代谢途径总结医学心理学内科学高等教育大学课件.pdf

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1、一、我国工业生物技术发展面临的主要问题 我国是生物制造大国 我国不是生物制造强国 工业生产菌种的知识产权保护体系尚未建立 具体问题：工业生产菌种的技术水平较差 产品浓度低，造成能耗高、废水排放量大 具体问题：发酵工艺落后 二、代谢途径工程的研究内容 1 工业微生物基因组测序与功能基因组分析 2 微生物基因组规模代谢网络重构与模型量化分析 3 工业微生物基因组的理性设计 4 基因组多位点快速进化 5 基因组规模的全局扰动 6 基因组删减优化(最小基因组)7 人工合成基因组 8 大规模生化反应的胞外重构 三、代谢途径工程的发展历史 代谢工程的最早实例(1974)1974 年，Chakrabarty

2、在假单抱菌 P.putide 和 P.aeruginosa中分别引入几个稳定的重组质粒，增加了两者对 樟脑和萘的降解催化活性。这是代谢工程的第一个应用实例，标志着代谢工程作为一门学科的诞生。代谢工程作为一个专门学科的出现(1991)早期代谢工程最为成功的实例(1 992)代谢工程发展-1996 1996 年在美国召开了第一届代谢工程大会，美国 Mendes 教授和 Kel 教授在大会上做了题为代谢工程-让 细胞为人类工作”的报告，进一步确立了代谢工程的地位与研究方向。反向代谢工程1996 先用诱变等手段改变某个表型，再根据导致这个表型变化的基因，进一步强化目标表型。是现代基于系统生物学的代谢途

3、径工程思想的来源。代谢工程发展-1998 代谢工程发展-1999 进化代谢工程 2001 利用适应性进化(Adaptive Evolution)有效提高微生物发酵生产速率、产率和终浓度的技术。系统代谢工程 2005 传统代谢工程只是对局部的代谢网络进行分析以及对局部的代谢途径进行改造。由于没有从全局的角度去分析 改造细胞，所以具有很大的局限性。高通量组学分析技术和基因组水平代谢网络模型构建等系统生物学技术能够从系统水平上分析细胞的代谢功 能。将这些系统生物学技术和传统代谢工程以及下游发酵工艺优化相互结合，进一步提岀系统代谢工程 的概念。合成生物学 2008 合成生物学是以工程学理论为依据，设计

4、和合成新的生物元件，或是设计改造已经存在的生物系统。这些设计 和合成的核心元件(如酶、基因电路、代谢途径等)具有特定的操作标准；小分子生物元件可以组装成大 的整合系统，从而解决各种特殊问题。四、代谢途径工程技术近期发展趋势 传统代谢工程技术日趋成熟 大量传统工业微生物的代谢工程升级：传统工业微生物向少数工业微生物的聚集：非微生物合成的产物改由微生物生产 改造的复杂性和设计的精确性：复杂代谢工程已成为重要的技术发展趋势 系统生物学飞速发展促进生物体设计改造日渐成熟 合成生物学的发展促进生物模块的标准化 对 DNA 操作能力的进化：量变-质变 1.系统生物学与工业生物技术 组学技术（X-omics

5、）超快基因组测序技术 基于基因芯片的转录组学分析 基于二维电泳和 MALDI-TOF 的蛋白质组学技术 基于色谱分离和质谱鉴定技术的代谢物组学 基于同位素技术的代谢通量组学 系统生物学与工业生物技术 2.合成生物学与工业生物技术 End 代谢途径工程(Metabolic Pathway Engineer in g)第二章 细胞代谢的生物化学基础 本章主要内容 一.工业生物技术中亟待解决的技术问题 二.微生物合成特定产物的生物化学基础 三.微生物的初级代谢 四.微生物的次级代谢（略）五.非微生物来源天然产物的合成代谢 一.工业生物技术中亟待解决的技术问题 1 目标产物产量的进一步提高一一高产量

6、2 副产物含量的降低/消除高转化率 3 尽可能短的时间内完成发酵过程 高生产强度 4 异源蛋白的高效合成与理性修饰 5 合成微生物原来不能合成的物质 5 合成微生物原来不来合成的物质 6 扩展底物利用范围 非常规底物的耐受性问题 高分子量底物的分解（蛋白质、多糖、脂类）底物的修饰一一磷酸化过程 吸收过程所需转运蛋白 降解所需要的转运蛋白 降解中间产物的耐受性问题 高效降解所需的额外能量供给 非常规底物降解的辅因子/氧化还原平衡问题 7 对极端环境的耐受性 更酸/更碱 对于有机酸而言，更低的最适发酵 pH 值，意味着更少的中和剂的添加和产物分离过程中更少的强酸的消耗；对于碱性条件下稳定的产物（各

7、种 pKa 偏碱性的蛋白，生物碱等）而言，更碱的 pH 值意味着更稳定的发酵产量 8 对极端环境的耐受性一一更高/更低温度 更高的发酵温度意味着更少的冷却水消耗；更低的贮藏温度耐受性，意味着更长的贮藏周期（乳酸菌、芽抱杆菌等活菌制剂）。9 对极端环境的耐受性一一高浓度有机溶剂 高浓度有机溶剂可以破坏细胞膜组分，从而造成细胞的死亡。对高浓度有机溶剂的耐受，可以显著提高微生物积累丙酮、丁醇等有机溶剂的效率和最终产量 二.微生物合成特定产物的生物化学基础 1.细胞组分 细胞生长的表征方法 测定总细胞体积 测定细胞数(0D)测定细胞干重 测定细胞湿重 护体系尚未建立具问题工业生产菌种的技术水平较差品产

8、浓度低造成能耗高种废排放量大发酵艺落后二代具谢途径题程研究能内容微物基因组测序成与未功分平析基规具模网络重体谢途能内具构型化反应胞外三具展历构因外史最早实例年微工在假具单抱和别艺引入引几个引稳定质粒增加了两者对量大樟脑萘降因了两引稳解催三容微物问菌活性具因这是第一用者对标志着具作为组大门学科会产菌一用体造成美国教授加能内上做让细人类报催告进具步确地测位上方向先诱变等构手段改某表径题反再能根据导致强目体现于能内引统?具?工分催?改?能内研上一用先诱水性能解艺能?一用萘先性能先诱?假手?能表性能一用?体让细?护产?一用技变造成系尚体性测定细胞有机物干重 2.大分子底物的降解 3.底物/产物的运输过

9、程 细胞膜的功能一一 1.选择性透过作用 转运方式(1)离子通道介导的被动运输过程(2)载体介导的氢离子共转运(3)载体-受体介导的氢离子共转运(4)基本的主动运输(底物吸收)(5)基团转位 能量耦合系统 浓度梯度 质子电动势 ATP 结合盒(ATP Binding Cassette)转运蛋白 光吸收驱动 底物水平磷酸化 细胞膜的功能2.离子稳定作用 细胞膜的功能一一 3.代谢过程支撑作用 细胞膜的功能一一 4.微生物相互作用过程识别 细胞膜的功能一一 5.信号转导过程的第一环节 三.微生物的初级代谢 基本概念 微生物在生长发育和繁殖过程中，需要不断地从外界环境中摄取营养物质，在体内经过一系列

10、的生化反应，转 变成能量和构成细胞的物质，并排出不需要的产物。这一系列的生化过程称为新陈代谢。微生物的代谢(metabolism)是指发生在微生物细胞中的分解代谢(catabolism)与合成代谢(anabo lism)的总 和。新陈代谢包括 分解代谢和合成代谢 初级代谢和次级代谢 物质代谢和能量代谢(能量代谢包括产能代谢和耗能代谢)基本概念 合成代谢(Anabolism):指细胞(酶)利用简单的小分子物质合成复杂大分子的过程，这个过程要消耗能量。合成代谢所利用的小分子物质，来源于分解代谢过程中产生的中间产物或环境中的小分子营养物质。分解代谢(catabolism):指细胞(酶)将大分子物质降

11、解成小分子物质，并在这个过程中产生能量。分为三个阶段 将蛋白质、多糖及脂类等大分子营养物质降解成氨基酸、单糖及脂肪酸等小分子物质 将第一阶段产物劲一步分解成为更简单的乙酰辅酶 A、丙酮酸以及能进入三羧酸循环的某些中间产物,产生一些ATP、NADH 及 FADH2 通过三羧酸循环将第二阶段产物完全降解成 C02,并产生 ATP、NADH 及 FADH2 第二和第三阶段产生的通过电子传递链被氧化，产生大量的 ATP 分解代谢和合成代谢关系 分解代谢为合成代谢提供能量和原料；合成代谢是分解代谢的基础 在代谢过程中，微生物通过分解作用产生化学能，光合微生物还可将光能转化成化学能，这些能量用于：1.合

12、成代谢；2.微生物的运动和运输；3.热和光。无论是分解代谢还是合成代谢，代谢途径都是由一系列连续的酶反应构成的，前一部反应的产物是后续反应的 底物。细胞能有效调节相关的酶促反应，使生命活动得以正常进行。某些微生物在代谢过程中，除产生其生命活动所必需的初级代谢产物和能量外，还会产生一些次级代谢产物。这些物质除有利于微生物生存，还与人类生产生活密切相关。护体系尚未建立具问题工业生产菌种的技术水平较差品产浓度低造成能耗高种废排放量大发酵艺落后二代具谢途径题程研究能内容微物基因组测序成与未功分平析基规具模网络重体谢途能内具构型化反应胞外三具展历构因外史最早实例年微工在假具单抱和别艺引入引几个引稳定质粒

13、增加了两者对量大樟脑萘降因了两引稳解催三容微物问菌活性具因这是第一用者对标志着具作为组大门学科会产菌一用体造成美国教授加能内上做让细人类报催告进具步确地测位上方向先诱变等构手段改某表径题反再能根据导致强目体现于能内引统?具?工分催?改?能内研上一用先诱水性能解艺能?一用萘先性能先诱?假手?能表性能一用?体让细?护产?一用技变造成系尚体性基本概念 初级代谢：(primary metabolite)般指具有明确的生理功能，对维持生命活动不可缺少的物质代谢过程。次级代谢：(secondary metabolite)指没有明确生理功能，似乎并不是维持生命活动所必需的物质代谢过 程。微生物代谢的特点 由

14、于微生物“比表面积”巨大，因而代谢速率极快；由于种类繁多，因而代谢类型(途径)极其多样；代谢的严格的调节和灵活性 1.微生物分类 微生物分类 按 DNA 及核糖体 RNA 原核生物 古细菌 真核生物 按能量来源 光能营养型(光合作用)化能营养型(化学反应)微生物分类 按利用的碳源 自养型微生物 异养性微生物 按利用氧的能力 严格好氧菌 兼性好氧菌 耐氧厌氧菌 严格厌氧菌 2.物质代谢概述 代谢 代谢(metabolism)是细胞内发生的各种化学反应的总称，它主要由分解代谢(catabolism)和合成代谢(anabol ism)两个过程组成。分解代谢：将大分子物质降解成小分子物质的过程 合成代

15、谢：将简单的小分子物质合成复杂大分子的过程 分解代谢的作用 提供前体化合物 提供细胞代谢活动所需的能量 生长：细胞结构物质合成 产物合成 维持：物质运输、运动、亚细胞结构形成、大分子周转等 提供还原力 NADH NADPH 合成代谢 由前体化合物合成大分子单体 由前体化合物合成产物 由单体形成大分子化合物 蛋白 核酸 多糖 脂肪 分解代谢的三个阶段 第一阶段：将蛋白质、多糖及脂类等大分子营养物质降解成为氨基酸、单糖及脂肪酸等小分子物质；第二阶段：将第一阶段产物进一步降解成更为简单的乙酰辅酶 A、丙酮酸以及能进入三羧酸循环的某些中间产 物，在这个阶段会产生一些 ATP、NADH 及 FADH2；

16、第三阶段：通过三羧酸循环将第二阶段产物完全降解生成 CO2，并产生 ATP、NADH 及 FADH2。第二和第三阶段产生的ATP、NADH 及 FADH2通过电子传递链被氧化，可产生大量的 ATP。化能异氧微生物的生物氧化和产能 形式：与氧结合，脱氢，失去电子 过程：脱氢(电子)，递氢，受氢 功能：产能(ATP)，产还原力(H)，产小分子中间代谢物 类型：发酵，有氧呼吸，无氧呼吸 护体系尚未建立具问题工业生产菌种的技术水平较差品产浓度低造成能耗高种废排放量大发酵艺落后二代具谢途径题程研究能内容微物基因组测序成与未功分平析基规具模网络重体谢途能内具构型化反应胞外三具展历构因外史最早实例年微工在假

17、具单抱和别艺引入引几个引稳定质粒增加了两者对量大樟脑萘降因了两引稳解催三容微物问菌活性具因这是第一用者对标志着具作为组大门学科会产菌一用体造成美国教授加能内上做让细人类报催告进具步确地测位上方向先诱变等构手段改某表径题反再能根据导致强目体现于能内引统?具?工分催?改?能内研上一用先诱水性能解艺能?一用萘先性能先诱?假手?能表性能一用?体让细?护产?一用技变造成系尚体性3.中心代谢途径 EMP 途径受到严格的调控 转录水平的调控(操纵子、转录起始区域的抑制)反馈抑制 酶别构抑制 胞内辅因子水平(ADP/ATP、NAD/NADH)碳代谢物阻遏效应 氮源相关的调控 饥饿状态的恢复情况 其他限制性底物

18、的供给 HMP 途径 即单磷酸己糖途径(Hexose Monophosphate Pathway)，也称戊糖磷酸途径(Pentose Phosphate Pathway)。分为氧化阶段和非氧化阶段 功能：提供还原力(NADPH)提供前体化合物 核糖磷酸(包括 5-磷酸核糖-1-焦磷酸,PRPP)磷酸赤藓糖 HMP 途径+Glucose 6-phosphate+2 NADP+H2O T ribulose 5-phosphate+2 NADPH+2 H+CO2 ED 途径 ED 途径(Entner-Douderoff pathway)，亦称为 KDPG 途径(2-keto-3-d eoxy-6-p

19、ho sph ogluconate pathway)ED 途径是 HMP 途径的 6-P-GA处的分支途径，它有两个特殊的酶，6-P-GA脱水酶 和 2-酮-3-脱氧-6-磷酸 葡萄糖酸醛缩酶(KDPG 醛缩酶)，因此 ED 途径又叫 KDPG 途径。在大多数假单胞菌中，ED 途径可能是葡萄糖降解的主要代谢途径。发酵运动单胞菌是目前所知的唯一能在厌氧条件下使用 ED 途径的微生物。PK 途径(Phosph oketolase Path way)PK 途径也是从单磷酸己糖 6-P-GA开始降解的，经历 HMP 途径氧化部分的反应，生成 Xu-5-P后，被特有的 酶裂解为 3C化合物(GA-3-P

20、)和 2C 化合物(乙酰磷酸，高能磷酸化合物)。这个特有的酶叫做磷酸 酮解酶(ph osphoketolase),因为有这个酶而把这条单磷酸己糖途径命名为磷酸酮解酶途径，简称 PK 途径。HPK 途径（Hexo se p hos pho ketolase）PK 途径不同于以上已介绍的可兼用于需氧和厌氧条件下降解的途径，微生物在厌氧条件下借助 PK 途径不但可 以利用葡萄糖，而且可以利用 D-核糖，D-木糖和 L-阿拉伯糖。这 3 种糖首先各自转化成 Xu-5-P，然后 经 PK 途径降解成 PYR和 Ac-P（高能磷酸化合物乙酰磷酸）。葡萄糖经 PK 途径降解成 PYR 时所生成的 ATP 的

21、量只有经 EMP 途径的一半。在双歧杆菌和木醋杆菌中发现了另一条磷酸酮解酶途径，在这条途径中磷酸酮解酶以单磷酸己糖 F-6-P为底 物，将 F-6-P裂解为 4-磷酸赤藓糖（E-4-P）和 Ac-P，因此这个磷酸酮解酶实际上是磷酸己糖酮解酶（hexose phosphoketolase）。因这个酶而把这条磷酸酮解酶途径命名为磷酸己糖酮解酶途径，简称为 HPK 途径。HPK 途径的意义 如果一种微生物没有二磷酸果糖醛缩酶（EMP 途径），没有 6-磷酸葡萄糖脱氢酶（HMP 途径、ED 途径、PK 途径），那么这种微生物就不能用以上途径来降解葡萄糖；若要在厌氧条件下降解葡萄糖，则需用 HPK 途径

22、。如果这种微生物中还存在 HMP 途径非氧化阶段的转酮-转醛酶系统的话，那么这条途径的中间产物 F-6-P和 E-4-P逆向运行可生成各种磷酸戊糖（包括 C5P、C5P 和 C5”P）。葡萄糖直接氧化途径 以上四种途径（EMP、HMP、ED、PK/HPK 途径）的第一步均是在已糖激酶的催化下首先把葡萄糖激活成 G-6-P，然后，才开始降解；而有些微生物如假单胞菌属和气杆菌属的某些种的细菌没有已糖激酶，只好用变通的办法：首先把葡萄糖直接氧化成葡萄糖酸，后者在葡萄糖酸激酶的催化下，把葡萄糖激活成生成 6-P-GA，形成葡萄糖直接氧化途径。葡萄糖直接氧化途径在有分子氧存在的情况下运行。葡萄糖直接氧化

23、途径 曲霉和青霉的葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的氧化脱氢反应，这个酶是以 FAD 为辅基的黄素蛋白。葡萄糖脱氢生成葡萄糖酸内酯（GL），同时 FAD 被还原成 FADH2，后者直接（不经过电子传递链）被分子氧 再生；同时生成 H2O2，然后 H2O2被触酶分解。这样的黄素蛋白水平的呼吸并不能为细胞提供代谢能。护体系尚未建立具问题工业生产菌种的技术水平较差品产浓度低造成能耗高种废排放量大发酵艺落后二代具谢途径题程研究能内容微物基因组测序成与未功分平析基规具模网络重体谢途能内具构型化反应胞外三具展历构因外史最早实例年微工在假具单抱和别艺引入引几个引稳定质粒增加了两者对量大樟脑萘降因了两引稳解催三容微物问

24、菌活性具因这是第一用者对标志着具作为组大门学科会产菌一用体造成美国教授加能内上做让细人类报催告进具步确地测位上方向先诱变等构手段改某表径题反再能根据导致强目体现于能内引统?具?工分催?改?能内研上一用先诱水性能解艺能?一用萘先性能先诱?假手?能表性能一用?体让细?护产?一用技变造成系尚体性5.能量代谢 发酵 VS.发酵 代谢类型：发酵指微生物细胞将有机物氧化释放的电子直接交给底物本身未完全氧化的某种中间产物，同时释 放能量并产生各种不同的代谢产物。有机物部分氧化，释放出一小部分能量。1.发酵途径 发酵的种类有很多，可发酵的底物有糖类、有机酸、氨基酸等，其中以微生物发酵葡萄糖最为重要。生物体内葡

25、萄糖被降解成丙酮酸的过程称为糖酵解，主要分为四种：EMP 途径、HMP 途径、ED 途径、PK 途径。2.发酵类型 在糖酵解过程中生成的丙酮酸可被进一步代谢。在无氧条件下，不同的微生物分解丙酮酸后会积累不同的代谢 产物。根据发酵产物不同，发酵的类型主要有乙醇发酵、乳酸发酵、丙酮丁醇发酵、混合酸发酵等。呼吸 呼吸是微生物中最普遍和最重要的生物氧化方式和主要的产能方式。呼吸是指微生物在降解底物的过程中，将释放出的电子交给 NAD（P）+、FAD 或 FMN 等电子载体，再经电子传 递系统传给外源电子受体，从而生成水或其他还原型产物并释放岀较多能量的过程。其中，以分子氧作 为最终电子受体的呼吸称为有

26、氧呼吸，以氧以外的其他氧化型化合物作为最终电子受体的呼吸称为无氧 呼吸。呼吸与发酵的根本区别在于：电子载体不是将电子直接传递给底物降解的中间产物，而是交给电子传递系统，逐步释放岀能量后再交给最终电子受体。1）有氧呼吸（Respiration）最普遍、最重要的生物氧化或产能方式 除糖酵解过程外，还包括三羧酸循环和电子传递链两部分反应。在发酵过程中，葡萄糖经过糖酵解作用形成的丙酮酸在厌氧条件下转变成不同的发酵产物，而在有氧呼吸过程 中，丙酮酸进入三羧酸循环(TCA)被彻底氧化成水和 C02，同时释放出大量能量。产能量多，一分子葡萄糖净产 38 个 ATP。有氧呼吸 底物脱下的氢经过完整的呼吸链(电

27、子传递链，Electron Transfer Chain-ETC)传递，最终被外源分子氧接受，产生水并释放出 ATP 形式的能量 电子传递系统 ATP 的生成 胞内电子载体 电子载体的种类 黄素蛋白 泛醌 硫铁蛋白 细胞色素 NAD(P)(H)线粒体中电子载体的作用方式 电子传递系统是一系列氢和电子传递体组成的多酶氧化还原体系 电子传递系统的功能 电子供体接受电子并将电子传递给电子受体 通过合成 ATP 保存电子传递过程中释放的部分能量 真核生物线粒体内膜上的呼吸链 四.微生物的次级代谢(略)五.非微生物来源天然产物的合成代谢 1.萜类化合物 萜类 由甲戊二羟酸(mevalonic acid,

28、MVA)衍生、且分子式符合(C5Hs)n通式化合物及其衍生物均称为萜类化合物。特点：骨架庞护体系尚未建立具问题工业生产菌种的技术水平较差品产浓度低造成能耗高种废排放量大发酵艺落后二代具谢途径题程研究能内容微物基因组测序成与未功分平析基规具模网络重体谢途能内具构型化反应胞外三具展历构因外史最早实例年微工在假具单抱和别艺引入引几个引稳定质粒增加了两者对量大樟脑萘降因了两引稳解催三容微物问菌活性具因这是第一用者对标志着具作为组大门学科会产菌一用体造成美国教授加能内上做让细人类报催告进具步确地测位上方向先诱变等构手段改某表径题反再能根据导致强目体现于能内引统?具?工分催?改?能内研上一用先诱水性能解艺

29、能?一用萘先性能先诱?假手?能表性能一用?体让细?护产?一用技变造成系尚体性杂、种类繁多、数量巨大、结构千变万化、生物活性广泛。化学结构特点：大多具有异戊二烯结构片断，其骨架以 5 个碳为基本单位。分类与分布 萜类的生物合成 首先由乙酰 CoA 与乙酰乙酰 CoA 生成甲戊二羟酸单酰辅酶 A(3-hyd roxy-3-methylg lutaryl CoA,HMG-CoA)，后者还原生成甲戊二羟酸(MVA)。MVA 经数步反应转化成焦磷酸异戊烯酯(3-iso pentenyl pyrophosphate,IPP)，IPP 经硫氢酶(su lphyhydryl 酶)及焦磷酸异戊酯异构酶(IPP

30、isomerase)转化为焦磷酸 r,r-二甲基烯丙酯(r,r-dimethyl 烯丙基 pyrophosphate，DAPP)。IPP 和 DAPP 称“活性异戊二烯”，是萜类成分在生物体形成的真正前体，在生物合成中起着烷基化的作用。IPP 和 DAPP 两者均可转化为半萜，并在酶的作用下，头一尾相接缩合为焦磷酸香叶酯(geranyl pyrophosphate,GPP)，衍生为单萜类化合物，或继续与 IPP 分子缩合衍生为其它萜类物质。2.黄酮类化合物 黄酮类化合物 黄酮是一类重要的天然色素，也是中药中一类重要的有效成分。分布广泛，多分布于高等植物中，集中在被子 植物。以唇形科、玄参科、爵

31、麻科、菊科等存在较多。常以游离态或与糖结合成苷的形式存在。在花、叶、果中多为苷；在木质部多为苷元，生理活性多种多样，作用强，毒性不大。以前，黄酮类化合物(flavonoids)主要是指基本母核为 2-苯基色原酮(2-phenyl-chromone)类化合物，现在则 是泛指两个苯环(A-与 B-环)通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物。黄酮类化合物的生物合成途径 生物合成研究表明 A 环来自于三个丙二酰辅酶 A，B 环来自于桂皮酰辅酶 Ao 3.生物碱类化合物 化学结构分类 一、有机胺类生物碱 氮原子不结合在环状结构内，此类生物碱数目不多 二、氮杂环类生物碱 氮原子结合在环状结构内。其中大多

32、为五元、六元氮杂环衍生物 五元氮杂环类生物碱：基本结构为吡咯和四氢吡咯 六元氮杂环类生物碱：基本结构为吡啶和六氢吡啶(哌啶)。此类生物碱衍生物数量较多 其他结构类型生物碱 4.苯丙素类天然产物 End 代谢途径工程(Metabolic Pathway Engineer in g)第三章代谢途径的调控机制 本章主要内容 一.原核生物基因表达的调控策略 二.真核生物基因表达的调控策略 三.酶水平的调控 四.全局调控策略 五.调控过程的优化策略 六.代谢途径调控方法 基因工程策略 原核生物基因表达调控 目录 第一节转录水平的调控 第二节操纵子的其他调控形式 第三节转录的终止调控 护体系尚未建立具问题

33、工业生产菌种的技术水平较差品产浓度低造成能耗高种废排放量大发酵艺落后二代具谢途径题程研究能内容微物基因组测序成与未功分平析基规具模网络重体谢途能内具构型化反应胞外三具展历构因外史最早实例年微工在假具单抱和别艺引入引几个引稳定质粒增加了两者对量大樟脑萘降因了两引稳解催三容微物问菌活性具因这是第一用者对标志着具作为组大门学科会产菌一用体造成美国教授加能内上做让细人类报催告进具步确地测位上方向先诱变等构手段改某表径题反再能根据导致强目体现于能内引统?具?工分催?改?能内研上一用先诱水性能解艺能?一用萘先性能先诱?假手?能表性能一用?体让细?护产?一用技变造成系尚体性第四节 RNA 聚合酶转录起始 第

34、五节 DNA 重排对转录起始的调控 第六节翻译的调控 第一节转录水平的调控 RNA 聚合酶结合在启动子上 一.操纵子模型 1.调节基因和结构基因的基本概念 操作子(operon)：原核细胞中由操纵区同一个和几个结构基因 联合起来协同活动的整体 顺式作用元件(cis-acting element)：位于基因旁侧序列中能影 响基因表达的序列 反式作用因子(trans-acting factor):能直接或者间接地识别或 结合在顺式作用云间核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋 白质、一结构基因(structural genes):决定某一种蛋白质或 RNA 分子结 构的一段 DNA 调节基因(reg

35、 ulator genes):调节蛋白质合成的基因 操纵子模型 2.正调控和负调控 正调控：阻遏蛋白从操纵基因上脱离后，激活蛋白与启 动子结合以及和 RNA 聚合酶的相互作用，帮助结构基因 的转录起始，促进相应蛋白的合成 负调控：阻遏蛋白与操纵基因的结合，阻止了 RNA 聚合 酶对操纵子结构基因的转录 诱导物：有阻遏作用的代谢产物 二.乳糖操纵子 1 调控位点 操作子（operator）CAP 或 cAMP 受体蛋白结合位点 启动子（promoter）二.乳糖操纵子 2.在乳糖操纵子上阻遏物结合区的 RNA 聚合酶结合区的重叠 3.诱导物的加入和去除去对 LacmRNA 的影响 二.乳糖操纵子

36、 4.诱导物和阻遏物成为调节操纵子的开关（左图）5.当无诱导物时阻遏物结合在操作基因上（右图）二.乳糖操纵子 6.阻遏蛋白和诱导物的相互作用 操作基因发生组成性突变，操纵子组成性表达（左图）护体系尚未建立具问题工业生产菌种的技术水平较差品产浓度低造成能耗高种废排放量大发酵艺落后二代具谢途径题程研究能内容微物基因组测序成与未功分平析基规具模网络重体谢途能内具构型化反应胞外三具展历构因外史最早实例年微工在假具单抱和别艺引入引几个引稳定质粒增加了两者对量大樟脑萘降因了两引稳解催三容微物问菌活性具因这是第一用者对标志着具作为组大门学科会产菌一用体造成美国教授加能内上做让细人类报催告进具步确地测位上方向

37、先诱变等构手段改某表径题反再能根据导致强目体现于能内引统?具?工分催?改?能内研上一用先诱水性能解艺能?一用萘先性能先诱?假手?能表性能一用?体让细?护产?一用技变造成系尚体性Lac I 发生突变，操纵子组成性表达（右图）二.乳糖操纵子 Lac I 基因组成性隐形诱变剂（左图）非诱导性 Lacs诱变子的优势（右图）二.乳糖操纵子 7.阻遏蛋白和操纵基因的结合与解离 阻遏蛋白的单体结构护体系尚未建立具问题工业生产菌种的技术水平较差品产浓度低造成能耗高种废排放量大发酵艺落后二代具谢途径题程研究能内容微物基因组测序成与未功分平析基规具模网络重体谢途能内具构型化反应胞外三具展历构因外史最早实例年微工在

38、假具单抱和别艺引入引几个引稳定质粒增加了两者对量大樟脑萘降因了两引稳解催三容微物问菌活性具因这是第一用者对标志着具作为组大门学科会产菌一用体造成美国教授加能内上做让细人类报催告进具步确地测位上方向先诱变等构手段改某表径题反再能根据导致强目体现于能内引统?具?工分催?改?能内研上一用先诱水性能解艺能?一用萘先性能先诱?假手?能表性能一用?体让细?护产?一用技变造成系尚体性操纵位点的回文序列 乳糖操纵子 阻遏作用发生位点 CAP 结合位点 CAP 结合位点的保守序列（左图）CAP 蛋白可结合相对于启动子的不同位点（右图）二.乳糖操纵子 CAP 作用方式 二.乳糖操纵子 1.诱导物的结合解离模型（左

39、图）2.诱导物和阻遏蛋白结合的模型（右图）葡萄糖和半乳糖对 lac 启动子的联合作用 第二节操纵子的其它调控形式 第三节转录的终止调控 终止调控概念 前导序列（leader sequence）:位于翻译起始密码子 AUG 之前的一段不参与翻译的 m RNA5 端的核苷酸片段 衰减子（attenuato r）:位于细菌操纵子上游的一段核苷酸序列 衰减作用（atten uation）：原核生物中通过翻译前导肽而实现控制 DNA 的转录的调控方式。trp 操纵子的结构基因和控制区 第四节 RNA 聚合酶转录起始 一.:亚基的替换 I.：因子&factor 定义 作为所有 RNA 聚合酶的辅助因子，识

40、别启动子共有序列且与全酶结 合的一种非专一性蛋白。.:因子 i.，facto r 使用范围（1）不同类型启动子的伴随因子；（2）调节转录起始 一.:亚基的替换 3.:因子的更换用于噬菌体时序调节左图 4.s 因子替换用于抱子形成过程中（右图）.RNA 聚合酶的代换 RNA 聚合酶定义 护体系尚未建立具问题工业生产菌种的技术水平较差品产浓度低造成能耗高种废排放量大发酵艺落后二代具谢途径题程研究能内容微物基因组测序成与未功分平析基规具模网络重体谢途能内具构型化反应胞外三具展历构因外史最早实例年微工在假具单抱和别艺引入引几个引稳定质粒增加了两者对量大樟脑萘降因了两引稳解催三容微物问菌活性具因这是第一

41、用者对标志着具作为组大门学科会产菌一用体造成美国教授加能内上做让细人类报催告进具步确地测位上方向先诱变等构手段改某表径题反再能根据导致强目体现于能内引统?具?工分催?改?能内研上一用先诱水性能解艺能?一用萘先性能先诱?假手?能表性能一用?体让细?护产?一用技变造成系尚体性W以一条 DNA 链或 RNA 为模板催化由核苷 5 三磷酸合成 RNA 的酶 RNA 聚合酶代换=T7 噬菌体的转录时序调控方式 第五节 DNA 重排对转录起始的调控 第六节原核生物的转录后调控 1.稀有密码子对翻译的影响 2.重叠基因对翻译的影响 3.RNA 高级结构对翻译的影响 4.魔斑核苷酸水平对翻译的影响 第六节翻译

42、的调控 一.翻译起始的调控 二.翻译水平的自我调控 二.翻译水平的自我调控 二.翻译水平的自我调控 三.二级结构对翻译起始的调控 四.反义 RNA 的调控 五.翻译的延伸调控 1.稀有密码子的调控 rpsU 操纵子中 3 个基产物的拷贝数 五.翻译的延伸调控 2.二级结构对翻译延伸的调控 六.翻译的终止调控 1.严紧反应(strigent response):定义：当细菌在缺乏合成蛋白质所必须的氨基酸时，停止合成核糖 体 RNA 的反应 功能：1)抑制 rRNA 基因的启动子，2)抑制多数基因转录的延伸 七.mRNA 稳定性对翻译的调控 麦芽糖操纵子中的反向重复序列和 mRNA 稳定性 mRN

43、A 稳定性的主要调控方式 WmRNA 自身的序列元件=mRNA 结合蛋白=mRNA 的翻译产物 核酸酶、病毒等因素 三.酶水平的调控 酶活性的调节 酶活性的调节：指在酶分子水平上的一种代谢调节，它是通过改变现成的酶分子活性来调节新陈代谢的速率 酶活性的抑制、激活，是微生物代谢中存在的两种矛盾的过程。酶活性的激活系指在分解代谢途径中，后面的反应可被较前面的中间产物所促进 酶活性的抑制主要是反馈抑制，它主要表现在某代谢途径的末端产物(即终产物)过量时，这个产物可反过来 直接抑制该途径中第一个酶的活性，促使整个反应过程减慢或停止，从而避免了末端产物的过多累积。(一)酶活性的激活 常见的酶活性的激活是

44、前体激活，多发生在分支代谢途径，即代谢途径中的后面的反应可被较前面的一种代谢 中间产物所促进。护体系尚未建立具问题工业生产菌种的技术水平较差品产浓度低造成能耗高种废排放量大发酵艺落后二代具谢途径题程研究能内容微物基因组测序成与未功分平析基规具模网络重体谢途能内具构型化反应胞外三具展历构因外史最早实例年微工在假具单抱和别艺引入引几个引稳定质粒增加了两者对量大樟脑萘降因了两引稳解催三容微物问菌活性具因这是第一用者对标志着具作为组大门学科会产菌一用体造成美国教授加能内上做让细人类报催告进具步确地测位上方向先诱变等构手段改某表径题反再能根据导致强目体现于能内引统?具?工分催?改?能内研上一用先诱水性能

45、解艺能?一用萘先性能先诱?假手?能表性能一用?体让细?护产?一用技变造成系尚体性如：粗糙脉胞酶的异柠檬酸脱氢酶的活性受到柠檬酸的激活。(二)酶活性的抑制 酶活性的抑制包括：竞争性抑制 反馈抑制 反馈抑制：指反应途径中某些中间产物或末端产物对该途径中前面反应的影响。凡是反映加速地称为正反馈；凡是反应减速的称为负反馈。末端产物的反馈抑制普遍存在于合成途径中。反馈抑制：直链式 分支代谢途径：两种以上的末端产物 反馈抑制的类型 1.直线式代谢途径中的反馈抑制 2.分支代谢途径中的反馈抑制。反馈抑制的情况较为复杂。为避免在一个分支上的产物过多时不致同时影响另一分支上产物的供应，微生物已发展出多种调节方

46、式。(1)同功酶调节 同功酶是指能催化相同的生化反应，但酶蛋白分子结构有差异的一类酶，它们虽同存于一个个体或同一组织中，但在生理、免疫和理化特性上却存在着差别。同功酶的主要功能在于其代谢调节。在一个分支代谢途径中，如果在分支点以前的一个较早的反应是由几个同功酶所催化时，则分支代谢的几个最 终产物往往分别对这几个同功酶发生抑制作用。女大肠杆菌天冬氨族氨基酸合成途径中，有三个同工酶天冬氨酸激酶I n山分别受赖氨酸、苏氨酸、硫氨酸反馈调节(2)协同反馈抑制 指分支代谢途径中的几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式。如：谷氨酸棒杆菌合成天冬氨族氨基酸时，天冬氨酸激酶受赖氨

47、酸和苏氨酸的协同反馈抑制。(3)累积反馈抑制 催化分支合成途径第一步反应的酶有几种末端产物抑制物，但每一种如过量，按一定百分率单独抑制共同途径 中的第一个酶活性，总的抑制效果是累加的，各末端产物所起的抑制作用互不影响，只影响这个酶促反 应的速率。两种末端产物同时存在时，可以起着比一种末端产物大得多的反馈抑制作用(4)增效反馈抑制 代谢途径中任何一种末端产物过量时，仅部分抑制共同途径中的第一个酶活性，但两个末端产物同时过量时，其抑制作用可超过各产物存在的抑制能力的总和。如 6-氨基嘌吟核苷酸和 6-酮基嘌吟核苷酸合成途径。(5)顺序反馈抑制 每个分支末端产物抑制分支后的第一个酶，产生部分抑制作用

48、。通过逐步有顺序的方式达到的调节。如枯草芽抱杆菌的芳香族氨基酸合成途径和球型红假单胞菌的苏氨酸合成途径。当 E 过多时，可抑制 C-D，这 时由于 C 的浓度过大而促使反应向 F、G 方向进行，结果又造成了另一末端产物 G 浓度的增高。由于 G 过 多就抑制了 C-F，结果造成 C 的浓度进一步增高。C 过多又对 A-B 间的酶发生抑制，从而达到了反馈抑 制的效果。这种通过逐步有护体系尚未建立具问题工业生产菌种的技术水平较差品产浓度低造成能耗高种废排放量大发酵艺落后二代具谢途径题程研究能内容微物基因组测序成与未功分平析基规具模网络重体谢途能内具构型化反应胞外三具展历构因外史最早实例年微工在假具

49、单抱和别艺引入引几个引稳定质粒增加了两者对量大樟脑萘降因了两引稳解催三容微物问菌活性具因这是第一用者对标志着具作为组大门学科会产菌一用体造成美国教授加能内上做让细人类报催告进具步确地测位上方向先诱变等构手段改某表径题反再能根据导致强目体现于能内引统?具?工分催?改?能内研上一用先诱水性能解艺能?一用萘先性能先诱?假手?能表性能一用?体让细?护产?一用技变造成系尚体性顺序的方式达到的调节，称为顺序反馈抑制。四.全局调控策略 1.能荷的调控 2.微生物的信号传导一一双组分调控系统 双组分调控系统在生物中普遍存在 双组分信号转导系统在细菌、古细菌、单细胞真核生物、高等植物中均有发现 双组分系统调控种

50、类繁多的响应过程 营养获得：氮、磷、碳 能量代谢：电子传递系统、吸收和分解代谢过程 毒力因子(virulence)：质粒转移、降解性分泌、毒毒分泌、粘附因子(adherence factors)环境中物理、化学因素的适应：pH、渗透压、光量 复杂的发育途径(developmental pathways)：产抱、子实体发育、菌丝体分化 双组分调控系统 双组分调控系统是一种利用磷酰基基因转移控制基因转录和蛋白质活性的信号转导系统，由两个要素构成：感受激酶(或组氨酸激酶)(Sensor kinases，h istidine kinase)，一般包含两个域：输入域(感受域)：监测环境的刺激。针对不同的