生物反应器的设计及其在柠檬酸发酵中的应用建筑环保行业建筑环保行业.pdf

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1、 生物化学课程设计说明书 生物反应器的设计及其在柠檬酸发酵中的应用 起止日期 2012 年 12 月 28 日 至 2013 年 01 月 05 日 学 生 姓 名：张 亚 旗 学 号：3100821021 班 级：应 化 101 理学院应用化学系 2012 年 01 月 04 日 生物反应器的设计及其在柠檬酸 发酵中的应用 一、引言 1.柠檬酸发酵生产的目的意义 柠檬酸 又名枸橼酸,是一种三元羧酸,其学名为 3-羟基-3-羧基戊二酸。柠檬酸是生物体主要代谢产物之一,在自然界中分布广泛,主要存在于柠檬、柑橘、梅子等果实中。现在,柠檬酸被广泛的应用于食品,医药和化学工业中 。世界市场上柠檬酸大约

2、有 70%用于食品行业,医药和化妆品占 10%,化学工业 15%,其他行业 5%。目前,柠檬酸全世界消耗量已达 120 万吨,年产能达 160 万吨,市场贸易量为 90 多万吨,且每年以 7%的增长率增长。尤其是有关清洁剂的法案可能在不久之后将会禁止清洁产品添加磷酸盐,这将意味着越来越多的清洁剂生产厂家将会选择另外两种添加剂-柠檬酸和柠檬酸钠。2.柠檬酸的发展史 1784 年 C.W.舍勒首先从柑橘中提取柠檬酸。他是通过在水果榨汁中加入石灰乳以形成柠檬酸钙沉淀的方法制取柠檬酸的。天然柠檬酸最初产于美国加利福尼亚州、意大利和西印度群岛。意大利的产量居首位。1922 年，世界柠檬酸的总销售额的 9

3、0由美国、英国、法国等垄断。发酵法制取柠檬酸始于 19 世纪末。1893 年 C.韦默尔发现青霉（属）菌能积累柠檬酸。1913 年 B.扎霍斯基报道黑曲霉能生成柠檬酸。1916 年汤姆和柯里以曲霉属菌进行试验，证实大多数曲霉菌如泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉和黑曲霉都具有产柠檬酸的能力，而黑曲霉的产酸能力更强。如柯里以黑曲霉为供试菌株，在 15蔗糖培养液中发酵，对糖的吸收率达55。1923 年美国菲泽公司建造了世界上第一家以黑曲霉浅 盘发酵法生产柠檬酸的工厂。随后比利时、英国、德国、苏联等相继研究成功发酵法生产柠檬酸。这学班号级应化理学院应用化学系年月日生物反应器的设计及其在柠檬酸发酵中

4、的应用一引言柠檬酸发酵生产的目的意义柠檬酸又名枸橼酸是一种三元羧酸其学名为羟基羧基戊二酸柠檬酸是生物体主要代谢产物之一在自然界中分布广用于食品行业医药和化妆品占化学工业其他行业目前柠檬酸全世界消耗量已达万吨年产能达万吨市场贸易量为多万吨且每年以的增长率增长尤其是有关清洁剂的法案可能在不久之后将会禁止清洁产品添加磷酸盐这将意味着越来越多通过在水果榨汁中加入石灰乳以形成柠檬酸钙沉淀的方法制取柠檬酸的天然柠檬酸最初产于美国加利福尼亚州意大利和西印度群岛意大利的产量居首位年世界柠檬酸的总销售额的由美国英国法国等垄断酵法制取柠檬酸始于世纪末年样，依靠从柑橘中提取天然柠檬酸的方法逐渐为发酵柠檬酸所取代。1

5、950 年前，柠檬酸采用浅盘发酵法生产。1952 年美国迈尔斯试验室采用深层发酵法大规模生产柠檬酸。此后，深层发酵法逐渐建立起来。深层发酵周期短，产率高，节省劳动力，占地面积小，便于实现仪表控制和连续化，现已成为柠檬酸生产的主要方法。中国用发酵法制取柠檬酸以 1942 年汤腾汉等报告为最早。1952 年陈声等开始用黑曲霉浅盘发酵制取柠檬酸。轻工业部发酵工业科学研究所于 1959 年完成了 200l 规模深层发酵制柠檬酸试验，1965 年进行了生产 100t甜菜糖蜜原料浅盘发酵制取柠檬酸的中间试验，并于 1968 年投入生产。1966 年后，天津市工业微生物研究所、上海市工业微生物研究所相继开展

6、用黑曲霉进行薯干粉原料深层发酵柠檬酸的试验研究，并获得成功，从而确定了中国柠檬酸生产的这一主要工艺路线。薯干粉深层发酵柠檬酸，原料丰富，工艺简单，不需添加营养盐，产率高，是中国独特的先进工艺。中国石油发酵柠檬酸的研究起步较早。1970 年，天津、上海、沈阳、常州等地研究单位利用解脂假丝酵母进行石蜡油（正构烷烃）发酵生产柠檬酸的试验。1979 年徐子渊等筛选出一株对氟乙酸敏感的变异株解脂假丝酵母，其乌头酸水合酶的活性很低，柠檬酸的生成比例从原来的 50提高至 80，从而提高了石油发酵柠檬酸的产率。随着生物技术的进步，柠檬酸工业有了突飞猛进的发展,全世界柠檬酸产量已达 0.4Mt。在柠檬酸发酵技术

7、领域，由于高产菌株的应用和新技术的不断开拓，柠檬酸发酵和提取收率都有明显提高，每生产 1t 柠檬酸分别消耗 2.5 2.8t 糖蜜,2.2 2.3t 薯干粉或 1.2 1.3t 蔗糖。人们正在大力开发固定化细胞循环生物反应器发酵技术。3.设计的任务及主要涉及的内容 学班号级应化理学院应用化学系年月日生物反应器的设计及其在柠檬酸发酵中的应用一引言柠檬酸发酵生产的目的意义柠檬酸又名枸橼酸是一种三元羧酸其学名为羟基羧基戊二酸柠檬酸是生物体主要代谢产物之一在自然界中分布广用于食品行业医药和化妆品占化学工业其他行业目前柠檬酸全世界消耗量已达万吨年产能达万吨市场贸易量为多万吨且每年以的增长率增长尤其是有关

8、清洁剂的法案可能在不久之后将会禁止清洁产品添加磷酸盐这将意味着越来越多通过在水果榨汁中加入石灰乳以形成柠檬酸钙沉淀的方法制取柠檬酸的天然柠檬酸最初产于美国加利福尼亚州意大利和西印度群岛意大利的产量居首位年世界柠檬酸的总销售额的由美国英国法国等垄断酵法制取柠檬酸始于世纪末年 本设计的任务主要是以黑曲霉为菌种的柠檬酸发酵阶段的设计。设计的内容包括工艺流程；主要设备计算及其选型；主要设备工艺计算；等等。4.柠檬酸发酵方法 柠檬酸生产工艺分为水果提取法，化学合成法和生物发酵法三种。水果提取法：柠檬酸从柠檬、橘子、苹果等柠檬酸含量较高的水果中提取。此法提取的成本较高，不利于工业化生产。化学合成法的原料是

9、：丙酮，二氯丙酮或乙烯酮，此法工艺复杂，成本高，安全性低。生物发酵法：（1）表面发酵法，又称浅层发酵法，多以甜菜糖蜜为原料。工艺过程是：将原料先放入煮沸过内加入水煮沸，一次加皇血盐和 EDTA 二钠盐煮沸灭菌，再用无菌水配成培养基液，加入适量的硫酸铵、磷酸二氢钾作为氮源和营养盐，将培养基液在 45-50 度下送入发酵室内装入浅底的铝盘或不锈钢盘中，干孢子接入黑曲霉干孢，发酵，过滤掉菌丝后将发酵液中和，酸解、净化、浓缩、结晶等后处理可得。（2）固体表面发酵法：多以海藻酸钠为载体，也有采用聚丙烯酰胺。固定化方法以后者为例，将丙烯酰胺单体（ACAM）和 N,N-亚甲基双丙烯酰胺（BIS）溶于水后与微

10、生物细胞混合，搅拌，加入四甲基乙二胺和过硫酸钾，室温下放置30min，使之聚合完全，制得凝胶，将其切成 3mm*3mm*3mm的小块，用生理盐水洗净后作为载体进行发酵，提取，制得柠檬酸。（3）深层发酵法 采用定向培养，紫外线诱变及 NTG处理等的配合作用对菌株选育，使其适应以糖蜜为原料的深层发酵，并提高菌株的产酸率和转化率，对蜜糖进行预处理、处理，后经发酵、提取等工艺过程，得到柠檬酸。二、柠檬酸的生产 学班号级应化理学院应用化学系年月日生物反应器的设计及其在柠檬酸发酵中的应用一引言柠檬酸发酵生产的目的意义柠檬酸又名枸橼酸是一种三元羧酸其学名为羟基羧基戊二酸柠檬酸是生物体主要代谢产物之一在自然界

11、中分布广用于食品行业医药和化妆品占化学工业其他行业目前柠檬酸全世界消耗量已达万吨年产能达万吨市场贸易量为多万吨且每年以的增长率增长尤其是有关清洁剂的法案可能在不久之后将会禁止清洁产品添加磷酸盐这将意味着越来越多通过在水果榨汁中加入石灰乳以形成柠檬酸钙沉淀的方法制取柠檬酸的天然柠檬酸最初产于美国加利福尼亚州意大利和西印度群岛意大利的产量居首位年世界柠檬酸的总销售额的由美国英国法国等垄断酵法制取柠檬酸始于世纪末年2.1 原料 柠檬酸发酵生产可使用的原料品种很多,但共可划分为两类,即糖质原料和石油原料。糖质原料包括薯干、薯渣、淀粉、淀粉渣及玉米粉,各种粗制糖粗蔗搪,怡糖等、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜,葡萄糖

12、母液等。石油原料主要包括一的正烷烃。以石油为原料柠檬酸发酵的研究以日本、美国的研究报道占多数。虽然用于柠檬酸生产的菌种可采用多种碳源,但以蔗糖和葡萄糖为佳,许多原料需进行纯化,因为有些微量元素会影响柠檬酸的产生。本设计主要以薯干为原料。2.2 菌种 常用菌种为产黑曲霉（Aspergillus niger）。本设计使用黑曲霉 CO827。2.3 柠檬酸发酵菌黑曲霉积累柠檬酸的机理 （1）黑曲霉柠檬酸代谢途径 薯干内含有淀粉，经过粉碎打浆后，在黑曲霉分泌的淀粉酶的作用下，氧化分解为葡萄糖，见图 1,六碳糖经由 EMP 途径生成丙酮酸,然后丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰 CoA,另一方面固定 CO2生

13、成草酰乙酸,然后草酰乙酸与乙酰 CoA 缩合生成柠檬酸。（2）黑曲霉对柠檬酸的代谢调控 柠檬酸是 TCA 循环的中间代谢产物,正常条件下不会积累,所以要有必要的代谢调节,使柠檬酸生成途径的酶活力强大,分解途径的酶活减弱或者失活。其中,磷酸果糖激酶(PEK),柠檬酸合酶,异柠檬酸脱氢酶和顺乌头酸水合酶的调节是至关重要的。PEK 受柠檬酸和 ATP 抑制,受 AMP、Pi 和 NH4+激活,NH4+存在可以有效解除 PEK对柠檬酸积累的敏感性。柠檬酸合成酶只 CoA和 ATP 有敏感性,该酶对学班号级应化理学院应用化学系年月日生物反应器的设计及其在柠檬酸发酵中的应用一引言柠檬酸发酵生产的目的意义柠

14、檬酸又名枸橼酸是一种三元羧酸其学名为羟基羧基戊二酸柠檬酸是生物体主要代谢产物之一在自然界中分布广用于食品行业医药和化妆品占化学工业其他行业目前柠檬酸全世界消耗量已达万吨年产能达万吨市场贸易量为多万吨且每年以的增长率增长尤其是有关清洁剂的法案可能在不久之后将会禁止清洁产品添加磷酸盐这将意味着越来越多通过在水果榨汁中加入石灰乳以形成柠檬酸钙沉淀的方法制取柠檬酸的天然柠檬酸最初产于美国加利福尼亚州意大利和西印度群岛意大利的产量居首位年世界柠檬酸的总销售额的由美国英国法国等垄断酵法制取柠檬酸始于世纪末年乙酰 CoA 的亲和力取决于草酰乙酸的浓度,柠檬酸积累时,亲和力增加。乌头酸水合酶催化柠檬酸分解,使

15、乌头酸水合酶失活或者是阻止其合成降低柠檬酸的分解,是提高柠檬酸积累的关键之一。黑曲霉中发现谷氨酸及在胞内代谢为谷氨酸的天冬氨酸,脯氨酸,都可促进柠檬酸的积累,推测他们阻止了该酶的合成。柠檬酸对该酶的合成有诱导作用,只有破坏诱导机制的菌株才能积累柠檬酸。图 1 黑曲霉中柠檬酸代谢 2.4 生化反应过程 1.薯干内含丰富淀粉，经粉碎打浆后，淀粉由黑曲霉分泌的淀粉酶水解为葡萄糖：(C6H10O5)n(淀粉)+nH2O nC6H12O6(葡萄糖)2.葡萄糖经 EMP途径生成丙酮酸：学班号级应化理学院应用化学系年月日生物反应器的设计及其在柠檬酸发酵中的应用一引言柠檬酸发酵生产的目的意义柠檬酸又名枸橼酸是

16、一种三元羧酸其学名为羟基羧基戊二酸柠檬酸是生物体主要代谢产物之一在自然界中分布广用于食品行业医药和化妆品占化学工业其他行业目前柠檬酸全世界消耗量已达万吨年产能达万吨市场贸易量为多万吨且每年以的增长率增长尤其是有关清洁剂的法案可能在不久之后将会禁止清洁产品添加磷酸盐这将意味着越来越多通过在水果榨汁中加入石灰乳以形成柠檬酸钙沉淀的方法制取柠檬酸的天然柠檬酸最初产于美国加利福尼亚州意大利和西印度群岛意大利的产量居首位年世界柠檬酸的总销售额的由美国英国法国等垄断酵法制取柠檬酸始于世纪末年 EMP反应式：葡萄糖+2 NAD+2 ADP+2 磷酸 2 NADH+2 丙酮酸 +2 ATP+2 H2O+2 H

17、+3.EMP 途径：4、TCA循环反应式：乙酰 CoA+3NAD+FAD+GDP+Pi+2H2O 2O2+3NADH+3H+FADH2+GTP+CoASH 5.代谢合成柠檬酸的总生化反应方程式：学班号级应化理学院应用化学系年月日生物反应器的设计及其在柠檬酸发酵中的应用一引言柠檬酸发酵生产的目的意义柠檬酸又名枸橼酸是一种三元羧酸其学名为羟基羧基戊二酸柠檬酸是生物体主要代谢产物之一在自然界中分布广用于食品行业医药和化妆品占化学工业其他行业目前柠檬酸全世界消耗量已达万吨年产能达万吨市场贸易量为多万吨且每年以的增长率增长尤其是有关清洁剂的法案可能在不久之后将会禁止清洁产品添加磷酸盐这将意味着越来越多通

18、过在水果榨汁中加入石灰乳以形成柠檬酸钙沉淀的方法制取柠檬酸的天然柠檬酸最初产于美国加利福尼亚州意大利和西印度群岛意大利的产量居首位年世界柠檬酸的总销售额的由美国英国法国等垄断酵法制取柠檬酸始于世纪末年葡萄糖 丙酮酸 CO2 +乙酰 CoA 柠檬酸 2.5 工艺过程 （1）菌种培养 在 46 波美度的麦芽汁内加入 25至 30的琼脂，然后接入黑曲霉菌种（无茵操作），在 3032条件下培养 4 天左右。这种培养方法称为“斜面培养”。将麸皮和水以 1：1 的比例掺拌，再加入 10的碳酸钙、05的硫酸铵，拌匀后装入容量为 250 毫升的三角瓶中，用 15 公斤压力灭菌 60 分钟。接人斜面培养法培养出

19、的菌种，培养 96120 小时后即可使用。（2）原料处理 湿粉渣必须经过压榨脱水，使含水量在 60%左右；干粉渣含水量低，应按60的比例补足水分；结块的粉渣需粉碎成二至四毫米颗粒。然后加入 2%碳酸钙、10至 11的米糠，掺匀后，堆放 2 小时，再进行蒸煮。蒸煮可采用加压蒸料和常压蒸料两种方式。加压蒸料最好用旋转式蒸锅，常压蒸料可用固定式蒸锅或固定式水泥蒸锅。先用扬麸机将蒸煮好的料破碎，再加入含抗污染药品的沸水。（3）接种、发酵 当磷温冷却到 3740时，接入菌种悬浮液。接种后，送入曲室发酵(此时料温不得低于 27)。生产过程一定要严格无菌操作。发酵室要注意消毒，定期用甲醛或硫磺熏蒸，其用最好

20、甲醛为 10 毫升立方米，硫磺为 25 克立方米。学班号级应化理学院应用化学系年月日生物反应器的设计及其在柠檬酸发酵中的应用一引言柠檬酸发酵生产的目的意义柠檬酸又名枸橼酸是一种三元羧酸其学名为羟基羧基戊二酸柠檬酸是生物体主要代谢产物之一在自然界中分布广用于食品行业医药和化妆品占化学工业其他行业目前柠檬酸全世界消耗量已达万吨年产能达万吨市场贸易量为多万吨且每年以的增长率增长尤其是有关清洁剂的法案可能在不久之后将会禁止清洁产品添加磷酸盐这将意味着越来越多通过在水果榨汁中加入石灰乳以形成柠檬酸钙沉淀的方法制取柠檬酸的天然柠檬酸最初产于美国加利福尼亚州意大利和西印度群岛意大利的产量居首位年世界柠檬酸的

21、总销售额的由美国英国法国等垄断酵法制取柠檬酸始于世纪末年（4）发酵工艺条件的控制 ()发酵过程中没有解决注意适当通风，因黑曲霉菌是喜空气细菌。()发酵室内的相对湿度应保持在 86至 90之间。()注意发酵过程中的温度控制。整个发酵过程分为三个阶段：第一阶段为前 18 小时，室温在 2730之间，料温在 2735左右；第二阶段为 1860 小时，料温为 4043，不能超过 44，室温要求 33左右；第三阶段为 60 小时料温在 3537左右，室温为 3032。（5）浸取柠檬酸 学班号级应化理学院应用化学系年月日生物反应器的设计及其在柠檬酸发酵中的应用一引言柠檬酸发酵生产的目的意义柠檬酸又名枸橼酸是一种三元羧酸其学名为羟基羧基戊二酸柠檬酸是生物体主要代谢产物之一在自然界中分布广用于食品行业医药和化妆品占化学工业其他行业目前柠檬酸全世界消耗量已达万吨年产能达万吨市场贸易量为多万吨且每年以的增长率增长尤其是有关清洁剂的法案可能在不久之后将会禁止清洁产品添加磷酸盐这将意味着越来越多通过在水果榨汁中加入石灰乳以形成柠檬酸钙沉淀的方法制取柠檬酸的天然柠檬酸最初产于美国加利福尼亚州意大利和西印度群岛意大利的产量居首位年世界柠檬酸的总销售额的由美国英国法国等垄断酵法制取柠檬酸始于世纪末年