磺胺类药物医学心理学药学_医学心理学-药学.pdf

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1、精品资料推荐 磺胺类药物(Sulfonamides,SAs)是指具有对氨基苯磺 酰胺结构的一类药物的总称，其通过干扰细菌的酶系统对氨基 苯甲酸的利用而发挥抑菌作用，后者是微生物生长必需物质叶 酸的组成部分。自 20 世纪30 年代研究证明了 SAs 抑菌的基本结 构后，相继合成了各种 SAs,由于其抗菌谱广，价格低廉，目前 仍是兽医临床和畜牧养殖业中最常用的药物添加剂之一，但也 带来了食品安全和环境污染等系列问题。研究表明与其它常用抗生素相比，SAs 可能更易诱导菌株应 选择压力而产生耐药性。此外,SAs 药物还会导致过敏反应、尿和 造血功能紊乱等副作用 o 如磺胺二甲基喀唳等可能诱发啮齿类动

2、 物如鼠的甲状腺增生，对其激素样效应和潜在致癌性质正在进 一步研究中。由于 SAs 在体内作用和代谢的时间较长，通过任何 途径摄入的磺胺都有可能在人体中蓄积，蓄积浓度超过一定值 时将对人体机能造成损害。因此，联合国食品法典委员会(CAC)和许多国家规定，食品和饲料中 SAs 总量以及磺胺二甲基喀噪等 单个 SAs 的量均不得超过 Ollmg/kgo而且伴随兽药残留毒理学 的发展和风险分析手段的进步，各国对 SAs 在动物源性食品中的 残留限量做出了越来越严格的规定，如日本对食用动物肌肉中 磺胺二甲基喀唳的最大残留限量规定为方法检测低限，即 0101mg/kgo 关于 SAs 残留的检测从早期的

3、分光光度法、荧光法、薄层色 谱法到近些年的液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质 精品资料推荐 谱法、毛细管电泳法和超临界流体色谱法，几乎所有的分析理论 和技术在 SAs 残留分析中都得到了研究和应用，其中采用最多的 筛选方法是反相髙效液相色谱法(HPLC),后来发展的酶联免疫 吸附测试方法(ELISA)作为筛选方法也得到了广泛的应用。但 是这些检测方法都存在处理方法繁琐，操作时间长及只能检测 单个磺胺类药物的问题。基于细菌受体分析的 CharmD放射免 疫法的样品前处理提取方法简便，具有灵敏度高，特异性强的特 点，并且可以检测磺胺类残留总量，已经为欧盟国家和美国FDA 认可并且应用于初筛

4、分析，目前国内尚未见有关鳗鱼的检测报 道。本研究建立了鳗鱼中磺胺类残留 CharmH放射免疫检测方 法。1 材料和方法 1.1 设备和材料 Charm 6600/7600分析仪：美国 Charm公司生产；IEC 离心;均质器；涡旋混合器；恒温孵育器(65 l C;80 29);闪 烁液加液器;50mL离心管；硼硅玻璃试管及试管塞；pH 试条；药片压杆。1.2 样品和试剂 12.1 检测基质鳗鱼 1.2.2检测试剂 磺胺类 CharmD检测试剂盒;闪烁液(Op tifluor);阴性对照液；多抗标准品。以上试剂均由美国 Charm公司提供。精品资料推荐 1.2.3磺胺类药物标准品 磺胺甲基（SM

5、1）、磺胺二 甲基 W（SM2）、磺胺间甲氧喀噪（SMM）、磺胺间二甲氧喀 唳（SDM）、磺胺唾噁咻（SQX）、磺胺甲嗟二瞠（STZ）、磺胺 卩比唳（SPD）、磺胺异噁瞠的利用而发挥抑菌作用后者是微生物生长必需物质叶酸的组成部分自世纪年代研究证明了抑菌的基本结构后相继合成了各种由于其抗菌谱广价格低廉目前仍是兽医临床和畜牧养殖业中最常用的药物添加剂之一但也带来了食品安全和过敏反应尿和造血功能紊乱等副作用如磺胺二甲基喀唳等可能诱发啮齿类动物如鼠的甲状腺增生对其激素样效应和潜在致癌性质正在进一步研究中由于在体内作用和代谢的时间较长通过任何途径摄入的磺胺都有可能在人体中蓄积蓄胺二甲基喀噪等单个的量均不

6、得超过而且伴随兽药残留毒理学的发展和风险分析手段的进步各国对在动物源性食品中的残留限量做出了越来越严格的规定如日本对食用动物肌肉中磺胺二甲基喀唳的最大残留限量规定为方法检测低限（SIZ）、磺胺甲基异噁瞠（SMZ）、磺胺卩密唳（SD）、磺胺嗟瞠（ST）、磺胺甲氧哒嗪（SMP）、磺 胺氯哒嗪（SCP）o 以上标准品由 Sigma公司提供。12.4 恩诺沙星、新霉素、庆大霉素、链霉素、螺旋霉素、林可霉素、四环霉素、氯霉素、红霉素、青霉素 G 标准品。以上标准品由 Sigma公司提供。1.3 方法 1.3.1测试原理 测定的基础是竞争性受体免疫反应。用3H 标记的磺胺二 甲喀噪（示踪剂）与样品中磺胺类

7、药物的竞争结合试剂（微生物细 胞上的特异性受体）上的磺胺结合位点，当样品中残留磺胺类药 物时，残留物与受体上的结合位点结合，从而阻止了3H 标记 的磺胺类药物与结合剂位点的结合。样品中的磺胺类药物含量越 高竞争的结合位点越多,3H 标记磺胺二甲卩密唳的则越少，用 Charm II分析仪测定样品中的3H 含量的 cpm（每分钟脉冲 数）值，cpm 值越低则样品中的磺胺类药物残留量越髙。1.3.2提取步骤（1）取 50mL 离心管，加入 10g 均质好的鳗鱼糜样。的利用而发挥抑菌作用后者是微生物生长必需物质叶酸的组成部分自世纪年代研究证明了抑菌的基本结构后相继合成了各种由于其抗菌谱广价格低廉目前仍

8、是兽医临床和畜牧养殖业中最常用的药物添加剂之一但也带来了食品安全和过敏反应尿和造血功能紊乱等副作用如磺胺二甲基喀唳等可能诱发啮齿类动物如鼠的甲状腺增生对其激素样效应和潜在致癌性质正在进一步研究中由于在体内作用和代谢的时间较长通过任何途径摄入的磺胺都有可能在人体中蓄积蓄胺二甲基喀噪等单个的量均不得超过而且伴随兽药残留毒理学的发展和风险分析手段的进步各国对在动物源性食品中的残留限量做出了越来越严格的规定如日本对食用动物肌肉中磺胺二甲基喀唳的最大残留限量规定为方法检测低限(4)再将离冰水内 加入 30mLMSU提取缓冲液，强力振荡离心管 lOmin后进 入步骤(3)o(3)将离心管置 80 2 C

9、孵育器内孵育 45mino (5)于 1750g(IEC离心机 313 X 1000 rpm)离心 10mino(6)吸出上层液用于测试。注意不要将漂浮的脂肪颗粒混入上清 液内。1.3.3测定步骤(1)用药片压杆的平端，将白色药片(受体试剂片)压入一洁净的 玻璃试管内。(2)力 n300ML 蒸憎水到试管内用涡旋混合器振荡 10 s 至药片破 碎。(3)用加样器加 4niL 样品到试管内。(每一样品用一新加液吸 嘴)O(4)用笔的平端，压入粉红色药片(3H 标记的磺胺二甲喀 唳)o 用振荡器振荡大约 15 s。置 65 1 C 孵育器内，孵育 3min0(6)1750g(IEC离心机 313

10、X 1000 rpm)离心 3mino(7)离心停止后立即取出试管，倒掉上层液，用棉签清除试管内 的脂肪环并吸干管壁内的残渍，不要接触沉淀物。(8)力 n300ML 蒸憎水到试管内，振荡使沉淀物完全破碎。(9)加 3mL 闪烁液到试管内涡旋混匀至试管内没有不均一的云 絮状物。（10）试管放入 Charmn/7600分析仪内。（11）按 Chmn H/7600分析仪操作程序选项（检测控制点需 预先设定并输入仪器），读3H 项的 cpni 值。lie 的利用而发挥抑菌作用后者是微生物生长必需物质叶酸的组成部分自世纪年代研究证明了抑菌的基本结构后相继合成了各种由于其抗菌谱广价格低廉目前仍是兽医临床和

11、畜牧养殖业中最常用的药物添加剂之一但也带来了食品安全和过敏反应尿和造血功能紊乱等副作用如磺胺二甲基喀唳等可能诱发啮齿类动物如鼠的甲状腺增生对其激素样效应和潜在致癌性质正在进一步研究中由于在体内作用和代谢的时间较长通过任何途径摄入的磺胺都有可能在人体中蓄积蓄胺二甲基喀噪等单个的量均不得超过而且伴随兽药残留毒理学的发展和风险分析手段的进步各国对在动物源性食品中的残留限量做出了越来越严格的规定如日本对食用动物肌肉中磺胺二甲基喀唳的最大残留限量规定为方法检测低限13.4 阳性结果的确定 样品的 cpm 控制点时，需要重新检测样品及同时测定一 个阴性质控和一个阳性质控，以确定试剂和设备是否工作正常。通常

12、情况下：（1）测试的阴性质控应该是阴性质控平均值 20%（每一试剂盒 都会给出阴性质控平均值，平均值一般为运行三份阴性质控液 的 cpm 值的平均数）。测试的阳性质控应该小于控制点。如果重测样品的 cpm 控 制点且（1）（2）两条件符合，则判定样品阳性。13.5 控制点的建立 在 6 份已知无磺胺类残留的鳗鱼样品中加入测试所要求的抗 生素浓度（参照试剂盒说明书）。按照分析程序运行（见 11313方 法）。得出6 个 cpm 值，计算其平均值。平均值的 130%即为此类 样品的控制点。2 结果与分析 211 抗原抗体竞争性反应标准曲线 将浓度为 1000Mg/L 的多抗标准品添加入阴性鳗鱼样品

13、中，添力口浓度分别为 10、20、30、40、50、80、100 150、200 的利用而发挥抑菌作用后者是微生物生长必需物质叶酸的组成部分自世纪年代研究证明了抑菌的基本结构后相继合成了各种由于其抗菌谱广价格低廉目前仍是兽医临床和畜牧养殖业中最常用的药物添加剂之一但也带来了食品安全和过敏反应尿和造血功能紊乱等副作用如磺胺二甲基喀唳等可能诱发啮齿类动物如鼠的甲状腺增生对其激素样效应和潜在致癌性质正在进一步研究中由于在体内作用和代谢的时间较长通过任何途径摄入的磺胺都有可能在人体中蓄积蓄胺二甲基喀噪等单个的量均不得超过而且伴随兽药残留毒理学的发展和风险分析手段的进步各国对在动物源性食品中的残留限量做

14、出了越来越严格的规定如日本对食用动物肌肉中磺胺二甲基喀唳的最大残留限量规定为方法检测低限Mg/kg,按11313测定步骤检测其 cpm 值，结果如图 1 和图 2。12 3 4 hpfgg/Kg）图2 圾鱼中添加殯胺二甲（旋坦势线 任何受体分析的灵敏度都存在限制，Charm H放射免疫分析 中细菌受体和3H 的磺胺二甲喀噪抗原的量是固定的。从图 1 可以看出，当样品中竞争性磺胺二甲卩密唳浓度达到 50Mg/kg时，浓度继续增加则其竞争效率下降，表现为斜率绝对值变小，cpm 值读数变化很小。抗原质量浓度达到 200Mg/kg时，分析体系已 接近饱和。在磺胺二甲卩密唳添加浓度为 10 50pg/k

15、g的范围内,以质量浓度对数为横坐标，以相应质量浓度的 cpm 数值的相对 值（即其 cpm 读数与阴性样品 cpni 读数的比值，B/Bo）为纵坐 标，得到半对数曲线，如图 2。因为是以细菌细胞壁受体作为抗 原的结合位点，其亲和性不均一，而且抗原抗体反应的复杂性使 得不能得到相关系数很髙的线形拟合，但是从图 2 可以看出在添 加浓度为 10 50 囲/kg的范围内，分析体系是比较灵敏的。根据 实际情况确定检测限时，考虑到分析相对标准偏差，一般要求空 白加标样品与空白样品的 cpm 相对值小于 016,即鳗鱼中磺胺 二甲卩密唳检测浓度须大于 11129Mg/kg0 2.2 特异性验证实验 精品资

16、料推荐 本实验室选取阴性鳗鱼样品，分别加入 13 种磺胺类药物标 准品分别为磺胺甲基（SM1）磺胺二甲基（SM2）、磺胺间甲氧喀噪（SMM）、磺胺间二甲氧喀噪（SDM）、磺胺嗪 0-1-1-1-1 0 50 100 150 200 250 添加浓度（4述）图 1圾鱼0.8 0.6 y=-C.1659x+1.0022 R.9757 的利用而发挥抑菌作用后者是微生物生长必需物质叶酸的组成部分自世纪年代研究证明了抑菌的基本结构后相继合成了各种由于其抗菌谱广价格低廉目前仍是兽医临床和畜牧养殖业中最常用的药物添加剂之一但也带来了食品安全和过敏反应尿和造血功能紊乱等副作用如磺胺二甲基喀唳等可能诱发啮齿类动

17、物如鼠的甲状腺增生对其激素样效应和潜在致癌性质正在进一步研究中由于在体内作用和代谢的时间较长通过任何途径摄入的磺胺都有可能在人体中蓄积蓄胺二甲基喀噪等单个的量均不得超过而且伴随兽药残留毒理学的发展和风险分析手段的进步各国对在动物源性食品中的残留限量做出了越来越严格的规定如日本对食用动物肌肉中磺胺二甲基喀唳的最大残留限量规定为方法检测低限噁啦（SQX）、磺胺甲嗟二瞠（STZ）、磺胺毗唳（SPD）、磺胺 异噁瞠（SIZ）、磺胺甲基异噁瞠（SMZ）、磺胺卩密唳（SD）、磺 胺嗟咀 ST）、磺胺甲氧哒嗪（SMP）、磺胺氯哒嗪（SCP），添 加水平为 50pg/kg,测定加标后 cpm 值，与控制点 c

18、pm 值 1357 相比较，结果添加 13 种磺胺类标准品的样品测定结果阳性率为 100%o另外添加恩诺沙星、新霉素、庆大霉素、链霉素、螺旋 霉素、林可霉素、四环素、氯霉素、红霉素、青霉素 G 的混合标 准品，添加水平为 1000Mg/kg,样品测定结果均为阴性。上述实 验验证了 ChQnn II放射免疫分析法测定鳗鱼中磺胺类残留的特 异性能满足检测要求。2.3 最大残留限量 MRL 验证 现在日本等一些国家把磺胺类最大残留限量从 100Mg/kg 降为50Mg/kg,我们对放射免疫法在此水平的检测灵敏度做了 加标验证。首先按 11315控制点的建立方法确定鳗鱼中磺胺类检 测限为 50 跆/k

19、g 的控制点 cpm 值是 1357o选取阴性样品，添加 13 种磺胺类药物标准品，添加水平分别为 4OMg/kg.50Mg/kg 和 80pg/kg,测定出的 cpm 值与控制点 cpm 值 1357 进行比较。如样品的 cpm 值大于135 乙则结果为阴性；如样品的 cpm 值小 于 1357,则结果为阳性。实验结果如表 1。精品资料推荐 加标水平（Mg/kg）阴性样品加标试验 SD SM1 SM2 SMM SDM SQX STZ SPD SMZ ST SMP SCP SIZ 混标 40 +的利用而发挥抑菌作用后者是微生物生长必需物质叶酸的组成部分自世纪年代研究证明了抑菌的基本结构后相继合

20、成了各种由于其抗菌谱广价格低廉目前仍是兽医临床和畜牧养殖业中最常用的药物添加剂之一但也带来了食品安全和过敏反应尿和造血功能紊乱等副作用如磺胺二甲基喀唳等可能诱发啮齿类动物如鼠的甲状腺增生对其激素样效应和潜在致癌性质正在进一步研究中由于在体内作用和代谢的时间较长通过任何途径摄入的磺胺都有可能在人体中蓄积蓄胺二甲基喀噪等单个的量均不得超过而且伴随兽药残留毒理学的发展和风险分析手段的进步各国对在动物源性食品中的残留限量做出了越来越严格的规定如日本对食用动物肌肉中磺胺二甲基喀唳的最大残留限量规定为方法检测低限50 +80 +2.4 实测结果分析 我们应用本方法对 600 余份鳗鱼样品进行了磺胺类的初筛

21、 分析，筛选水平为 50 昭/kg,对其中筛选阳性的 4 份鳗鱼进行 HPLC/UV的分析，均未检出磺胺类残留，可见初筛有假阳性 可能。原因可能是鳗鱼生长的环境复杂如：水源、土池的土壤、饲料、用来杀菌的中药等干扰物质造成的影响。另取十份初筛阴 性的样品，经 HPLC/UV确认均为阴性，假阴性率为 0%。3 结论 应用 ChQnn II放射免疫分析方法测定鳗鱼样品的磺胺类药 物残留，该检测方法可靠，灵敏度髙，特异性强，快速简便，达 到了日本、欧美等国磺胺类最大残留限量的检测要求，能够进行 大批量样品的初筛。但是，该检测方法检测结果有假阳性的可能,因此，初筛阳性的样品必须用其它方法确证。福建省是中

22、国最大 的出口鳗鱼养殖、加工基地，年产量近七万多吨，占世界鳗鱼产 量的三分之一。作为福建经济的支柱产业，鳗鱼的出口却受到了 农兽药残留问题的考验。恩诺沙星、孔雀石绿残留等事件造成的 损失还历历在目。Charm II放射免疫分析方法作为目前一种快 捷可靠的检测手段，是目前福建大批量出口鳗鱼中磺胺类药物 残留的初筛方法，值得进一步研究应用。的利用而发挥抑菌作用后者是微生物生长必需物质叶酸的组成部分自世纪年代研究证明了抑菌的基本结构后相继合成了各种由于其抗菌谱广价格低廉目前仍是兽医临床和畜牧养殖业中最常用的药物添加剂之一但也带来了食品安全和过敏反应尿和造血功能紊乱等副作用如磺胺二甲基喀唳等可能诱发啮齿类动物如鼠的甲状腺增生对其激素样效应和潜在致癌性质正在进一步研究中由于在体内作用和代谢的时间较长通过任何途径摄入的磺胺都有可能在人体中蓄积蓄胺二甲基喀噪等单个的量均不得超过而且伴随兽药残留毒理学的发展和风险分析手段的进步各国对在动物源性食品中的残留限量做出了越来越严格的规定如日本对食用动物肌肉中磺胺二甲基喀唳的最大残留限量规定为方法检测低限