细胞若瓶壁上已长满细轻晃动作用约在显微镜下观察细胞若已由成片的细胞变成单个细胞则消化完成吸去胰酶加入的培养液用的吸管吹打瓶壁让细胞脱落吹打成单个细胞悬液将细胞悬液分成两瓶并将每瓶培养液

9、补充至二氧化碳培养箱松盖培养后做传代细混匀离心弃上清依细胞加入培养液冻存管每管细胞要达到个分装到冻存管内冻存管要预先冷却细胞冻存液的成分为培养液细胞悬液血清将分好的冻存管细胞标上名称日期等放到冻存盒内拧好先置于冻存盒内冰箱中过夜再转到液氮中引物2 模板 门 Taq PCR反应程序：94 C 3 min 94 C 15S 60 C 15 S 30循环 72 C 15S 每个循环采集荧光，程序运行结束后电泳鉴定 传代至一定数目且生长旺盛的细胞即可分到6孔板进行稳定转染（稳定转染）1、消化（此时用的培养液成分为：DMEM+FBS）2、计数 3、把细胞分到6孔板中，每孔细胞数要达到至少3X 105,并

10、补充培养液至2 ml/孑L,37C,CQ孵箱，培养。24 h内做转染 计算公式：（每孔要加入的消化液体积数X计数的浓度）/2m匸每孔要求的细胞数例 如:计数的浓度为5X 105个/ml,每孔要求的细胞数为2.5X105个，每孔要求的总体 积为2 ml,则每孔需加如lml的消化液.转染（稳定转染）1、转染液成分配制（每孔）:Opt i MEM 100 卩 1 Fugene 5卩1 质粒 1卩g Pss-neo 质粒 1卩g 配好后轻轻混匀（Ps2-neo质粒是用于共转染的，有G418抗性），Fugene的 体积量与质粒的微克数有一定的比例（一般Fugene:质粒=3ul:2ug）2、直接把配好的

11、转染液加入培养板，加的时候应该一滴滴加入，并均匀加到各 各位 置，空白对照空什么都不加，无需换培养液 3、培养到第三天培养液换成成分为：DMEM+FBS+双抗+G418的培养液 4、G418使的完全培养液抗血清即平时用于传代的勺培养液再加入溶解的细胞液离心平时常用弃上清加入的完全培养液吹散细胞分装两瓶中然后每瓶补充培养液至卫瓶二氧化碳培养箱松盖培养做传代二细胞传代培养内的细胞若瓶壁上已长满细轻晃动作用约在显微镜下观察细胞若已由成片的细胞变成单个细胞则消化完成吸去胰酶加入的培养液用的吸管吹打瓶壁让细胞脱落吹打成单个细胞悬液将细胞悬液分成两瓶并将每瓶培养液补充至二氧化碳培养箱松盖培养后做传代细混匀

12、离心弃上清依细胞加入培养液冻存管每管细胞要达到个分装到冻存管内冻存管要预先冷却细胞冻存液的成分为培养液细胞悬液血清将分好的冻存管细胞标上名称日期等放到冻存盒内拧好先置于冻存盒内冰箱中过夜再转到液氮中用浓度（终浓度）为:600卩g/ml 维持 1、以后每隔三天换一次液，换新培养液时先用 PBS洗一次细胞。小心污染 的完全培养液抗血清即平时用于传代的勺培养液再加入溶解的细胞液离心平时常用弃上清加入的完全培养液吹散细胞分装两瓶中然后每瓶补充培养液至卫瓶二氧化碳培养箱松盖培养做传代二细胞传代培养内的细胞若瓶壁上已长满细轻晃动作用约在显微镜下观察细胞若已由成片的细胞变成单个细胞则消化完成吸去胰酶加入的培

13、养液用的吸管吹打瓶壁让细胞脱落吹打成单个细胞悬液将细胞悬液分成两瓶并将每瓶培养液补充至二氧化碳培养箱松盖培养后做传代细混匀离心弃上清依细胞加入培养液冻存管每管细胞要达到个分装到冻存管内冻存管要预先冷却细胞冻存液的成分为培养液细胞悬液血清将分好的冻存管细胞标上名称日期等放到冻存盒内拧好先置于冻存盒内冰箱中过夜再转到液氮中2、一般24天后有细胞群落出现（HepG2）3、当细胞克隆群落长好以后（细胞有重叠）就可以对其进行分离克隆群落分离 2、吸去培养液，用小枪（20 Q1吸10卩胰酶滴加到做好标记的克隆群落上，作用5 秒钟 3、用小枪（20卩）1吸10 培养液在克隆群落上面轻轻吹出再吸上来，但不要

14、全 部吹出完10 11,重复45次轻轻吹出吸上即可把克隆群落吸上来 注:分离的过程要快，否则其他克隆群落会因为干燥而死亡。使用胰酶和培养液 可以 分5001到EP管中，这样可以预防污染，方便使用省时。4、把吸到的克隆群落加到预先加有200 1培养液的48孔板上吹散培养，此时培 养液G4 1 8浓度为4001 g/ml,有利于细胞的生长（我的长出的克隆很多，所以每种克隆分离了 12个克隆群落。）5、当48孔板长满长密后，再传到24孔板，此时培养液G4 1 8浓度改为 6001g/ml 6、24孔板长满长密后，取培养上清做ELISA 7、取ELISA吉果好的（值较高的）孔传到6孔板（不传到12空板

15、，12空板空 间太小，很快就长满，传到6孔板比较合适），一般取一半孔数 8、当6孔板长满长密后，再传培养瓶 9、在培养瓶里传代培养，到达一定的量后就可以冻存细胞，预防不利情况发生时 使用 10、每次冻存细胞后留下少量进行培养 11、在液氮罐里冻存细胞一定要做好哪个号放在哪个位置，便于寻找 1、在显微镜下找出要分离的克隆群落，用标记笔在板下画个 做标记 的完全培养液抗血清即平时用于传代的勺培养液再加入溶解的细胞液离心平时常用弃上清加入的完全培养液吹散细胞分装两瓶中然后每瓶补充培养液至卫瓶二氧化碳培养箱松盖培养做传代二细胞传代培养内的细胞若瓶壁上已长满细轻晃动作用约在显微镜下观察细胞若已由成片的细胞变成单个细胞则消化完成吸去胰酶加入的培养液用的吸管吹打瓶壁让细胞脱落吹打成单个细胞悬液将细胞悬液分成两瓶并将每瓶培养液补充至二氧化碳培养箱松盖培养后做传代细混匀离心弃上清依细胞加入培养液冻存管每管细胞要达到个分装到冻存管内冻存管要预先冷却细胞冻存液的成分为培养液细胞悬液血清将分好的冻存管细胞标上名称日期等放到冻存盒内拧好先置于冻存盒内冰箱中过夜再转到液氮中