生物技术制药复习重点中学教育高考中学教育中学课件.pdf

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1、第一章 生物技术 biotechnology又称生物工程bioengineering，指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术。基因工程 genetic engineering也称遗传工程，是现在生物技术的核心和主导。主要原理是应用人工方法将生物的遗传物质，通常是DNA 分离出来，在体外进行切割、拼接和重组，然后将重组了的 DNA 导入某种宿主细胞或个体，从而改变它们的遗传品性；有时还使新的遗传信息在新的宿主细胞或个体中大量表达，以获得基因产物(多肽或蛋白质)。(DNA 重组技术

2、，分子杂交技术，基因操作)细胞工程 cell engineering 指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖，或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育动植物个体，或获得某种有用的物质的过程。发酵工程 fermentation engineering 是通过现代技术手段，利用微生物的特殊功能生产有用的物质，或直接将微生物应用于工业生产的一种技术体系。酶工程 enzyme engineering 是利用酶或细胞所具有的特异催化功能，或对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术。抗体工程 antibody en

3、gineering是利用细胞生物学或分子生物学手段在体外进行遗传学操作，改变抗体的遗传特性和生物学特性，以获得具有适合人们需要的、有特定生物学特性和功能的新抗体，或建立能稳定获得高质量和产量抗体的技术。生物转化 biotransformation也称生物催化biocatalysis是利用酶或有机体(细胞、细胞器)作为催化剂实现化学转化的过程，是生物体系的酶制剂对外源性底物进行结构性修饰所发生的化学反应。生物技术药物biotechnological drug 是指采用 DNA 重组技术或其他生物技术生产的用于预防、治疗和诊断疾病的药物，主要是重组蛋白或核酸类药物。生物技术药物的特性：(1)理化性

4、质特性：相对分子质量大，结构复杂，稳定性差。(2)药理学作用特性：活性与作用机制明确，作用针对性强，毒性低，体内半衰期短，有种属特异性，可产生免疫原性。(3)生产制备特性：药物分子在原料中含量低，原料液中常存在降解目标产物的杂质，制备工艺条件温和，分离纯化困难，产品易受有害物质污染。(4)质量控制特性：a 质量控制内容的特殊性(质量标准：基本要求、制造、检定等；化学药物的质量标准：性状、鉴别、检查、含量测定等)，b 制造项下的特殊规定，c 检定项下的特殊规定。生物技术制药 biotechnological pharmaceutics 是指利用基因工程、酶工程、发酵工程、细胞工程、蛋白质工程等生

5、物技术，来研究、开发和生产用于预防、治疗和诊断疾病的药物。第二章 基因工程技术：基因工程技术又叫基因拼接技术或 DNA 重组技术。将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌；实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。补料分批培养：补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。连续培养：连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。透析培养技术：透析培养技术是利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离，其主要目

6、的是通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。高密度发酵：是指培养液中菌体的浓度在50gDCW/L 以上，目的是降低成本，提高效率。离子交换层析：是依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。疏水层析：是利用蛋白质表面的疏水区域和固定相上疏水基团之间的相互作用力差异，对蛋白组分进行分离的层析方法。亲和层析：是利用固定化配体与目的蛋白质之间非常特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使结合解除。凝胶过滤层析：是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小对溶液中各组分进行分离的液相层析方法。利用基因工程技术生

7、产药物的优点？答：1 大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用提供有效的保障；2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；3、可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；4、内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；5、可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。基因工程药物制造的主要步骤？答：目的基因的克隆；构建 DNA 重组体；将DNA 重组体转移入宿主菌构建工程菌；工程菌的发酵；外源基因表达产物的分离纯化；产品的检验等。化学合成目的基因的先决条件？答：较小的蛋白质或多肽的编码基因可

8、以采用人工化学合成，其先决条件：已知目的基因的核苷酸序列或蛋白质的氨基酸序列，按相应的密码子推导出 DNA 的碱基序列。人工合成基因的限制有哪些？答：1、不能合成太长的基因，5060 个碱基对；2、人工合成碱基对时，遗传密码的简并会为选择密码带来很大的困难：3、费用高。基因工程宿主菌应满足那些要求？目前应用最广泛的宿主菌有哪些？答：1、容易获得较高浓度的细胞；2 能利用廉价易得的原料；3、不致病、不产生内毒素；4、发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；5、容易进行代谢调控；6、容易进行 DNA重组技术操作；7、产物的产量、产率高，产物容易提取。宿主菌可分两大类：1、原核细胞：大肠杆菌、枯

9、草芽孢杆菌、链霉菌；2、真核细胞：酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞。表达载体须具备哪些条件？常用载体有哪些？答：1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2、具多个限制酶切点，但每种切口最好只有 1个，以便与外源基因连接。3、具有某些标记基因，便于进行筛选。4、所产生的 mRNA 必须有翻译的起始信号。5、具有很强的启动子。6、有很强的终止子。常用载体有：1、细菌细胞的质粒。2、噬菌体载体。真核基因在大肠杆菌中的表达形式？答：有三种形式：融合蛋白的表达形式。(由一段短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的蛋白质,称为融合蛋白)非融合蛋白的表达形式。分泌型表达形式。表达用的酵母菌应满足哪些条件？答：表达用的

10、酵母宿主菌应具备菌体生长力强.菌体内蛋白酶要较弱.菌株性能稳定.分泌能力强。基因工程菌在发酵过程中对发酵罐有哪些要求？答：要提供菌体生长的最适宜条件；培养过程不得污染，保证纯菌培养；培养及消毒过程中不得游离出异物；不能干扰细菌代谢活动。离子交换层析的原理？答：当离子交换剂处于水溶液中时，活性离子可以从活性基因上解离下来，在基质骨架与溶液间自由迁移，并可与溶液间的同性离子，因与活性基因的化学亲和力不同而发生交换，即发生离子交换作用。疏水层析的基本原理？答：蛋白质表面多由亲水基团组成，也有一些疏水性较强的疏水区。在高盐浓度时，蛋白质表面疏水部位的水化层被破坏，暴露出疏水部位，疏水作用增强，与固定相

11、上的疏水基团产生疏水性作用而被吸附；盐浓度降低时蛋白质疏水作用减弱，目的蛋白质被逐步洗脱下来。亲和层析的基本原理？答：通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质(也称载体)上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。(被固定在基质上的分子称为配体，配体与基质共价结合，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。)凝胶过滤层析的优缺点？答：优点：设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、不改变样品生物学活性。缺点：分辨率较低，尤其是相对分子质量相近的分子之间。外源基因在原核生物中表达的重要调控元件：A 启动子 promotor 是 DNA 链上能与 RNA聚合酶结合并起

12、始 mRNA 合成的一段序列，其功能是起始目标基因 mRNA 的合成，是决定外源基因在原核生物中表达效率的关键因素。B 核糖体结合位点：SD 序列。C 终止子：终止子序列 terminator sequence是基因 3-末端能被 RNA 聚合酶识别并停止转录功能的特定 DNA 序列。外源基因在大肠杆菌中的表达方式：a 胞内表达：非融合蛋白的胞内表达和融合蛋白的胞内表达，b 分泌表达：分泌至周质和分泌至胞外。大肠杆菌中外源基因表达效率的影响因素：A外源基因密码子，B、mRNA 结构，C 表达载体，D、外源蛋白稳定性 酵母表达系统的优点：高表达量，高稳定性，翻译后修饰功能，分泌表达。蛋白在酵母表

13、达系统中的影响因素：a 外源基因结构，b 表达形式及信号肽的选择，c 启动子，d 转化子的拷贝数，e 甲醇诱导浓度、时间、温度，f 外源蛋白的降解。基因工程药物的质量控制与小分子药物质量控制相比，不同的方面：A 鉴别方法不同：基因工程药物的 Mr 远大于小分子化学药物。B 鉴定方法不同：基因工程药物结构复杂(空间结构)，需要多种检测方法。C 杂质来源不同：基因工程药物杂质来源于宿主蛋白残留和宿主基因残留。小分子药物杂志来源于合成过程中原料残留、合成副产物和纯化中溶剂残留。D 药物定量方面，基因工程药物定量方法一般采用生化反应的方式。基因工程药物质量控制的项目：a 蛋白含量测定、b 蛋白纯度分析

14、、c 蛋白性质测定、d 生物学效价测定、e 杂质分析等。(1)蛋白质含量测定方法：a.紫外吸收法：280nm 处吸收峰，优点：快速、对蛋白质无破坏性。缺点：不是严格定量，核酸可引起强干扰。b.BCA 法：二辛可宁酸 bicinchoninic acid,在 562nm 处有最大吸收。c.Lowry 法：福林-酚试剂，灵敏，准确度高，操作步骤多，影响因素多。d.考马斯亮兰法：595nm 处有最大吸收。灵敏，操作简单，抗干扰能力弱。e.SDS-PAGE扫描分析法。(2)蛋白质纯度检测的方法：a 电泳法，b 质谱法，c 层析法，d 末端氨基酸残基分析法。SDS-聚丙烯酰胺凝胶法(电泳法)是目前最常用

15、的鉴定蛋白质纯度的方法。第四章 抗体：由 B 细胞接受刺激后分化为浆细胞产生的能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白：具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白。凝集反应：在细菌、红细胞等颗粒性抗原中加入相应抗体，在有适量的电解质存在下，能形成肉眼可见的凝集块，故称为凝集反应。反向被动血凝实验：红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能吸附蛋白质。将抗HBs吸附其上，若待测样品中含有HBsAG，则发生特异性结合而使血细胞凝集。抗体工程制药 antibody engineering pharmaceutics 是指利用基因工程、细胞工程和转基因动物及转基因植物技术生产抗体药物的过程。单克

16、隆抗体 制备流程及其制备原理：单克隆抗体 monoclonal antibody,mAb 简称单抗，是由一个 B 细胞和一个骨髓瘤细胞融合而成的杂交瘤细胞合成及分泌的抗单一抗原表位的特异性抗体。基本原理是用分泌抗体但不能长期培养的B 细胞与能在体外长期培养并可低温保存的肿瘤细胞进行杂交。筛选得到的杂交瘤细胞应该是既能分泌抗体又有瘤细胞的特性，可长期传代培养，又可在液氮中保存的细胞。把这些细胞单克隆化，用单克隆化的杂交瘤细胞进行单克隆抗体的生产。流程：将有用抗原免疫过的淋巴细胞与骨髓瘤用 PEG 进行杂交融合。把融合的细胞在 HAT 培养基上选择出来。将选择后的整合细胞分散，培养成杂交瘤细胞。使

17、能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆化。杂交瘤细胞抗体的性状的鉴定。单克隆抗体的大量制备，一是在培养液中大更是繁殖，二是注入纯系小鼠腹腔中大量繁殖。单克隆抗体的纯化。制备方法：体内诱生法和体外法。抗体的结构：4 条多肽链(2 条相同的重链和 2条相同的轻链)通过二硫键连接而成，为“Y”字形结构。杂交瘤细胞的筛选：HAT 选择性培养基。噬菌体抗菌库技术的筛选方法：(1)固相或液相纯化抗原的筛选：a 将纯化抗原包被在固相介质上(酶标板、免疫试管、亲和层析柱)，然后加入待筛选的噬菌体，洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体。b 将抗原与生物素集团相连，再将其结合在包被有链亲和素的磁珠上对噬

18、菌体进行筛选。(2)全细胞筛选，(3)用切片组织进行筛选 免疫导向疗法为什么没有成功？从哪些方面可以对单克隆抗体进行改造？答：阻碍：A单克隆抗体的均是鼠源性抗体，应用于人体可内可产生人鼠源抗体，加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有 5-6h，难以维持有效药物的作用靶组织时间。B完整的抗体份子 Ig 分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。改造：A降低单克隆抗体的免疫原性。B降低单克隆抗体的相对分子质量.(1)人-鼠嵌合抗体：由人抗体的恒定区与鼠源单抗的可变区融合得到。(2).改型抗体：把鼠抗体的 CDR 序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体 (3)小分子抗体小分子抗体包括

19、：Fab、Fv或 ScFv、单域抗体、最小识别单位。这些部位都可以改造。动物体内诱生法制备单克隆抗体的优缺点 答：优点：简单，比较经济，所得单克隆抗体量较多且效价较高，可有效地保存杂交瘤细胞株和分分离已污染的杂菌的杂交瘤细胞株。缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。鼠源性单克隆抗体改造后的抗体类型及各自的特点？答：人-鼠嵌合抗体：保持鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性，但对人免疫原性大幅下降了。改型抗体：鼠源性单克隆抗体的互补决定区(CDR 区)序列替换人的 Ig 分子中的 CDR序列。基本消除免疫原性。小分子抗体：a)Fab 将 I的重链在铰链区的C 端裂解，获得两个完全相

20、同的抗原结合片段。才铰链区和二硫键相连。有完整的生双价抗体活性，相对分子质量减少为三分之一，排斥反应也降低，人体内很稳定。b)Fv 含有 L 链和 Fd 链一半的 N 端可变区。有完整的抗体相似的结能力，相对分子质量减少为六分之一。单链抗体 scFv：单链易改造；体内半衰期短，免疫原性低；稳定性低，重轻链之间的分子间作用力弱；功能单一，只能与一种抗原特异性结合；亲和力低，稳定性差，体内清除过快。单域抗体：只由一个 CDR 构成。多功能抗体的优点。答：具有高亲和力性能，由于具有多个结合价，可同时与细胞膜上相邻的两个或多个靶抗原结合，与肿瘤细胞表面抗原的多价结合有利于肿瘤的影像分析及治疗。复杂稳定

21、性差药理学稳作用特特活与机制明确针对学强稳毒低体内半衰期短有短种属异可产生免稳疫原体内物分子可产在毒体内料中子含量含液稳常中体内存降解目子含量含液稳标的常中体内存降质第一章技术又称工程指人们以现章技代为短有类出所需品或达到某基因也标遗药传是核药心和是主导常常常特特特要应方法将通以离常来子特特来子常外进常行特切常短割短割常进特稳拼接含重组然后重了入宿细衰胞个从而交细操短有定本种位位条条件下培药性养繁短有殖地稳定品使些按意愿发地改章技又繁变有良创短有性繁造个新加速育动植获得短有料性过酵造个?养?或?加速?又植获?切出稳造个达发料?技?短有良创?所特?所?植?短?料?或?料期?有应用价值的多功能抗体

22、应具备有哪些特征。答：能高选择性，高亲和性地同靶抗原或肿瘤相关抗原结合。在血循环中，与效应细胞或细胞毒触发分子有较低亲和力。应为人源化抗体，最大限度地减少人抗鼠蛋白的排斥反应，使得复给药不受限制。分子应大小适中，既能渗透到肿瘤组织内部，又能保证适当的滞留时间。抗体导向酶-前药疗法中酶和前药有哪些要求？答：对酶的要求：活化酶最好来自非哺乳动物，而人体内不存在相应的类似物，以保证高度的特异性。酶还能通过化学交联与单抗结合，在较长的一段时间内保持稳定性和活性。对前药的要求：前药本身应无活性或活性很低，只能被相应的酶活化为高度扩散性的小分子，以实现在肿瘤组织内的广泛分布和杀伤肿瘤细胞。而且前药还 应具

23、有极短的生物半衰期，避免重新进入循环产生非特异性毒性。基因表达(gene expression)是指细胞在生命过程中,把储存在 DNA 顺序中遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子.生物体内的各种功能蛋白质和酶都是同相应的结构基因编码的。质粒的分裂不稳定：通常将质粒不稳定性分为两类:一类是结构不稳定性,也就是质粒由于碱基突变、缺失、插入等引起的遗传信息变化;另一类是分离不稳定性,指在细胞分裂过程中质粒不能分配到子代细胞中,从而使部分子代细胞不带质粒(即 P-细胞)。在连续和分批培养过程中均能观察到此两类现象发生。一般情况下具有质粒的细胞(即 P细胞)需要合成较多的 DNA、RN

24、A 和蛋白质,因此其比生长速率低于 P-细胞,从而 P-细胞一旦形成能较快速地生长繁殖并占据培养物中的大多数。补料分批培养：发酵培养基发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成需产物。因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。但若因生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的最佳条件要求不同时，则可考虑培养基用分批补料来加以满足。嵌合抗体(chimeric atibody)是最早制备成功的基因工程抗体。它是由鼠源性抗体的

25、V 区基因与人抗体的 C 区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子。因其减少了鼠源成分，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，并有助于提高疗效。悬浮培养：非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。细胞悬浮于培养基中生长或维持。某些贴壁依赖性细胞经过适应和选择也可用此方法培养。增加悬浮培养规模相对比较简单，只要增加体积就可以子。深度超过 5mm，需要搅动培养基，超过 10cm，还需要深层通入 CO2 和空气，以保证足够的气体交换。通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法。贴壁培养：也称为细胞贴壁，贴壁后的细胞呈单层生长，所以此法又叫单层细胞培养。大多数哺乳动物细胞

26、的培养必须采用这种方法。固定化酶：不溶于水的酶。是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产。双功能抗体：将识别效应细胞的抗体和识别靶细胞的抗体联结在一起，制成双功能性抗体，称为双特异性抗体。如由识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞(CTL 细胞、NK 细胞、LAK 细胞)表面分子的抗体(CD3 抗体或 CD16 抗体)制成的双特异性抗体，有利于免疫效应细胞发挥抗肿瘤作用。组织工程：应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识

27、哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。酶的固定化：是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应

28、而符合可持续发展的战略要求 第七章 发酵工程制药 发酵工程的概念 fermentation engineering又称微生物工程，是将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机的结合，利用微生物的特定形状，通过现代工程技术在生物反应器中生产工业原料和工业产品并提供服务的一种技术体系。生物技术的四大支柱：发酵工程、基因工程、细胞工程和酶工程。发酵 fermentation 泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程。即发酵是用生物催化剂使培养物质转化成产品的生物化学反应。生物催化剂 biocatalyst是细菌、放线菌、真菌或其解体产物(如酶)和动植物细胞等。发酵工程制药的基本过程：上游工程、发酵

29、生产、下游工程。微生物发酵生产药物的分类：(1 抗生素类，(2氨基酸类，(3 核苷酸类，(4 维生素类，(5 甾体类激素，(6 多糖类，(7 治疗酶及酶抑制剂。P190 优良菌种的选育：理想的工业发酵菌种的要求：a 遗传性状稳定；b 生长速度快，不易污染；c 目标产物产量尽可能接近理论转化率；d 目标产物最好分泌到胞外；e 尽可能减少类似物的产量；f 其所利用生长的培养基成分简单、价格低廉。菌种选育：经验育种方法有自然选育、诱变育种、杂交育种等；定向育种方法有控制杂交育种、原生质体融合、基因重组等。(1 自然选育 natural screening：微生物不经人工处理可以发生自发突变，利用微生

30、物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离、筛选排除衰退型菌株，从中选出维持或高于原有生产水平菌株的过程。(2 定向培育 directive breeding是指为了获得某些需要性状的品系，在一定的环境条件下长期处理某一微生物群体，同时不断移种，从而积累和选择合适的自发突变体的育种方法。(3 诱变育种 mutation breeding 是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促使其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法从中挑选出少数符合育种目的的突变株。优点：方法简单、快速和收效显著，是目前主要的育种方法之一，在生产中得到广泛的应用。(4 杂交育种 hybridiza

31、tion breeding 指利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，或原核生物的接合、转化和转导等过程，促使两个具不同遗传性状的菌株进行遗传物质交换和基因重组，以获得优良性能或新的品种的生产菌株。是重要的微生物育种手段，具有强的方向性或目的性。(5 原生质体融合 protoplast fusion又称细胞融合 cell fusion，指通过人工手段，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程。是工业微生物育种的重要手段，可使一些未发现有转化、转导和接合现象的原核生物之间及微生物种、属、科间甚至更远缘的微生物细胞间进行融合，获得新物种。菌种保藏：选典型菌种的优良纯种，最好保藏休

32、眠体(分生孢子、芽孢)；创造条件使之成休眠状态；多种不同的手段保藏同一菌种。保藏方法：a.斜面低温保藏法：4 度冰箱，16 个月，适用各类菌种，简便、存活率高，保藏期短、代传次数多、易变异和污染。b.石蜡油封存法：低温 4C/室温、阻氧、灭菌，1-2年中期保藏，适用各大类菌种，不适于分解烃类菌种。c.砂土管保藏法：4C/室温，灭菌干燥真空密封，隔氧、无营养，110 年，常用的长期保藏法，适于产孢子的微生物及行成芽孢的细菌，不适于对干燥敏感的细菌。d.麸皮保藏法：曲法保藏，低温干燥，1 年以上，适于产孢子的霉菌及放线菌，工厂采用较多。复杂稳定性差药理学稳作用特特活与机制明确针对学强稳毒低体内半衰

33、期短有短种属异可产生免稳疫原体内物分子可产在毒体内料中子含量含液稳常中体内存降解目子含量含液稳标的常中体内存降质第一章技术又称工程指人们以现章技代为短有类出所需品或达到某基因也标遗药传是核药心和是主导常常常特特特要应方法将通以离常来子特特来子常外进常行特切常短割短割常进特稳拼接含重组然后重了入宿细衰胞个从而交细操短有定本种位位条条件下培药性养繁短有殖地稳定品使些按意愿发地改章技又繁变有良创短有性繁造个新加速育动植获得短有料性过酵造个?养?或?加速?又植获?切出稳造个达发料?技?短有良创?所特?所?植?短?料?或?料期?e.甘油悬液保藏法：-20度，0.51 年；-70度，10 年。基因工程菌常

34、用保藏法。f.冷冻真空干燥保藏法：冻干法，515 年，适于各类微生物，目前被广泛采用。g.液氮超低温保藏法：-196 度，15 年以上，适用于各类微生物，是目前公认的最有效的长期保藏技术之一。h.宿主保藏法：适于专性活细胞寄生微生物(病毒、立克次体)。发酵设备：发酵罐的基本类型有搅拌釜反应器、鼓泡式反应器、气升式反应器。发酵辅助设备：无菌空气系统、灭菌系统、发酵车间的管道及阀门等。发酵过程中的中间分析项目：产物产量：通过监测产物产量判断发酵结果，化学测定法。PH 值：代谢产物影响培养液 pH 值，通过培养基中的组分维持合适的 pH 值，或通过人工方法进行调节。糖：糖的消耗反应菌体代谢活力的变化

35、。通过糖量测定，间接推测产物生物合成效率。氨基氮：通过测定游离氨基酸的数值，侧面反应微生物含氮物质的代谢，推测发酵情况。菌丝形态：通过检测菌丝形态，监测微生物生长状态，及时调整发酵策略。发酵过程的影响因素及控制：(1、菌体浓度的影响及控制：菌体浓度是指单位体积培养液中的菌体含量。菌体浓度对发酵产物的影响：a 适当生长速率下，产物的产率和菌体浓度成正比;b 菌体浓度过高，使营养物质消耗过快，有毒物质积累，溶解氧减少，抑制产物生成;c 菌体浓度过低，产物生成减少。菌体浓度的控制：通过控制培养液中营养基质的浓度。基础培养基各成分要有适当配比。通过中间补料调整培养基成分，如当菌体浓度太低时，可补加一部

36、分磷酸盐和碳源促进生长。(2、营养物质对发酵的影响及控制：a 碳源：速效碳源：迅速被利用，有利于菌体生长，如葡萄糖、枸橼酸。迟效碳源：缓慢被利用，有利于次生代谢产物的合成，如淀粉多糖、乳糖、油脂。常用含有两种碳源的培养基进行控制。B 氮源：速效氮源：迅速被利用，有利于菌体生长，如玉米浆，氨基态氮的氨基酸。迟效氮源：缓慢被利用，有利于次生代谢产物的合成，如黄豆饼粉。用含有两种氮源的培养基进行控制。C 磷酸盐：对初级代谢产物，磷酸盐通过促进细菌生长对产物生成进行调节。对次级代谢产物，常采用生长亚适量的磷酸盐，提高产物生成。D 补料的控制：在发酵过程中，通常补加基质和前体，促进产物合成。作用：避免菌

37、体过度衰老，使产物合成期延长。控制 pH 值和代谢方向。补足发酵液体积，改善通气。(3 温度的影响及控制：发酵热=生物热+搅拌热-蒸发热-辐射热-显热 影响：a 影响酶的反应速率。b 影响代谢调控机制。c 通过改变发酵液的物理性质影响产物合成。温度的控制：A 在发酵不同阶段，采用不同温度:初期提高温度，促进菌体生长;中期降低温度，促进产物合成;后期提高温度，节省发酵时间。B 针对不同条件，采用不同温度：通气差，培养基稀薄时，降低温度；通气好，培养基影响丰富时，升高温度；菌体生长快时，维持较短时间高温；菌体生长慢时，维持较长时间高温。(4、PH 值的影响及控制：对发酵的影响：影响酶的活性；影响膜

38、通透性；影响中间成分和代谢物的解离；改变代谢途径。碳源过多，pH；氮源过多，pH PH 的控制：a 调节培养基组分，增加缓冲体系；b 补料；c 补加酸碱。(5、溶氧的影响及控制：需氧发酵，溶氧最易成为限制因素。溶解氧作为发酵中氧是否足够的度量。发酵过程中，应保持在临界氧浓度以上。溶解氧的变化及原因：A 异常下降的原因：a 染好气性杂菌、b 菌体代谢异常、c 机械设备故障、d 控制系统变化。B 异常升高的原因：污染烈性噬菌体。溶氧的控制：a 调节搅拌转速和通气率，b 控制菌体浓度，使细菌比生长速率略高于临界值(菌体浓度增加，导致耗氧量增加，氧传递速率减少)。(6、CO2 的影响及控制：CO2 对

39、发酵的影响：a CO2 及 HCO3-影响细胞膜的结构：浓度过高将降低细胞膜的运输效率，抑制细胞生长。b 降低发酵液 pH 值，使溶氧下降等。CO2 的控制：a 控制通气量、b 控制搅拌速度、c 控制补料工艺。(7 泡沫的影响及控制：泡沫对发酵的影响：a 降低生产能力、b 引起“逃液”、c 影响细菌呼吸、d 使发酵液菌体量减少、e 增加染菌机会、f 消泡剂带来提取工艺的困难。泡沫的消除：a 机械消沫；b 消泡剂消沫(8、染菌对发酵的影响：染菌的危害：a 影响产量和产品质量、b 倒罐、c 停产。控制：a设备无渗漏、b 管道系统无渗漏、c 空气净化系统正常。基因诊断(gene diagnosis)

40、：是在基因水平上对疾病或人体状态进行诊断的一种新的诊断疾病的方法，它包括产前诊断。DNA 指纹(DNA finger-printing)：1985 年英国学者发现人类基因组中存在高度可变的 小卫星区域，在同一酶降解物的 Southern印迹图上同一个体的不同组织来源的 DNA 的谱带完全一致，而不同个体之间(除非同卵双生)谱带都不相同，如同人的指纹一样具有高度个体特异性，因此这种 Southern印迹图称为 DNA 指纹或基因指纹。活载体疫苗(Live recombinant vaccine)：以病原弱毒或无毒株为载体，插入外源抗原基因构建成重组活病毒载体，通过感染使载体病毒获得表达外源基因的

41、新特性。核酸疫苗(fnucleic acid vaccinel)：是控制感染因子的一种新型疫苗，包括 DNA 和 RNA 疫苗。通过 DNA 重组技术把编码病原体保护性抗原的基因克隆入真核表达载体中。构建核酸疫苗的载体主要有重组质粒型载体和病毒载体。核酸疫苗进入机体的核酸疫苗不与宿主细胞染色体整合，但它能够表达保护性抗原蛋白，刺激机体产生特异性免疫应答，进而使机体产生特异性抗感染免疫力。简述你对基因诊断的概念的理解 答：基因诊断的概念界定以下 6 个方面内容。(1)诊断水平是基因水平，不是分子、细胞、器官或整体水平。(2)诊断技术是分子生物学技术，从方法上来说，没有特殊的基因诊断方法，就是分子

42、生物学技术在临床上的应用。(3)诊断材料是 DNA 或 RNA。(4)诊断内容对内源性基因来说，基因结构和表达是否异常；对外源性基因来说：入侵基因的种类，是病毒核酸，细菌质粒还是寄生虫DNA。(5)诊断途径：直接检查基因结构，是否存在：DNA 点突变、缺失、插入、基因重排或染色体畸变；mRNA 剪接缺失、错位、结构变化等。检查基因转录产物 mRNA:a.已经转录还是没有转录？应该转录还是不应该转录？转录正常，过量还是过少？检查基因表型：正常还是异常，进行分析研究。(6)诊断目的：确诊相应疾病或得出相应结论。是防治疾病或基因治疗的根据。简述基因诊断的基本途径 答：据临床诊断的初步结论进行基因诊断

43、，可以：直接探测基因结构是否存在突变；检测基因转录产物 mRNA 是否表达异常。简述基因诊断的基本技术和方法 答：核酸分子杂交，聚合酶链式反应，单链构象多态性，限制酶酶谱分析，DNA序列测定，DNA 芯片技术。简述活载体疫苗病毒载体分类 答：(1)复制缺陷性载体病毒。只有通过特定转化细胞的互补作用或通过辅助病毒叠加感染才能产生传染性后代，故无排毒的隐患，同时又可表达目的抗原，产生有效的免疫保护。(2)具有复制能力的病毒。如疱疹病毒、腺病毒和痘病毒都可作为外源基因的载体而保持其传染性。简述活载体疫苗优点与缺点 答：优点：可同时启动机体细胞免疫和体液免疫，可同时构成多价以至多联疫苗。疫苗用量少，免

44、疫保护时间长，不需添加佐剂，不影响该病的监测和流行病学调查。缺点：重组病毒毒力会增强，疫苗病毒可能进化出对人类有致病性的新病毒，活载体疫苗在第 2 次免疫时还会诱发针对载体的排斥反应 简述影响核酸免疫效果的主要因素 答：目的基因的选择；载体质粒及启动复杂稳定性差药理学稳作用特特活与机制明确针对学强稳毒低体内半衰期短有短种属异可产生免稳疫原体内物分子可产在毒体内料中子含量含液稳常中体内存降解目子含量含液稳标的常中体内存降质第一章技术又称工程指人们以现章技代为短有类出所需品或达到某基因也标遗药传是核药心和是主导常常常特特特要应方法将通以离常来子特特来子常外进常行特切常短割短割常进特稳拼接含重组然后

45、重了入宿细衰胞个从而交细操短有定本种位位条条件下培药性养繁短有殖地稳定品使些按意愿发地改章技又繁变有良创短有性繁造个新加速育动植获得短有料性过酵造个?养?或?加速?又植获?切出稳造个达发料?技?短有良创?所特?所?植?短?料?或?料期?子的选择；接种方法及途径；接种部位的预处；接种剂量和次数；增强剂和佐剂的应用；实验动物年龄和品系的影响。简述核酸疫苗的应用范围 答：病毒感染性疾病的核酸疫苗；非病毒微生物感染性疾病的核酸疫苗；寄生虫核酸疫苗；肿瘤核酸疫苗。试论基因诊断方法与传统疾病诊断方法的区别与联系？答：传统疾病的诊断方法可以称为表型诊断。表型诊断与基因诊断的区别如下：表型诊断 基因诊断 诊断

46、依据 疾病表型变化 基因结构异常和表达异常 分类 临床诊断、血清学诊断、生化学诊断 DNA 诊断、RNA 诊断 特异性 表型改变在很多情况下是非特异性往往难以明诊断延误病情,如 FOU。以探测基因为目标，属病因诊断，只要有特异性的探针，用分子杂交原理，即可诊断,具有特异性。敏感性 难以评估.。探针可用“放标”或“非放标”，诊断灵敏度高，标本只需微量，DNApg 水平即可 早期诊断 因为表型改变往往出现较晚难以早期诊断。在表型改变之前，基因结构 或表达已发生改变，故可早期诊断。诊断范围 难以评估 原因参下述 试述核酸疫苗诱导免疫反应的机理 答：核酸疫苗通过肌肉注射或基因枪导入机体后，或是被局部的

47、上皮细胞、肌细胞通过内吞的方式将质粒 DNA 摄入胞内表达；或是 DNA直接被组织局部的抗原提呈细胞(APC)吞入。未被摄取的游离 DNA 多数可被降解，少数可能随循环系统而进入淋巴结或脾中，被那里的APC 摄取进入下一步的表达、加工和抗原提呈阶段。外源性抗原被 APC 吞入后进入内体，并在其中部分降解而仅保留特异的短的抗原肽。这些抗原肽与主要组织相容性复合体(MHC)结合，形成抗原肽一 MHC与抗原肽一 MHC类分子复合物。它们被提呈于 APC表面或细胞膜表面，在 IL4、IL12、IL2、IFN 等因子的共同作用下，特异激活 CD4TH 细胞和 CD8T 细胞，从而诱发体液和细胞免疫应答，

48、产生免疫记忆，达到对感染性疾病的预防作用。定点突变的三种方法：寡核苷酸引物介导：优点是保真度高；缺点是操作过程复杂、周期长，而且在克隆待突变基因时会受到限制性酶切位点的限制。PCR 介导：优点是操作简单，突变的成功率可达 100%。缺点：1.后续工作较复杂，PCR扩增产物通常需要连接到载体分子上，然后才能对突变的基因进行转录、翻译等方面的研究；2.不论是用普通的Taq DNA 聚合酶还是高保真的 Pfu 酶，PCR 方法产生的 DNA 片段都要经过核苷酸序列测定，方可确证有无发生其它突变发生。盒式突变法：优点是简单易行、突变效率高，还可以在一对限制酶切位点内一次突变多个位点；缺点是合成多条引物

49、的成本较高。另外，在一般情况下，在靶 DNA 片段的两侧往往难以满足存在一对限制性酶切位点的要求，限制了该方法的广泛应用。然而一旦具备了这样的条件，该方法则为首选。广义基因治疗包括：基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活、引入新基因等。生物发生器的三种类型：按照装置的结构分为热管式生物反应器、空间旋转式生物反应器和膜式生物反应器等。根据外源基因表达产物在转基因动物中来源不同分为动物乳腺生物反应器，动物血液生物反应器，动物膀胱生物反应器。可以用于乳腺生物发生器的动物比较：奶牛奶山羊兔猪灵长类 5.(1982 年)临床应用的第一个蛋白质药物(胰岛素)。6.基因工程疫苗包括：重组抗原疫苗、重组载体疫

50、苗、DNA 疫苗、转基因植物疫苗。基因治疗 gene therapy：基于修饰活细胞遗传物质而进行的医学干预。细胞可以体外修饰,随后再注入患者体内；或将基因治疗产品直接注入患者体内,使细胞内发生遗传学改变。这种遗传学操纵的目的：预防、治疗、治愈、诊断或缓解人类疾病。反义技术 antisense technology：是采用反义核酸分子（人工合成或生物合成的 DNA 或RNA，它们能与 DNA、RNA 互补）抑制、封闭或破坏与疾病发生相关的靶基因表达的一种手段。具有特异性且操作简单，可用于治疗由于基因突变过度表达所致的肿瘤和遗传疾病以及抗病毒治疗。转基因动物 transgenic animal：