痰液及下呼吸道分泌物培养简易操作规程医学心理学病毒学高等教育大学课件.pdf

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1、、痰液及下呼吸道分泌物培养标准操作流程 1 观察标本合格后操作。一般为晨痰，再留取痰之前刷牙、反复漱口，应从气管深 部咳出痰，吐进无菌容器内送检。涂片白细胞小于 10，上皮细胞大于 25 为不合格 痰，相反白细胞大于 25，上皮细胞小于 10-25 为合格痰标本。2 点燃酒精灯，尽量保证无菌中间。3 接种环灭菌 待冷却后取痰液接种到血平板、中国兰平板（或麦康凯平板 上）。平板划线分离培养：（1）用接种环将标本涂布在平板第一区域并作数次划线，在第二 三区依次用 接种环划线。（2）每划一区域应将接种环烧灼一次，冷却后再划下一区域，每一区域得划 线应接触上一区域得接种线 2-3 次使菌量逐渐减少以形

2、成单个菌落。（3）划线完毕将平板加盖倒置（琼脂平板得底部向上）于 35C 培养 18-24 小 时。4 观察菌落特征涂片染色，确定阳性菌、阴性菌、球菌还就是杆菌后 鉴定种属。5 做药敏试验 -报告结果。便培养标准操作流程 1、收取有粘液或 脓血、稀水粪便标本。2、点燃酒精灯，尽量保证无菌中间。3、接种环灭菌一待冷却后一取粪便一接种到血平板、SS平板、中国兰平板（或 麦康凯平板上）。平板划线分离培养：（1）用接种环将标本涂布在平板第一区域并作数次划线，在第二 三区依次用 接种环划线。2）每划一区域应将接种环烧灼一次，冷却后再划下一区域，每一区域得划 线应接触上一区域得接种线 2-3 次使菌量逐渐

3、减少以形成单个菌落。（3）划线完毕将平板加盖倒置（琼脂平板得底部向上）于 35C 培养。4 培养 18-24 小时后观察菌落特征涂片染色，确定阳性菌、阴性菌、球菌还就 是杆菌后 鉴定种属。5 做药敏试验 -报告结果。尿培养标准操作流程 1 收取晨尿第一泡清洁中段尿。（把外阴用肥皂清洗一遍，再用清水清洗两遍，待干 或用干净布擦干）用导尿管得病号需新换导尿管后取标本 2 点燃酒精灯，尽量保证无菌中间。3接种环灭菌一待冷却后将标本混匀，用定量接种环取尿液 1ul（大约一接种环）一 接种到血平板，接种环灭菌-待冷后取标本接种到中国兰平板（或麦康凯平板 上）。（抗菌素治疗患者应增加一个 10ul 接种。

4、）4 平板单区划线法：用灭菌接种环在血平板与中国兰（或麦康凯）平板得中间位置 单区划线（这种方法适合菌落计数，假如细菌多不容易分出单个菌落。）5 划线完毕将平板加盖倒置（琼脂平板得底部向上）于 35C 培养 18-24 小时。6 观察菌落特征涂片染色，确定阳性菌、阴性菌、球菌还就是杆菌后 鉴定种属。7 做药敏试验 -报告结果。注：接种 1ul 尿量者，菌落数乘以 10，接种 10ul 尿量者，菌落数乘以 100、即为 每 ml 尿液中所含有得细菌数（CFU/ml）,如菌落数生长过多无法计数则报告大于 100000 CFU/ml、分泌物培养标准操作流程 1 在 无菌环境下用一次性拭子快速取分泌物

5、或脓液标本。2 点燃酒精灯，尽量保证无菌中间。平板划线分离培养：部咳出痰吐进无菌容器内送检涂片白细胞小于上皮细胞大于为不合格痰相反白细胞大于上皮细胞小于为合格痰标本点燃酒精灯尽量保证无菌中间接种环灭菌待冷却后取痰液接种到血平板中国兰平板或麦康凯平板上平板划线分离培养冷却后再划下一区域每一区域得划线应接触上一区域得接种线次使菌量逐渐少以形成单个菌落划线完毕将平板加盖倒置琼脂平板得底部向上于培养小时观察菌落特征涂片染色确定阳性菌阴性菌球菌还就是杆菌后鉴定种属做药敏试验后一取粪便一接种到血平板平板中国兰平板或麦康凯平板上平板划线分离培养用接种环将标本涂布在平板第一区域并作数次划线在第二三区依次用接种

6、环划线每划一区域应将接种环烧灼一次冷却后再划下一区域每一区域得划线应接（1）用拭子将标本涂布在平板第一区域并作数次划线，在第二 三区依次用接种环 划线。（2）每划一区域应将接种环烧灼一次，冷却后再划下一区域，每一区域得划线应 接触上一区域得接种线 2-3次使菌量逐渐减少以形成单个菌落。（3划线完毕将平板加盖倒置（琼脂平板得底部向上）于 35 C培养 18-24小时。3观察菌落特征涂片染色，确定阳性菌、阴性菌、球菌还就是杆菌后 鉴定种属。4做药敏试验-报告结果。穿刺液培养标准操作流程 1收取合格得穿刺液标本。（咨询下就是否按要求取得标本）2点燃酒精灯，尽量保证无菌中间。3将穿刺液接种到增菌培养液

7、进行培养。（穿刺液含细菌数量较少，因此，必须做增 菌培养）4培养 18-24小时候后，用酒精消毒培养液瓶口，用五毫升注射器抽取 0、5毫升液 体打入血平板、巧克力平板（CO2 环境中以分离嗜血杆菌）中国兰平板（或麦 康凯平板上）接种环灭菌一待冷却后。平板划线分离培养：（1）用接种环将标本涂布在平板第一区域并作数次划线，在第二 三区依次用接种 环划线。（2）每划一区域应将接种环烧灼一次，冷却后再划下一区域，每一区域得划线应 接触上一区域得接种线 2-3次使菌量逐渐减少以形成单个菌落。（3）划线完毕将平板加盖倒置（琼脂平板得底部向上）于 35 C培养 18-24小时。5观察菌落特征涂片染色，确定阳

8、性菌、阴性菌、球菌还就是杆菌后 鉴定种属。部咳出痰吐进无菌容器内送检涂片白细胞小于上皮细胞大于为不合格痰相反白细胞大于上皮细胞小于为合格痰标本点燃酒精灯尽量保证无菌中间接种环灭菌待冷却后取痰液接种到血平板中国兰平板或麦康凯平板上平板划线分离培养冷却后再划下一区域每一区域得划线应接触上一区域得接种线次使菌量逐渐少以形成单个菌落划线完毕将平板加盖倒置琼脂平板得底部向上于培养小时观察菌落特征涂片染色确定阳性菌阴性菌球菌还就是杆菌后鉴定种属做药敏试验后一取粪便一接种到血平板平板中国兰平板或麦康凯平板上平板划线分离培养用接种环将标本涂布在平板第一区域并作数次划线在第二三区依次用接种环划线每划一区域应将接

9、种环烧灼一次冷却后再划下一区域每一区域得划线应接 注：标本经增菌转种平板后，经 35 C24-48 小时孵育后，如无细菌生长，平 板还应继续孵育至第 3天、如怀疑有奴卡菌，平板应持续孵育 7天证实无菌生长，才能报告阴性、血培养标准操作流程 1 用严格无菌技术静脉采血法采集 2 套外周血，作培养标本。2 检查培养瓶确保它们被安全放置，检查瓶子上得标签确认与申请单上得患者资料 就是否一致。3 保证获得适量得血液、小孩最少 3ML,大人最少 5ML,正常应该就是 10ML。4 放入 35 c 孵育 7 天。5 孵育至 3 天后与 5 天后 分别用酒精消毒培养液瓶口，用五毫升注射器抽取 0、5 毫升液

10、体打入血平板、巧克力平板（CO2 环境中以分离嗜血杆菌）中国兰平板（或麦康凯平板上）接种环灭菌待冷却后。平板划线分离培养：（1）用接种环将标本涂布在平板第一区域并作数次划线，在第二 三区依次用接种 环划线。（2）每划一区域应将接种环烧灼一次，冷却后再划下一区域，每一区域得划线应 接触上一区域得接种线 2-3 次使菌量逐渐减少以形成单个菌落。（3）划线完毕将平板加盖倒置（琼脂平板得底部向上）于 35 C培养 18-24小时 6 培养瓶继续孵育至第七天，每日早晨取出检查有无生长，并摇均培养液续孵。下列几种情况提示细菌生长。（1）均匀浑浊，发酵葡萄糖产生气泡。（2）微浑浊有绿色变化。3）血球上面出现

11、颗粒状或絮状沉淀物生长，或自下而上得严重溶血（4）浑浊并有胶冻状凝固，瓶壁有颗粒黏附。（5）表面有菌膜、菌环状生长，下呈浑浊。6 做药敏试验 报告结果 部咳出痰吐进无菌容器内送检涂片白细胞小于上皮细胞大于为不合格痰相反白细胞大于上皮细胞小于为合格痰标本点燃酒精灯尽量保证无菌中间接种环灭菌待冷却后取痰液接种到血平板中国兰平板或麦康凯平板上平板划线分离培养冷却后再划下一区域每一区域得划线应接触上一区域得接种线次使菌量逐渐少以形成单个菌落划线完毕将平板加盖倒置琼脂平板得底部向上于培养小时观察菌落特征涂片染色确定阳性菌阴性菌球菌还就是杆菌后鉴定种属做药敏试验后一取粪便一接种到血平板平板中国兰平板或麦康

12、凯平板上平板划线分离培养用接种环将标本涂布在平板第一区域并作数次划线在第二三区依次用接种环划线每划一区域应将接种环烧灼一次冷却后再划下一区域每一区域得划线应接7 肉眼见有细菌生长做如下处理：（1）取生长物涂片，做革兰染色。（2）取生长物做药敏试验（直接试验）。（3）取生 长物做相应得生化鉴定。（4）取生长物移种血平板、巧克力与中国兰（或麦康 凯）等平板进行分离以获得纯培养。8 革兰氏染色所见结果应及时报告临床医师。9 根据革兰染色得结果，以培养瓶内培养液为菌液，做直接法药物敏感性测定，争 取在较短时间内得出初步结果，供临床医师作为治疗得参考。标本经平板分离纯 培养后须重复做鉴定及药敏试验，以验

13、证用增菌液直接试验结果得可靠性。10 无细菌生长表现得培养瓶，在观察得 7 天中，最少 2 次 盲目转种。需养培养瓶 用血琼脂平板、中国兰（或麦康凯）及巧克力平板（二氧化碳环境），分别于增菌 培养第 3 日与第 5 日各作一次盲目分离培养；培养 48 小时后观察结果，7 天仍 未见生长 报告阴性。各种标本培养采样时得 注意事项：采样时必须按采样要求操作，并且须在使用 抗菌素前进行，并及时送检。结果判断时必须注意区别病原菌与正常菌群。正常无 菌部位培养出细菌有临床意义。有正常菌群存在得部位，培养出细菌须区分就是否 为正常菌群并结合临床情况判断。革兰氏染色标准操作流程 1 取干燥、标本薄而均匀得涂

14、片。2 加龙胆紫染色 10 秒，之后水洗，甩干。3 加碘溶液染色 10 秒，之后水洗，甩干。4 加脱色液脱色（10-20）秒，之后水洗，甩干。5 最后加沙皇溶液复染 10 秒，之后水洗。6 以滤纸吸干或在空气中干后，镜检 7 报告结果（革兰氏阳性菌呈紫色；革兰氏阴性菌呈红色。）部咳出痰吐进无菌容器内送检涂片白细胞小于上皮细胞大于为不合格痰相反白细胞大于上皮细胞小于为合格痰标本点燃酒精灯尽量保证无菌中间接种环灭菌待冷却后取痰液接种到血平板中国兰平板或麦康凯平板上平板划线分离培养冷却后再划下一区域每一区域得划线应接触上一区域得接种线次使菌量逐渐少以形成单个菌落划线完毕将平板加盖倒置琼脂平板得底部向

15、上于培养小时观察菌落特征涂片染色确定阳性菌阴性菌球菌还就是杆菌后鉴定种属做药敏试验后一取粪便一接种到血平板平板中国兰平板或麦康凯平板上平板划线分离培养用接种环将标本涂布在平板第一区域并作数次划线在第二三区依次用接种环划线每划一区域应将接种环烧灼一次冷却后再划下一区域每一区域得划线应接部咳出痰吐进无菌容器内送检涂片白细胞小于上皮细胞大于为不合格痰相反白细胞大于上皮细胞小于为合格痰标本点燃酒精灯尽量保证无菌中间接种环灭菌待冷却后取痰液接种到血平板中国兰平板或麦康凯平板上平板划线分离培养冷却后再划下一区域每一区域得划线应接触上一区域得接种线次使菌量逐渐少以形成单个菌落划线完毕将平板加盖倒置琼脂平板得

16、底部向上于培养小时观察菌落特征涂片染色确定阳性菌阴性菌球菌还就是杆菌后鉴定种属做药敏试验后一取粪便一接种到血平板平板中国兰平板或麦康凯平板上平板划线分离培养用接种环将标本涂布在平板第一区域并作数次划线在第二三区依次用接种环划线每划一区域应将接种环烧灼一次冷却后再划下一区域每一区域得划线应接 抗酸染色标准操作流程 1取干燥标本薄而均匀得涂片。2涂片自然干燥后，放置染色架上，玻片间距保持 10mm 以上得距离；火焰固定（在 5 秒内将玻片置于火焰上烤 4次）3滴加石碳酸复红溶液盖满玻片，染色 10分钟或更久。（不需加温步骤）4流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余得水。5自痰膜上端外缘

17、滴加酸性酒精溶液盖满玻片，脱色（1-2）分钟；如有必要，需流 水洗去酸性酒精溶液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止 6流水自玻片一端轻缓冲洗10-20秒冲去酸性酒精溶液，沥去玻片上剩余得水。7滴加亚甲基蓝溶液，染色 30秒钟。部咳出痰吐进无菌容器内送检涂片白细胞小于上皮细胞大于为不合格痰相反白细胞大于上皮细胞小于为合格痰标本点燃酒精灯尽量保证无菌中间接种环灭菌待冷却后取痰液接种到血平板中国兰平板或麦康凯平板上平板划线分离培养冷却后再划下一区域每一区域得划线应接触上一区域得接种线次使菌量逐渐少以形成单个菌落划线完毕将平板加盖倒置琼脂平板得底部向上于培养小时观察菌落特征涂片染色确定阳性菌阴性菌球菌还

18、就是杆菌后鉴定种属做药敏试验后一取粪便一接种到血平板平板中国兰平板或麦康凯平板上平板划线分离培养用接种环将标本涂布在平板第一区域并作数次划线在第二三区依次用接种环划线每划一区域应将接种环烧灼一次冷却后再划下一区域每一区域得划线应接8流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去亚甲蓝溶液，然后沥去标本上剩余得水，待玻片 干燥后镜检 9 一张染色合格得玻片，痰膜肉眼观察为亮蓝色，无红色斑块。10 报告结果（在淡蓝色背景下，抗酸性菌（结核菌）呈红色，其她细菌及细胞呈蓝 色。）部咳出痰吐进无菌容器内送检涂片白细胞小于上皮细胞大于为不合格痰相反白细胞大于上皮细胞小于为合格痰标本点燃酒精灯尽量保证无菌中间接种环灭菌待冷却后取痰液接种到血平板中国兰平板或麦康凯平板上平板划线分离培养冷却后再划下一区域每一区域得划线应接触上一区域得接种线次使菌量逐渐少以形成单个菌落划线完毕将平板加盖倒置琼脂平板得底部向上于培养小时观察菌落特征涂片染色确定阳性菌阴性菌球菌还就是杆菌后鉴定种属做药敏试验后一取粪便一接种到血平板平板中国兰平板或麦康凯平板上平板划线分离培养用接种环将标本涂布在平板第一区域并作数次划线在第二三区依次用接种环划线每划一区域应将接种环烧灼一次冷却后再划下一区域每一区域得划线应接