生物化学实验指导中学教育中学实验中学教育中学课件.pdf

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1、生物化学实验指导 一、实验内容 在网络课件中所给的六个具体实验中，至少完成其中血清蛋白质的盐析与双缩脲法定量、血清蛋白的醋酸纤维膜电泳两个实验，其它为选做实验。二、实验要求 （一）理论部分 明确实验目、原理、操作关键步骤及注意事项，掌握生物化学实验基本知识和技能。（二）实验部分 1原始记录 实验中要仔细观察，如实记录实验现象。实验记录要真实、准确、清晰、完整，不得随意涂改数据。内容包括：实验名称、目的及要求、实验原理、所用仪器和试剂、实验方法步骤、观察到的现象等。2实验报告 每次实验完成后，要求写出实验报告。实验报告要求文字清楚有条理，语言简洁扼要。报告的内容包括：实验名称、实验目的、方法原理

2、、实验步骤（可用流程示意图，要求简明扼要）、原始数据和现象记录、计算结果、结论（简明扼要）、讨论（用所学理论知识对实验现象和结果的分析和解释、对所做实验的小结、改进意见等）。注：实验成绩占课程总成绩的20%。实验报告格式请到：网院主页-教学服务-教务表格中下载。实验一 基本操作 一、要求 1熟悉实验室规则及常用生化仪器；2清点洗刷实验用具；3掌握各种仪器的正规操作及维护。二、实验内容 1常用生化仪器 烧杯（beaker）试管（test tube）NPN管（NPN tube）：带有 3.5，5，10ml 刻度，用于血中非蛋白质（nonprotein nitrogen）的测定。离心管（centri

3、fuge tube）吸量管（pipet）刻度吸量管（scaled pipet）其上部的标志彩环与其容量的关系：红色单环：0.1，5ml 量血清蛋白的醋酸纤维膜电泳两个实验其它为选做实验二实验要求一理论部分明确实验目原理操作关键步骤及注意事项掌握生物化学实验基本知识和技能二实验部分原始记录实验中要仔细观察如实记录实验现象实验记录要真实准确实验报每次实验完成后要求写出实验报实验报要求文字清楚有条理语言简洁扼要报的内容包括实验名称实验目的方法原理实验步骤可用流程示意图要求简明扼要原始数据和现象记录计算结果结论简明扼要讨论用所学理论知识对实验学服务教务表格中下载实验一基本操作一要求熟悉实验室规则及常用

4、生化仪器清点洗刷实验用具掌握各种仪器的正规操作及维护二实验内容常用生化仪器烧杯试管管带有刻度用于血中非蛋白质的测定离心管吸量管刻度吸量管其上部 红色双环：0.5ml 黑色单环：0.2,2ml 黄色双环：1ml 桔色单环：10ml 奥氏吸量管（Ostwald-Folin pipet）滴管（dropper）搅棒（Stirring rod）漏斗（funnel）枪式移液器（pipettman）及其配适吸头（tips）混匀器（vortex）恒温水浴箱（water bath）离心机（centrifuge）分光光度计（spectrophotometer）点收仪器：根据仪器清单，逐项查点是否完好（如有缺损向教

5、师声明及时补充更换）。本套仪器由本人使用保管到全部实验课程结束。2玻璃仪器的洗涤 量血清蛋白的醋酸纤维膜电泳两个实验其它为选做实验二实验要求一理论部分明确实验目原理操作关键步骤及注意事项掌握生物化学实验基本知识和技能二实验部分原始记录实验中要仔细观察如实记录实验现象实验记录要真实准确实验报每次实验完成后要求写出实验报实验报要求文字清楚有条理语言简洁扼要报的内容包括实验名称实验目的方法原理实验步骤可用流程示意图要求简明扼要原始数据和现象记录计算结果结论简明扼要讨论用所学理论知识对实验学服务教务表格中下载实验一基本操作一要求熟悉实验室规则及常用生化仪器清点洗刷实验用具掌握各种仪器的正规操作及维护二

6、实验内容常用生化仪器烧杯试管管带有刻度用于血中非蛋白质的测定离心管吸量管刻度吸量管其上部（1）铬酸洗液的配制 5g K2Cr2O7 置于烧杯，加 H2O 5ml使尽量溶解，缓缓加入浓 H2SO4 100ml，边加边搅拌，待冷却后使用。洗液使用时要注意安全，如不慎溅出应以大量水冲洗，洗液用毕应贮存于专用容器，妥善保存处理。（2）洗涤的要求与步骤 要求：洁净的玻璃器皿表面应不挂任何水滴。步骤：3移液操作 （1）吸量管的使用 量血清蛋白的醋酸纤维膜电泳两个实验其它为选做实验二实验要求一理论部分明确实验目原理操作关键步骤及注意事项掌握生物化学实验基本知识和技能二实验部分原始记录实验中要仔细观察如实记录

7、实验现象实验记录要真实准确实验报每次实验完成后要求写出实验报实验报要求文字清楚有条理语言简洁扼要报的内容包括实验名称实验目的方法原理实验步骤可用流程示意图要求简明扼要原始数据和现象记录计算结果结论简明扼要讨论用所学理论知识对实验学服务教务表格中下载实验一基本操作一要求熟悉实验室规则及常用生化仪器清点洗刷实验用具掌握各种仪器的正规操作及维护二实验内容常用生化仪器烧杯试管管带有刻度用于血中非蛋白质的测定离心管吸量管刻度吸量管其上部吸量管的选择 在一次完成转移的前提下，应选用容量较小的吸量管。对于同一次实验中同一种试剂的移取，应选用同一支吸量管 需精确量取的溶液或粘稠的液体，应选用奥氏吸量管 读数

8、吸量管保持垂直 视红与液面应水平 管中液面与刻度红应呈切红 操作 用洗耳球将液体吸到超过标线 必要时将管尖端外圈试净 调液面到标线 放开食指，使液体流入容器 将最后液滴沿器壁而下或吹出 注：对于刻度由上到下的吸量管应尽量使用上端刻度 管尖残液是否需吹出，看清标记 奥氏吸量管均为吹出式 量血清蛋白的醋酸纤维膜电泳两个实验其它为选做实验二实验要求一理论部分明确实验目原理操作关键步骤及注意事项掌握生物化学实验基本知识和技能二实验部分原始记录实验中要仔细观察如实记录实验现象实验记录要真实准确实验报每次实验完成后要求写出实验报实验报要求文字清楚有条理语言简洁扼要报的内容包括实验名称实验目的方法原理实验步

9、骤可用流程示意图要求简明扼要原始数据和现象记录计算结果结论简明扼要讨论用所学理论知识对实验学服务教务表格中下载实验一基本操作一要求熟悉实验室规则及常用生化仪器清点洗刷实验用具掌握各种仪器的正规操作及维护二实验内容常用生化仪器烧杯试管管带有刻度用于血中非蛋白质的测定离心管吸量管刻度吸量管其上部（2）枪式移液器的使用 枪式移液器的结构 1液体吸放钮 2体积选取钮 3体积显示 4枪头排放钮 5枪头排放器 6枪头接嘴 其内部柱塞分 2 段行程，第 1 档为吸液，第 2 档为放液，手感十分清楚。操作 调体积选取钮到所需值 套上枪头，旋紧 垂直持握枪式移液器外壳，按下大拇指到第 1 档 将枪头插入溶液，徐

10、徐松开大拇指，使其复原 排放时，重新将大拇指按下，到第 1 档后，继续按到第 2 档以排空 注：移取过程中应控制速度，力度 如需移取另一样品，按枪头排主钮，更换枪头 量血清蛋白的醋酸纤维膜电泳两个实验其它为选做实验二实验要求一理论部分明确实验目原理操作关键步骤及注意事项掌握生物化学实验基本知识和技能二实验部分原始记录实验中要仔细观察如实记录实验现象实验记录要真实准确实验报每次实验完成后要求写出实验报实验报要求文字清楚有条理语言简洁扼要报的内容包括实验名称实验目的方法原理实验步骤可用流程示意图要求简明扼要原始数据和现象记录计算结果结论简明扼要讨论用所学理论知识对实验学服务教务表格中下载实验一基本

11、操作一要求熟悉实验室规则及常用生化仪器清点洗刷实验用具掌握各种仪器的正规操作及维护二实验内容常用生化仪器烧杯试管管带有刻度用于血中非蛋白质的测定离心管吸量管刻度吸量管其上部附：吸量器具的校准 吸量管和枪式移液器等仪器常需要校准 具体的方法是：用待校准的移液器移取一定体积的三蒸水或超纯水并用分析天平称出其重量，通过查表得到当时室温下纯水的密度，再折算出其实际体积，与原先移取的体积对照之后，做必要的校准，依此法可检查移液器在不同刻度处的准确度和多次移液操作间的平行性。4混匀 旋转法：手持容器，使溶液作离心旋转 指弹法：一手执试管上端，另一手轻弹试管下部，使其中液体作涡旋运动 搅动法：使用玻璃棒，多

12、用于溶解烧杯中的固体时 混匀器法：将试管置于混匀器的振动盘上，逐渐用下压，使内容物旋转 5加热与保温 保温 使用恒温水浴箱，调节温度设定钮 水浴箱中水要足量 实验过程中应随时监测温度，并及时调节 某些溶液在保温前需预温 6过滤与离心 量血清蛋白的醋酸纤维膜电泳两个实验其它为选做实验二实验要求一理论部分明确实验目原理操作关键步骤及注意事项掌握生物化学实验基本知识和技能二实验部分原始记录实验中要仔细观察如实记录实验现象实验记录要真实准确实验报每次实验完成后要求写出实验报实验报要求文字清楚有条理语言简洁扼要报的内容包括实验名称实验目的方法原理实验步骤可用流程示意图要求简明扼要原始数据和现象记录计算结

13、果结论简明扼要讨论用所学理论知识对实验学服务教务表格中下载实验一基本操作一要求熟悉实验室规则及常用生化仪器清点洗刷实验用具掌握各种仪器的正规操作及维护二实验内容常用生化仪器烧杯试管管带有刻度用于血中非蛋白质的测定离心管吸量管刻度吸量管其上部（1）重力过滤法 （2）离心沉淀法 当颗粒小而不均一，沉淀粘稠或容积小又需精确定量时，往往采用离心沉降法。离心前检查：取出所有套管，起动空载的离心机，看是否转动平稳 检查套管有无软垫，是否完好，内部有无异物 离心管与套管是否匹配 平衡：将一对离心管放入套管，置于天平两侧，用滴管向较轻一侧的离心管与套管之间加水到两侧平衡。（离心管及其内溶液量不能差别过大）离心

14、：将等重的两管置于离心机中的对称位置，调转速调节钮，逐渐增加转速到所需值，计时，离心结束后，将套管中的水倒净，所有套管放回离心机中。思考题：1离心操作的关键是什么？如何才能做到？实验二 分光光度计的使用 一、要求 量血清蛋白的醋酸纤维膜电泳两个实验其它为选做实验二实验要求一理论部分明确实验目原理操作关键步骤及注意事项掌握生物化学实验基本知识和技能二实验部分原始记录实验中要仔细观察如实记录实验现象实验记录要真实准确实验报每次实验完成后要求写出实验报实验报要求文字清楚有条理语言简洁扼要报的内容包括实验名称实验目的方法原理实验步骤可用流程示意图要求简明扼要原始数据和现象记录计算结果结论简明扼要讨论用

15、所学理论知识对实验学服务教务表格中下载实验一基本操作一要求熟悉实验室规则及常用生化仪器清点洗刷实验用具掌握各种仪器的正规操作及维护二实验内容常用生化仪器烧杯试管管带有刻度用于血中非蛋白质的测定离心管吸量管刻度吸量管其上部 1了解分光光度计的工作原理 2掌握分光光度计的使用方法与维护 二、原理 分光光度计是应用分光光度法（却比色法）测定物质含量（即浓度）的装置。在利用比色法调定溶液中某种化学成分时，通常需加入某种显色试剂，以产生有色化合物，其颜色的深浅与待测化学成分的含量成正比。据此对待测物浓度进行测定。与重量分析法、容量分析法相比，其具有操作简便，灵敏度高等优点。分光光度计的工作原理及分光光度

16、法的计算公式都是依据 Lambert-Beer 定律得来的。Lambert 定律：一束单色光在通过一溶液时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱，若溶液的浓度不变，则溶液的厚度愈大，光线强度的减弱也愈显著。Beer 定律：当一束单色光通过一溶液时，若溶液的厚度不变，则溶液浓度愈高，光红强度的减弱也愈显著。即：I 入射光强度 量血清蛋白的醋酸纤维膜电泳两个实验其它为选做实验二实验要求一理论部分明确实验目原理操作关键步骤及注意事项掌握生物化学实验基本知识和技能二实验部分原始记录实验中要仔细观察如实记录实验现象实验记录要真实准确实验报每次实验完成后要求写出实验报实验报要求文字清楚有条理语言简洁扼要

17、报的内容包括实验名称实验目的方法原理实验步骤可用流程示意图要求简明扼要原始数据和现象记录计算结果结论简明扼要讨论用所学理论知识对实验学服务教务表格中下载实验一基本操作一要求熟悉实验室规则及常用生化仪器清点洗刷实验用具掌握各种仪器的正规操作及维护二实验内容常用生化仪器烧杯试管管带有刻度用于血中非蛋白质的测定离心管吸量管刻度吸量管其上部I 透身光强度 T 透光率 OD 光密度 在使用分光光度计时，通常是把溶液厚度固定的，因而可直接通过光密度值表现溶质的浓度。实际工作中常用待测物的纯品，配制不同的浓度，测出光密度，画出浓度对光密度的工作曲线，以此查得未知样品的浓度。还可依据下列公式，对未知样品的浓度

18、通过计算得出：分光光度计的组成主要有这样几个部分：光源：由一只钨灯提任 分光系统：其工作主要由一只棱镜完成，通过调整棱镜的角度，可使折射出的单色光穿过出光狭缝，到达比色杯 比色杯：多为玻璃制成，用来装被测溶液，容积为 3-4ml，光路长 1cm，其两透光面切忌用手去摸，如需擦试，应使用镜头纸或绸布进行。比色杯使用完毕应立即冲净，不可用毛刷试刷 检测系统：主要由硒光电池，微电流计和其间的放大电流组成，它的主要任务是将光信号转变成可在仪表上读出的电信号 配合分光光度计的电流计通常有两排刻度，一排均匀的刻度表示透光率，另一排是通过计算负对数得出的光密度，实际工作中我们主要关心光密度数值。操作过程：量

19、血清蛋白的醋酸纤维膜电泳两个实验其它为选做实验二实验要求一理论部分明确实验目原理操作关键步骤及注意事项掌握生物化学实验基本知识和技能二实验部分原始记录实验中要仔细观察如实记录实验现象实验记录要真实准确实验报每次实验完成后要求写出实验报实验报要求文字清楚有条理语言简洁扼要报的内容包括实验名称实验目的方法原理实验步骤可用流程示意图要求简明扼要原始数据和现象记录计算结果结论简明扼要讨论用所学理论知识对实验学服务教务表格中下载实验一基本操作一要求熟悉实验室规则及常用生化仪器清点洗刷实验用具掌握各种仪器的正规操作及维护二实验内容常用生化仪器烧杯试管管带有刻度用于血中非蛋白质的测定离心管吸量管刻度吸量管其

20、上部打开电源，预热 10 分钟 依次将待测样品放入暗室，盖好暗盒盖 选取波长：调节波长选择钮到所需数值 调 0：将光路开关拨到黑点，调节暗电流旋钮，使电流计指针到透光率 0 调 100%：将空白液置于被测位置，光路开关位于红点，调节光量调节旋钮，使电流计指针到透光率 100，此时光密度为 0 移动定位拉杆，分别测量样品，记录光密度值 注意事项 分光光度计属精密仪器，应精心维护使用，防震、防潮、防腐蚀。比色杯要保持清洁，其透光面不应用手触摸或接触粗糙物体，比色杯中的液体应适量，外壁应用擦净纸擦干，如比色液为强酸强碱，应尽快比色，以防破坏比色杯。比色时间应尽量缩短，以防光电系统疲劳。用后将所有开关

21、、旋钮移到原位，关闭电源，冲洗比色杯。三、仪器 1.815 试管 3 72G分光光度计 5ml 吸量管 2 量血清蛋白的醋酸纤维膜电泳两个实验其它为选做实验二实验要求一理论部分明确实验目原理操作关键步骤及注意事项掌握生物化学实验基本知识和技能二实验部分原始记录实验中要仔细观察如实记录实验现象实验记录要真实准确实验报每次实验完成后要求写出实验报实验报要求文字清楚有条理语言简洁扼要报的内容包括实验名称实验目的方法原理实验步骤可用流程示意图要求简明扼要原始数据和现象记录计算结果结论简明扼要讨论用所学理论知识对实验学服务教务表格中下载实验一基本操作一要求熟悉实验室规则及常用生化仪器清点洗刷实验用具掌握

22、各种仪器的正规操作及维护二实验内容常用生化仪器烧杯试管管带有刻度用于血中非蛋白质的测定离心管吸量管刻度吸量管其上部比色杯 3 洗耳球 2 四、试剂 1有色液：2%硫酸铜（CuSO45H2O）五、操作 1 取试管 3 支，如下表操作：空白 样品 1 样品 2 蒸馏水 5.0 2.5 0 有色液 0 2.5 5.0 混匀，观察颜色 2于 650nm处比色，并记录数值，操作如前所述。3关机，清洗比色杯，倒置于比色杯架上晾干。思考题 1试归纳分光光度计的操作要点。2如何作好分光光度计的维护工作？实验三 血清蛋白的盐析与双缩脲法定量 一、目的 量血清蛋白的醋酸纤维膜电泳两个实验其它为选做实验二实验要求一

23、理论部分明确实验目原理操作关键步骤及注意事项掌握生物化学实验基本知识和技能二实验部分原始记录实验中要仔细观察如实记录实验现象实验记录要真实准确实验报每次实验完成后要求写出实验报实验报要求文字清楚有条理语言简洁扼要报的内容包括实验名称实验目的方法原理实验步骤可用流程示意图要求简明扼要原始数据和现象记录计算结果结论简明扼要讨论用所学理论知识对实验学服务教务表格中下载实验一基本操作一要求熟悉实验室规则及常用生化仪器清点洗刷实验用具掌握各种仪器的正规操作及维护二实验内容常用生化仪器烧杯试管管带有刻度用于血中非蛋白质的测定离心管吸量管刻度吸量管其上部 1熟悉盐析的原理和方法 2掌握双缩脲法测定蛋白质的原

24、理和方法 3了解血清蛋白质含量测定的临床意义 二、原理 在蛋白质溶液中加入中性盐到一定浓度时，蛋白质会沉淀，这种作用称为盐析。其机制与下列因素有关：蛋白质分子表面水化层被破坏，蛋白质分子所带电荷被中和。盐析沉淀的蛋白质，其性质不变，经透析或加水稀释后仍可溶解。盐析是可逆过程。在正常人的血清蛋白中清蛋白占绝大部分，约 60%以上，其余为球蛋白，两者比例为 1.5-2.5:1。在血清中加入硫酸铵到半饱和时，球蛋白可被全部沉淀，而清蛋白保持溶解状态，依此可将清蛋白和球蛋白分离。O O|双缩脲（H2N-C-NH-C-NH2）在碱性溶液中与铜离子作用，可生成以 540nm为最大吸收波长的紫红色化合物，称

25、为双缩脲反应。蛋白质是含有 2 个以上肽键的物质，与双缩脲结构相似，可发生类似反应，颜色的深浅与蛋白质含量成正比，据此可作出蛋白质含量与光密度的关系曲线，并求出未各样品的蛋白质浓度。正常血清中含有多种蛋白质，其总量为 6-8g/100ml，在某些病理情况下可发生改变，如营养不良，肝脏疾患，可因蛋白质合成减少，或肾病综合征，由于蛋白质从尿中流失而降低，而在严重脱水的情况下，由于血液浓缩可致测出的结果增高。量血清蛋白的醋酸纤维膜电泳两个实验其它为选做实验二实验要求一理论部分明确实验目原理操作关键步骤及注意事项掌握生物化学实验基本知识和技能二实验部分原始记录实验中要仔细观察如实记录实验现象实验记录要

26、真实准确实验报每次实验完成后要求写出实验报实验报要求文字清楚有条理语言简洁扼要报的内容包括实验名称实验目的方法原理实验步骤可用流程示意图要求简明扼要原始数据和现象记录计算结果结论简明扼要讨论用所学理论知识对实验学服务教务表格中下载实验一基本操作一要求熟悉实验室规则及常用生化仪器清点洗刷实验用具掌握各种仪器的正规操作及维护二实验内容常用生化仪器烧杯试管管带有刻度用于血中非蛋白质的测定离心管吸量管刻度吸量管其上部三、仪器 试管 6 洗耳球 2 0.1ml 吸量管 1 混匀器 1ml 吸量管 2 72G 分光光度计 5ml 吸量管 2 比色杯 6 四、试剂 10.9%NaCl 2标准蛋白溶液：1.0

27、g 牛血清白蛋白（BSA）/100ml 0.9%NaCl 3双缩脲试剂：1.5g 硫酸铜（CuSO45H2O）6g 酒石酸钾钠（NaKC4H6O64H2O）/500ml 加 10%NaOH 300ml，定容到 1000ml 4未知血清 5稀释血清（1：10）6饱和硫酸铵 五、操作 （一）血清蛋白的盐析 1ml 未知血清加入离心管 量血清蛋白的醋酸纤维膜电泳两个实验其它为选做实验二实验要求一理论部分明确实验目原理操作关键步骤及注意事项掌握生物化学实验基本知识和技能二实验部分原始记录实验中要仔细观察如实记录实验现象实验记录要真实准确实验报每次实验完成后要求写出实验报实验报要求文字清楚有条理语言简洁

28、扼要报的内容包括实验名称实验目的方法原理实验步骤可用流程示意图要求简明扼要原始数据和现象记录计算结果结论简明扼要讨论用所学理论知识对实验学服务教务表格中下载实验一基本操作一要求熟悉实验室规则及常用生化仪器清点洗刷实验用具掌握各种仪器的正规操作及维护二实验内容常用生化仪器烧杯试管管带有刻度用于血中非蛋白质的测定离心管吸量管刻度吸量管其上部逐滴加入饱和硫酸铵 1ml，边加边混匀 （观察现象）室温静置 5，3000rpm，离心 7 将上清小心吸入样品收集管内 （二）血清的定量 1取未知血清 0.1ml，加蒸馏水 0.9ml 混匀作为稀释血清（1：10）。2取大试管 6 支，编号，如下表操作：1 2

29、3 4 5 6 标准蛋白 0 0.2 0.4 0.8-稀释血清-0.5-盐析上清-0.1 0.9%NaCl 1.0 0.8 0.6 0.2 0.5 0.9 双缩脲试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 3混匀：室温静置 20，以 1 号为空白，540nm比色 （三）结果处理 1以蛋白质含量为横坐标，测出的光密度为纵坐标，作出两者的关系曲线。量血清蛋白的醋酸纤维膜电泳两个实验其它为选做实验二实验要求一理论部分明确实验目原理操作关键步骤及注意事项掌握生物化学实验基本知识和技能二实验部分原始记录实验中要仔细观察如实记录实验现象实验记录要真实准确实验报每次实验完成后要求写出实验报实验报要

30、求文字清楚有条理语言简洁扼要报的内容包括实验名称实验目的方法原理实验步骤可用流程示意图要求简明扼要原始数据和现象记录计算结果结论简明扼要讨论用所学理论知识对实验学服务教务表格中下载实验一基本操作一要求熟悉实验室规则及常用生化仪器清点洗刷实验用具掌握各种仪器的正规操作及维护二实验内容常用生化仪器烧杯试管管带有刻度用于血中非蛋白质的测定离心管吸量管刻度吸量管其上部2根据未知管的光密度值，利用上述曲红讦算未知血清的蛋白质浓度。3计算其清蛋白与球蛋白的比值。比值=盐析上清蛋白浓度：（血清蛋白浓度盐析上清蛋白浓度）附：酚试剂法测定蛋白质 一、原理 蛋白质中所含的酷氨酸和色氨酸残基与磷钼钨酸（Folin

31、Ciocrtcau，酚试剂）反应使其中的 MO6+，W6+还原生成钼兰及钨兰的混合物而显蓝色，为使蛋白质分子中的酷氨酸残基及色氨酸残基充分暴露，得以与酚试剂反应提高反应的灵敏性，先用双缩脲试剂的使样品蛋白质变性，放置片刻后再加酚试剂，本方法的优点是灵敏度高，但缺点是各种蛋白质的酪氨酸含量不同，同样重量的蛋白质生色程度不同，因此需用同种蛋白质作为标准。二、仪器 1试管 2吸量管（0.1，1，2，5ml）3分光光度计 三、试剂 1双缩脲试剂 2酚试剂 量血清蛋白的醋酸纤维膜电泳两个实验其它为选做实验二实验要求一理论部分明确实验目原理操作关键步骤及注意事项掌握生物化学实验基本知识和技能二实验部分原始

32、记录实验中要仔细观察如实记录实验现象实验记录要真实准确实验报每次实验完成后要求写出实验报实验报要求文字清楚有条理语言简洁扼要报的内容包括实验名称实验目的方法原理实验步骤可用流程示意图要求简明扼要原始数据和现象记录计算结果结论简明扼要讨论用所学理论知识对实验学服务教务表格中下载实验一基本操作一要求熟悉实验室规则及常用生化仪器清点洗刷实验用具掌握各种仪器的正规操作及维护二实验内容常用生化仪器烧杯试管管带有刻度用于血中非蛋白质的测定离心管吸量管刻度吸量管其上部于 1500ml 烧瓶中加入钨酸钠（NaWO42H2O）100g，钼酸钠（NaMoO42H2O）25g，水 700ml，85%磷酸 50ml，

33、浓 HCl100ml，接冷凝器慢慢回流加热 10 小时，再加 Li2SO4 H2O 150 克及水 50ml，必要时过滤，如显绿色，可加溴水数滴使氧化到溶液呈淡黄色，然后加热除支过剩的溴，冷却后稀释到1000ml，此为贮存液，保存于棕色瓶中，使用时加等量水稀释。3牛血清白蛋白标准液 以 0.9NaCl 配制，浓度为 1mg/ml，冰箱保存。4待检血清样品 三、操作 1取待测血清 0.1ml，加 0.9%NaCl 4.9ml，混匀。2另取试管 2 支，分别加入稀释血清与标准蛋白各 0.1ml，双缩脲试剂4.5ml，混匀后静置 10 分钟。3各加入酚试剂 0.5ml 混匀，静置 30 分钟生色。4

34、以 0.1ml 水，4.5ml 双缩脲试剂及 0.5ml 酚试剂相混合，同样放置 30 分钟，作为空白。5500nm处比色，记录光密度。6计算 实验四 凝胶过滤法分离蛋白质 一、目的 量血清蛋白的醋酸纤维膜电泳两个实验其它为选做实验二实验要求一理论部分明确实验目原理操作关键步骤及注意事项掌握生物化学实验基本知识和技能二实验部分原始记录实验中要仔细观察如实记录实验现象实验记录要真实准确实验报每次实验完成后要求写出实验报实验报要求文字清楚有条理语言简洁扼要报的内容包括实验名称实验目的方法原理实验步骤可用流程示意图要求简明扼要原始数据和现象记录计算结果结论简明扼要讨论用所学理论知识对实验学服务教务表

35、格中下载实验一基本操作一要求熟悉实验室规则及常用生化仪器清点洗刷实验用具掌握各种仪器的正规操作及维护二实验内容常用生化仪器烧杯试管管带有刻度用于血中非蛋白质的测定离心管吸量管刻度吸量管其上部 1初步了解凝胶过滤层析法的简单原理及应用 2初步掌握应用凝胶过滤法分离蛋白质 二、原理 层析法是利用混合物中各组分物理经学性质的差别（如吸附力、溶解度、分子形状、大小和极性等），使各组分以不同的程度分布在两相中，其中固定不动的称为固定相，流经此固定相的液体或气体称为流动相，从而使各组分以不同的速度随流动相向前流动而达到分离的目的，层析法可分为多种类型，包括分配层析，离子交换层析，凝胶过滤层析，亲和层析等。

36、凝胶过滤层析，主要根据混合物中分子的大小及形状不同，在通过凝胶（固定相）时，分子的扩散速率各异而达到分离的目的。凝胶颗粒具有多孔性的网状结构，小分子可以进入凝胶颗粒内部，流程长而移动速率慢（阻滞作用大）；而大分子则被排除在外，沿凝胶间空隙随（流动相）流动，流动短而移动速率快（阻滞作用小），比小分子物质先流出层析床，所以凝胶过滤层析又称为排阻层析，分子筛层析，凝胶过滤法操作简例，且操作条件温和，不易引起生物样品变性失活，分离效果好，故广泛应用于蛋白质、酶、核酸的分离提纯（包括脱盐、浓盐及分子量的测定等）。具有分子筛效应的多孔性网状凝胶都可用于凝胶过滤的支持物，例如淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺和部分解

37、旋的右旋糖甘，此类物质已制成商品，如交联葡聚糖凝胶（商品名 sephadex），它们的分离范围从分子量数百（102）到近亿（10）。各种凝胶都具有一定的交联度和孔径。交联度越小，孔径越大，能进入凝胶的分子就越大，反之亦然，根据交联度高低，sephadex 分为 G10-200，G号越高，凝胶孔径越大。量血清蛋白的醋酸纤维膜电泳两个实验其它为选做实验二实验要求一理论部分明确实验目原理操作关键步骤及注意事项掌握生物化学实验基本知识和技能二实验部分原始记录实验中要仔细观察如实记录实验现象实验记录要真实准确实验报每次实验完成后要求写出实验报实验报要求文字清楚有条理语言简洁扼要报的内容包括实验名称实验目

38、的方法原理实验步骤可用流程示意图要求简明扼要原始数据和现象记录计算结果结论简明扼要讨论用所学理论知识对实验学服务教务表格中下载实验一基本操作一要求熟悉实验室规则及常用生化仪器清点洗刷实验用具掌握各种仪器的正规操作及维护二实验内容常用生化仪器烧杯试管管带有刻度用于血中非蛋白质的测定离心管吸量管刻度吸量管其上部本实验通过 sephadexG50 层析柱，以蒸馏水为流动相，分离血红蛋白（红色，分子量约 64,500）与二硝基氟苯-鱼精蛋白（鱼精蛋白与二硝基氟苯结合后为黄色，分子量为 2,000-12,000）的混合物，从颜色的不同即可观察到血红蛋白洗脱较快，鱼精蛋白洗脱较慢。在分离的同时可根据流出体

39、积对层析柱大致进行标定，之后可用于盐析上清（实验三制备）的脱盐，即分离清蛋白。（因本实验无法连续分段收集层析流出液，所以，必须确定清蛋白之洗脱速度，以便回收脱盐后的清蛋白，又因血红蛋白的分子量与清蛋白较接近，故可用其洗脱体积近似得到清蛋白的洗脱体积，此为标定之目的）。三、仪器 层析柱（直径 0.8-1.5cm，长 10-20cm）1 吸管 2 玻璃棒 1 小烧杯 25ml 量筒 试管 10 四、试剂及材料 1交联葡聚糖 2二硝基氟苯-鱼精蛋白和血红蛋白混和物 3考马斯蓝染液 量血清蛋白的醋酸纤维膜电泳两个实验其它为选做实验二实验要求一理论部分明确实验目原理操作关键步骤及注意事项掌握生物化学实验

40、基本知识和技能二实验部分原始记录实验中要仔细观察如实记录实验现象实验记录要真实准确实验报每次实验完成后要求写出实验报实验报要求文字清楚有条理语言简洁扼要报的内容包括实验名称实验目的方法原理实验步骤可用流程示意图要求简明扼要原始数据和现象记录计算结果结论简明扼要讨论用所学理论知识对实验学服务教务表格中下载实验一基本操作一要求熟悉实验室规则及常用生化仪器清点洗刷实验用具掌握各种仪器的正规操作及维护二实验内容常用生化仪器烧杯试管管带有刻度用于血中非蛋白质的测定离心管吸量管刻度吸量管其上部 4奈氏试剂（1：30 稀释）5盐析上清（实验三制备）五、操作步骤 1凝胶制备 取 sephadex G501g

41、置于锥型瓶中，加蒸馏水 30ml，于沸水浴中煮沸 1 小时溶胀凝胶，取出，冷却到室温后备用。2柱体积的测定 将玻璃柱垂直安置在铁加台上，关闭下口，注水到上端 1.5cm 处，打开出口，使水全部流入量筒，记下体积。3装柱 关闭出口，加蒸馏水到 1/3 柱体积，将 sephadexG50 凝胶悬液混匀自顶部徐徐加入到柱体积处，待凝胶沉积 1-2cm时，打开出口，同时不断加入凝胶，直至凝胶沉积到距柱顶 2cm左右，用 10ml 左右的蒸馏水流洗整个柱床，同时通过调节出口高度使洗脱速度为 1ml/分，操作过程中严防出现气泡和分层，如床面不平，可以用玻璃棒轻轻搅动表层，使凝胶重新自然沉降。（整个过程中勿

42、使液面低于床面以免使气体进入，使柱床干裂）。4、加样 将床面以上的蒸馏水放出，至床面刚好露出（切不可使床面完全流干），关闭下口，用滴管取混合样品液.2ml，缓缓沿内壁加入（尽量不扰动床面），打开出品，使样品进入床内，至床面重新露出足量的蒸馏水。量血清蛋白的醋酸纤维膜电泳两个实验其它为选做实验二实验要求一理论部分明确实验目原理操作关键步骤及注意事项掌握生物化学实验基本知识和技能二实验部分原始记录实验中要仔细观察如实记录实验现象实验记录要真实准确实验报每次实验完成后要求写出实验报实验报要求文字清楚有条理语言简洁扼要报的内容包括实验名称实验目的方法原理实验步骤可用流程示意图要求简明扼要原始数据和现象

43、记录计算结果结论简明扼要讨论用所学理论知识对实验学服务教务表格中下载实验一基本操作一要求熟悉实验室规则及常用生化仪器清点洗刷实验用具掌握各种仪器的正规操作及维护二实验内容常用生化仪器烧杯试管管带有刻度用于血中非蛋白质的测定离心管吸量管刻度吸量管其上部5、洗脱及标定 打开出口，调节流速使流体逐滴均匀流出，量筒收集洗脱液体，同时记录如下数据：起始，红始、红终、黄始，黄终、终止（1.5 倍柱体体积）。（注意：洗脱过程中随时添加柱床上表的蒸馏水，切勿使柱床干裂），观察血红蛋白与 DNP-鱼精蛋白的位置及其脱次序并记录实验现象。6、计算各记录点之间的中点值分别以 A、B、C、D、E表示，以 1 倍柱体体

44、积蒸馏水清洗层析柱，取 10 只试管分两组，一组加入考马期兰染液 3ml，另一组奈氏试剂 3ml（编为考 A-考 E，奈 A-奈 E）。7、上样 取盐析上清 0.2ml 依前法上样。8、调节流速与标定相同，开始洗脱。a.量筒收集至 A时，用考 A，奈 A各按收流出液 1 滴，混匀，观察颜色。b.量筒收集至 B时，用样品收集管收集流出液 5 滴后，用考 B，奈 B各接收流出液 1 滴，混匀，观察颜色，同时向量筒中补加加蒸馏水 5 滴。c.量筒收集至 C时，和考 C，奈 C各接收注出液 1 滴，混匀，观察颜色。d.量筒收集至 D时，用考 D，奈 D各接收流出液 1 滴，混产，观察颜色。e.量筒由集

45、至 E时，用考 E，奈 E各接收流出液 1 滴，混匀，观察颜色。f.量筒收集至 1.5 倍柱体积，关闭下口。9、凝胶的回收。量血清蛋白的醋酸纤维膜电泳两个实验其它为选做实验二实验要求一理论部分明确实验目原理操作关键步骤及注意事项掌握生物化学实验基本知识和技能二实验部分原始记录实验中要仔细观察如实记录实验现象实验记录要真实准确实验报每次实验完成后要求写出实验报实验报要求文字清楚有条理语言简洁扼要报的内容包括实验名称实验目的方法原理实验步骤可用流程示意图要求简明扼要原始数据和现象记录计算结果结论简明扼要讨论用所学理论知识对实验学服务教务表格中下载实验一基本操作一要求熟悉实验室规则及常用生化仪器清点

46、洗刷实验用具掌握各种仪器的正规操作及维护二实验内容常用生化仪器烧杯试管管带有刻度用于血中非蛋白质的测定离心管吸量管刻度吸量管其上部用 2 倍柱体积蒸馏水流洗层析柱后，将 sephadex G50 凝胶回收至回收容顺中。思考题 1、如果凝胶过滤法分离的样品中含有多种蛋白质，如何判断哪一种是所需要的？2、在部分收集的样吕中，如何判断哪些浓度较高，哪些纯度较高？3、试评述凝胶过滤法的优缺点？实验五 血清蛋白的醋酸纤维素膜电泳 一、要求 1、熟悉电泳的原理及其主要影响因素 2、掌握醋酸纤维素电泳的方法及血清蛋白质的电泳行为 二、原理 （一）基本原理 带电粒子在电场中移动的现象称为电泳，电泳过程中的动力

47、为电场力，其大小与粒子所带提电荷 Q和电场强度 X成正比，阻力可由 stoke 定律描述，即：V-粒子运动速度 r-球形粒子半径 量血清蛋白的醋酸纤维膜电泳两个实验其它为选做实验二实验要求一理论部分明确实验目原理操作关键步骤及注意事项掌握生物化学实验基本知识和技能二实验部分原始记录实验中要仔细观察如实记录实验现象实验记录要真实准确实验报每次实验完成后要求写出实验报实验报要求文字清楚有条理语言简洁扼要报的内容包括实验名称实验目的方法原理实验步骤可用流程示意图要求简明扼要原始数据和现象记录计算结果结论简明扼要讨论用所学理论知识对实验学服务教务表格中下载实验一基本操作一要求熟悉实验室规则及常用生化仪

48、器清点洗刷实验用具掌握各种仪器的正规操作及维护二实验内容常用生化仪器烧杯试管管带有刻度用于血中非蛋白质的测定离心管吸量管刻度吸量管其上部-介质粘度 当二者平衡时，粒子在介质中恒速运动，若将单位电场强度下粒子的运动速度（V/X）定义为迁移率（mobility），以 u 表示，则：可见，粒子的迁移率在一定条件下取决于其本身的性质，即电荷与大小形状，在具体实验中，一定的电压和电泳时间下，迁移率反映在各种粒子在介质中的位移不同。（二）影响电泳的主要因素 由于介质吸附水中离子使其表面溶液相对带电，在电场作用下，溶液就向一定方向移动，这种现象称为电渗，电渗与电泳同时存在，其方向可与电泳相同或相反，凝胶电泳

49、的电渗作用很小。1、介质的 pH 介质的 pH影响蛋白质等具有两性解离性质的物质的电离情况，即决定了其带电量 Q，为保持介质 pH的稳定，常采用一定的缓冲液，介质的 pH与待电泳物的等电点相差越多，待电泳物所带的电荷越多。2、离子强度 离子强度 I 可由下列公式计算：Ci 离子摩尔浓度，Zi 离子价数 量血清蛋白的醋酸纤维膜电泳两个实验其它为选做实验二实验要求一理论部分明确实验目原理操作关键步骤及注意事项掌握生物化学实验基本知识和技能二实验部分原始记录实验中要仔细观察如实记录实验现象实验记录要真实准确实验报每次实验完成后要求写出实验报实验报要求文字清楚有条理语言简洁扼要报的内容包括实验名称实验

50、目的方法原理实验步骤可用流程示意图要求简明扼要原始数据和现象记录计算结果结论简明扼要讨论用所学理论知识对实验学服务教务表格中下载实验一基本操作一要求熟悉实验室规则及常用生化仪器清点洗刷实验用具掌握各种仪器的正规操作及维护二实验内容常用生化仪器烧杯试管管带有刻度用于血中非蛋白质的测定离心管吸量管刻度吸量管其上部离子强度过低，则缓冲容量小，不易维持 pH稳定，离子强度过高，则降低蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。3、电场强度 即单位距离的电位差，与电泳的位移成正比，在介质一定时，其取决于电丈夫的大小，电压越高电泳速度越快，但产生热量增加，可致缓冲液蒸发，介质离子强度增加，引起虹吸现象，甚至使蛋白质变