生物化学复习知识点概括中学教育中考中学教育中考.pdf

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1、生物化学复习知识点概括 B6 蛋白质的纯化（purification）一、蛋白质的稳定作用（stabilization）1.选择适当的缓冲液（PH=7）；2.操作温度：4；避免蛋白质变性和降解 3.添加蛋白酶抑制剂 二、硫酸铵沉淀法-蛋白质混合物的分级分离 加入硫酸铵盐离心 弃去上清液，重新再溶解蛋白 通过透析脱盐 结果：目标蛋白和溶解度相似的蛋白与溶解度差异较大的蛋白及非蛋白类物质相互分离。【盐析利用蛋白质的性质：溶解度】三、透析（dialysis）1.蛋白质是高分子化合物，不易透过半透膜，因此可用透析法纯化蛋白质，主要应用是脱盐(de-salting)。2.半透膜上的孔允许约 10kDa以

2、下分子通过，大多数蛋白质的分子质量超过了 10kDa，故会留在透析袋内。【到达平衡时，透析袋内的小分子浓度相同，故此需要多次更换周围的溶液-有效地降低小分子在蛋白质溶液中的浓度】四、凝胶过滤层析（Gel filtration chromatography)1.原理:柱子中的固定相为多孔凝胶颗粒(porous gel beads),具有一定的孔径;将蛋白质溶液加到柱子上端,并使一定缓冲液(buffer,即流动相)不断流过柱子,则大分子不能进入凝胶颗粒先被洗脱(eluted),而小分子进入凝胶颗粒,后被洗脱,因此,不同分子是基于它们的大小不同而被分离的。（1）多孔凝胶颗粒(不溶的、高度亲水的)。（

3、2）Elution volume(Ve)(洗脱体积)从样品被加到柱子上开始到其被洗脱出柱子所流过柱子缓冲液的总体积。（3）Void volume(Vo)(空体积)柱子内部除去凝胶颗粒以外的剩余体积。（相对洗脱体积(Ve/Vo)与分子量的对数呈线性关系）2.主要应用:样品的脱盐、蛋白质分子量的估计 五、离子交换层析(Ion exchange chromatography）1.原理:柱子中的固定相为带正电荷(positively charged)或负电荷(negatively charged)的颗粒(又称为离子交换剂 ion exchanger),在一定 pH 值下各种蛋白质所带净电荷不同,与离子

4、交换剂的作用方加蛋白酶抑制剂二硫酸铵沉淀法蛋白质混合物的分级分离加入硫酸铵盐离心弃去上清液重新再溶解蛋白通过透析脱盐结果目标蛋白和溶解度相似的蛋白与溶解度差异较大的蛋白及非蛋白类物质相互分离盐析利用蛋白质的性质溶解度下分子通过大多数蛋白质的分子质量超过了故会留在透析袋内到达平衡时透析袋内的小分子浓度相同故此需要多次更换周围的溶液有效地降低小分子在蛋白质溶液中的浓度四凝胶过滤层析原理柱子中的固定相为多孔凝胶颗粒具有一而小分子进入凝胶颗粒后被洗脱因此不同分子是基于它们的大小不同而被分离的多孔凝胶颗粒不溶的高度亲水的洗脱体积从样品被加到柱子上开始到其被洗脱出柱子所流过柱子缓冲液的总体积空体积柱子内部

5、除去凝胶颗粒以外的剩式和强弱也不同,可通过一定方式被先后洗脱下来,因此,不同分子是基于它们所带的净电荷(on the basis of their net charge)差异而被分离的。（1）阴离子交换剂(自身带正电),用于阴离子交换层析中,可吸附并分离带负电的蛋白质(阴离子)（2）阳离子交换剂(自身带负电),用于阳离子交换层析中,可吸附并分离带正电的蛋白质(阳离子)六、亲和层析（Affinity chromatography）1.原理:利用蛋白质与另一种分子(它的配体)的特异性结合的性质进行分离。如酶与其抑制剂或辅酶,抗体与抗原,受体与激素等。2.过程:配体(ligand)固定在不溶性支持物

6、上并装入柱中,混合蛋白通过亲和柱时,其它蛋白全流过,只有目标蛋白结合在固定化的配体上,使用缓冲液对柱子进行冲洗，最后加入含可溶性配体的缓冲液可将目标蛋白以高纯度的形式洗脱下来。随后再透析除去小分子配体。B7 蛋白质的电泳（electrophoresis）一、电泳（electrophoresis）1.定义：带净电荷的分子在电场中向一极或另一极移动的现象。2.净电荷越大，分子移动越快。加蛋白酶抑制剂二硫酸铵沉淀法蛋白质混合物的分级分离加入硫酸铵盐离心弃去上清液重新再溶解蛋白通过透析脱盐结果目标蛋白和溶解度相似的蛋白与溶解度差异较大的蛋白及非蛋白类物质相互分离盐析利用蛋白质的性质溶解度下分子通过大多

7、数蛋白质的分子质量超过了故会留在透析袋内到达平衡时透析袋内的小分子浓度相同故此需要多次更换周围的溶液有效地降低小分子在蛋白质溶液中的浓度四凝胶过滤层析原理柱子中的固定相为多孔凝胶颗粒具有一而小分子进入凝胶颗粒后被洗脱因此不同分子是基于它们的大小不同而被分离的多孔凝胶颗粒不溶的高度亲水的洗脱体积从样品被加到柱子上开始到其被洗脱出柱子所流过柱子缓冲液的总体积空体积柱子内部除去凝胶颗粒以外的剩3.原理：根据蛋白质的净负电荷和分子大小在电场中进行分离。小的带负电荷较多的蛋白质比较大的带负电荷较少的蛋白质在凝胶中迁移得快。二、SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）1.原理：用还原剂处理样品，使二

8、硫键打开,同时用阴离子去污剂SDS 使蛋白质变性，并使蛋白质覆盖负电荷,然后进行电泳。由于所有蛋白质都带与其质量成正比的负电荷，所以是根据它们的质量而被分离。小分子迁移快，大分子慢。2.特点：快速、灵敏、广泛使用 3.应用：测定蛋白质样品的纯度；估计未知蛋白质的分子质量；推测某种蛋白多肽亚基数目。C4 酶的抑制作用（Enzyme Inhibition）一、酶的抑制作用（Enzyme Inhibition）1.抑制剂（Inhibitors）：直接作用于酶并使它的催化速率降低的分子。包括正常机体代谢物、药物和毒物。2.酶的抑制作用类型：可逆的和不可逆的。可逆性抑制可分为竞争性抑制和非竞争性抑制。二

9、、不可逆性抑制 1.定义：抑制剂不可逆地与酶结合，它通常与活性部位或其附近的氨基酸残疾形成共价键，永久使酶失活。加蛋白酶抑制剂二硫酸铵沉淀法蛋白质混合物的分级分离加入硫酸铵盐离心弃去上清液重新再溶解蛋白通过透析脱盐结果目标蛋白和溶解度相似的蛋白与溶解度差异较大的蛋白及非蛋白类物质相互分离盐析利用蛋白质的性质溶解度下分子通过大多数蛋白质的分子质量超过了故会留在透析袋内到达平衡时透析袋内的小分子浓度相同故此需要多次更换周围的溶液有效地降低小分子在蛋白质溶液中的浓度四凝胶过滤层析原理柱子中的固定相为多孔凝胶颗粒具有一而小分子进入凝胶颗粒后被洗脱因此不同分子是基于它们的大小不同而被分离的多孔凝胶颗粒不

10、溶的高度亲水的洗脱体积从样品被加到柱子上开始到其被洗脱出柱子所流过柱子缓冲液的总体积空体积柱子内部除去凝胶颗粒以外的剩 三、可逆的竞争性抑制 1.典型的竞争性抑制剂与酶的正常底物有相似的结构，故它与底物分子竞争性地结合酶的活性部位，酶既可以结合底物分子也可以结合抑制剂分子，但不能同时与两者结合。2.竞争性抑制剂与活性部位可逆结合，底物浓度增高科消弱竞争性抑制剂的作用；因为足够高的底物浓度可将结合在活性部位的抑制剂分子竞争性地排出。（增加底物浓度，竞争性抑制剂的抑制作用降低）3.竞争性抑制剂存在时，酶的 Vmax不变，但酶对起底物的表现亲和力降低，Km增加。（竞争性抑制剂增加 Km，Vmax不变

11、）4.Lineweaver-Burk图：竞争性抑制剂使直线斜率增加，x 轴上截距变小（Km增大），y 轴截距不变（Vmax不变）。四、可逆的非竞争性抑制 1.非竞争性抑制剂与酶活性部位以外的部位可逆地结合，导致酶的三维构象变化，从而降低酶的催化速率。（酶既可以结合底物，也可以结合抑制剂，或两者同时结合）2.非竞争性抑制剂的抑制作用不受底物浓度增加的影响,所以Vmax降低。3.受非竞争性抑制剂作用时，酶对底物浓度的亲和力不变，所以Km不变。加蛋白酶抑制剂二硫酸铵沉淀法蛋白质混合物的分级分离加入硫酸铵盐离心弃去上清液重新再溶解蛋白通过透析脱盐结果目标蛋白和溶解度相似的蛋白与溶解度差异较大的蛋白及非

12、蛋白类物质相互分离盐析利用蛋白质的性质溶解度下分子通过大多数蛋白质的分子质量超过了故会留在透析袋内到达平衡时透析袋内的小分子浓度相同故此需要多次更换周围的溶液有效地降低小分子在蛋白质溶液中的浓度四凝胶过滤层析原理柱子中的固定相为多孔凝胶颗粒具有一而小分子进入凝胶颗粒后被洗脱因此不同分子是基于它们的大小不同而被分离的多孔凝胶颗粒不溶的高度亲水的洗脱体积从样品被加到柱子上开始到其被洗脱出柱子所流过柱子缓冲液的总体积空体积柱子内部除去凝胶颗粒以外的剩4.Lineweaver-Burk图：非竞争性抑制剂能增加直线斜率，改变y 轴截距（Vmax减少），使 x 轴上截距保持不变（Km不变）。C5 酶活性的

13、调节（Regulation of Enzyme Activity）一、反馈调节（Feedback regulation）1.反馈抑制（Feedback Inhibition）：是指最终产物抑制作用，即在代谢途径中，代谢途径的终产物对该途径前断的某种酶的抑制，这种抑制称为反馈抑制。二、变构酶（Allosteric Enzymes）1.一般性质：通常是多亚基蛋白质，有多个活性部位；也有调节部位；抑制剂结合调节位点降低酶 E活性，催化剂提高活性；其自身亚基通常是激活剂 2.特征：多为寡聚酶，含有两个或多个亚基。其分子中包括两个中心：一个是与底物结合、催化底物反应的活性中心；另一个是与调节物结合、调节

14、反应速度的别构中心。两个中心可能位于同一亚基上，也可能位于不同亚基上。在后一种情况中，存在别构中心的亚基称为调节亚基。别构酶是通过酶分子本身构象变化来改变酶的活性。3.变构模型：序变模型、齐变模型 加蛋白酶抑制剂二硫酸铵沉淀法蛋白质混合物的分级分离加入硫酸铵盐离心弃去上清液重新再溶解蛋白通过透析脱盐结果目标蛋白和溶解度相似的蛋白与溶解度差异较大的蛋白及非蛋白类物质相互分离盐析利用蛋白质的性质溶解度下分子通过大多数蛋白质的分子质量超过了故会留在透析袋内到达平衡时透析袋内的小分子浓度相同故此需要多次更换周围的溶液有效地降低小分子在蛋白质溶液中的浓度四凝胶过滤层析原理柱子中的固定相为多孔凝胶颗粒具有

15、一而小分子进入凝胶颗粒后被洗脱因此不同分子是基于它们的大小不同而被分离的多孔凝胶颗粒不溶的高度亲水的洗脱体积从样品被加到柱子上开始到其被洗脱出柱子所流过柱子缓冲液的总体积空体积柱子内部除去凝胶颗粒以外的剩 4.天冬氨酸转氨甲酰酶（Aspartate transcarbamoylase ATCase）(1)它催化嘧啶核苷酸合成途径中的第一个中间物 N-氨甲酰天冬氨酸的合成，ATCase受其代谢途径的终产物 CTP的反馈抑制。ATCase由 6 个催化亚基和 6 个调节亚基组成。当催化亚基和调节亚基混合时能迅速结合。（由 ATCase 催化生成的 N-氨甲酰天冬氨酸是嘧啶生物合成中的关键步骤和关键

16、调控点）(2)ATCase参与嘧啶合成时受其代谢途径的终产物 CTP的反馈抑制和中间产物之一的激活剂 ATP的调节。调节的机制：激活剂 ATP 含量高，传递给细胞的信号使提供给DNA 复制的能量充足，因此，ATCase被激活，合成所需的嘧啶核苷酸；党嘧啶足够时，CTP含量高，抑制 ATCase，从而阻止该途径中不需要的 N-氨甲酰天冬氨酸和随后的中间产物。5.可逆共价修饰：非蛋白质基团和酶分子之间的共价键的形成和断裂。6.蛋白水解的激活作用：一些酶合成时只是一个被称为酶原的较大的无活性的前体，它们中的一个或几个肽键经不可逆地水解而被激活。7.酶合成与分解调节：（1）某种特定酶在细胞或组织中的存

17、在的量取决于其合成与降解速率。对编码酶基因的诱导和阻遏程度、模板 mRNA 的降解速率均可加蛋白酶抑制剂二硫酸铵沉淀法蛋白质混合物的分级分离加入硫酸铵盐离心弃去上清液重新再溶解蛋白通过透析脱盐结果目标蛋白和溶解度相似的蛋白与溶解度差异较大的蛋白及非蛋白类物质相互分离盐析利用蛋白质的性质溶解度下分子通过大多数蛋白质的分子质量超过了故会留在透析袋内到达平衡时透析袋内的小分子浓度相同故此需要多次更换周围的溶液有效地降低小分子在蛋白质溶液中的浓度四凝胶过滤层析原理柱子中的固定相为多孔凝胶颗粒具有一而小分子进入凝胶颗粒后被洗脱因此不同分子是基于它们的大小不同而被分离的多孔凝胶颗粒不溶的高度亲水的洗脱体积

18、从样品被加到柱子上开始到其被洗脱出柱子所流过柱子缓冲液的总体积空体积柱子内部除去凝胶颗粒以外的剩改变酶蛋白合成的速率。酶蛋白合成后，可改变其降解速率（半衰期）对酶活性进行调节。（2）半衰期：蛋白质被降解 50%所需的时间，可反映某种酶的降解速率。D2 抗体：概述（Antibodies:an overview）一、轻链和重链：1.抗体的组成：抗体分子含有以二硫键连接在一起的 4 条多肽链，即两条相同的约 220 个氨基酸组成的轻链和两条相同的约 440 个氨基酸组成的重链。（1）基本结构：抗体分子由四条肽链通过链间二硫键组成 H2L2结构。（2）轻链和重链：重链：五类：a、g、m、d、e；轻链：

19、两型：k、l。2.抗原结合部位：由每条重链与它相邻轻链的 N端协同形成。故，每个抗体分子有两个抗原结合部位，即是二价体；一分子抗体可结合两分子抗原。（抗原结合部位由轻链和重链的高变部分绕在一起所形成）二、可变区和恒定区 1.三个功能区：加蛋白酶抑制剂二硫酸铵沉淀法蛋白质混合物的分级分离加入硫酸铵盐离心弃去上清液重新再溶解蛋白通过透析脱盐结果目标蛋白和溶解度相似的蛋白与溶解度差异较大的蛋白及非蛋白类物质相互分离盐析利用蛋白质的性质溶解度下分子通过大多数蛋白质的分子质量超过了故会留在透析袋内到达平衡时透析袋内的小分子浓度相同故此需要多次更换周围的溶液有效地降低小分子在蛋白质溶液中的浓度四凝胶过滤层

20、析原理柱子中的固定相为多孔凝胶颗粒具有一而小分子进入凝胶颗粒后被洗脱因此不同分子是基于它们的大小不同而被分离的多孔凝胶颗粒不溶的高度亲水的洗脱体积从样品被加到柱子上开始到其被洗脱出柱子所流过柱子缓冲液的总体积空体积柱子内部除去凝胶颗粒以外的剩（1）可变区(Variable region,VH和 VL)：抗原的识别、结合。（2）恒定区(Constant region,CH和 CL)：含补体结合位点、巨噬细胞 FC受体结合位点。（L链 C端 1/2 处，H链 C端 3/4-4/5处）（3）铰链区(Hinge region)：结构柔软，通过变构促进抗体-抗原结合、暴露补体结合位点和 FC 受体结合位

21、点,引发免疫反应。2.每一条轻链和重链都有一个 N端的可变区和一个 C端的恒定区。3.可变区的变异性主要局限于 3 个高变区，其余部分的变异性小，称为构架区。（1）高变区也称为互补决定区,在与抗原的识别、结合中起重要的作用。（2）构架区通常不与抗原直接接触。D4 作为工具的抗体 一、酶联免疫吸附测定法(ELISA)-对样品中特定的蛋白质抗原进行定量 1.原理：将抗体固定在惰性多聚体载体上，然后与样品接触，洗去未结合的蛋白质，加入可与抗原其他表位结合的第二抗体，在第二抗体上结合有酶，可将无色底物转变为有色产物，第二抗体的结合量即加蛋白酶抑制剂二硫酸铵沉淀法蛋白质混合物的分级分离加入硫酸铵盐离心弃

22、去上清液重新再溶解蛋白通过透析脱盐结果目标蛋白和溶解度相似的蛋白与溶解度差异较大的蛋白及非蛋白类物质相互分离盐析利用蛋白质的性质溶解度下分子通过大多数蛋白质的分子质量超过了故会留在透析袋内到达平衡时透析袋内的小分子浓度相同故此需要多次更换周围的溶液有效地降低小分子在蛋白质溶液中的浓度四凝胶过滤层析原理柱子中的固定相为多孔凝胶颗粒具有一而小分子进入凝胶颗粒后被洗脱因此不同分子是基于它们的大小不同而被分离的多孔凝胶颗粒不溶的高度亲水的洗脱体积从样品被加到柱子上开始到其被洗脱出柱子所流过柱子缓冲液的总体积空体积柱子内部除去凝胶颗粒以外的剩为原样品中存在的蛋白质抗原量，根据产物颜色强度可进行定量测定。

23、（ELISA利用第二抗体上连接的酶将无色的底物转化成有色的产物）2.步骤：（1）一抗结合到固相支持物上；（2）加入含有抗原的样品，孵育，漂洗以去除未结合的分子；（3）加入结合有酶的二抗；（4）漂洗以去除未结合的二抗，与酶作用底物共同孵育。二、免疫印迹法(Immunoblotting)-测定混合物中一种以上的抗原 1.原理：将蛋白质样品用单向 SDS-PAGE 进行分离，或用双向 PAGE分离，再把分离出的蛋白质转移（印迹）到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，与此蛋白质的特异抗体共同孵育，然后洗去未结合的抗体，与抗体结合的蛋白质用放射自显影术进行测定，或使用已标记的第二抗体使其与第一抗体结合，再进行测定。

24、2.蛋白质印记法(Western Blotting)（1)蛋白质 SDS-PAGE电泳分离;(2)将蛋白质转移到膜上(印迹)-电转移;(3)膜与抗体溶液温浴;(4)洗去未结合抗体;(5)检测结合的抗体-使用放射性标记的二或酶标二抗(ELISA)F3 原核生物中DNA 的复制(DNA Replication in Bacteria)一、DNA 聚合酶(DNA polymerase)加蛋白酶抑制剂二硫酸铵沉淀法蛋白质混合物的分级分离加入硫酸铵盐离心弃去上清液重新再溶解蛋白通过透析脱盐结果目标蛋白和溶解度相似的蛋白与溶解度差异较大的蛋白及非蛋白类物质相互分离盐析利用蛋白质的性质溶解度下分子通过大多数

25、蛋白质的分子质量超过了故会留在透析袋内到达平衡时透析袋内的小分子浓度相同故此需要多次更换周围的溶液有效地降低小分子在蛋白质溶液中的浓度四凝胶过滤层析原理柱子中的固定相为多孔凝胶颗粒具有一而小分子进入凝胶颗粒后被洗脱因此不同分子是基于它们的大小不同而被分离的多孔凝胶颗粒不溶的高度亲水的洗脱体积从样品被加到柱子上开始到其被洗脱出柱子所流过柱子缓冲液的总体积空体积柱子内部除去凝胶颗粒以外的剩 1.DNA 聚合酶 I（DNA polymerase I）（1）来源：大肠杆菌；（2）需要 4 种 dNTP(dATP、dGTP、dTTP、dCTP)作为前体，Mg2+;DNA模板和由酶延伸的 3-OH端的引物

26、。（3）活性：5 3 聚合酶活性；3 5 外切核酸酶活性；5 3 外切核酸酶活性（4）DNA聚合酶 I 是受模板指导的酶，它识别 DNA模板上的下一个核苷酸，并将一个与该核苷酸互补的核苷酸加到引物的 3-OH端，形成 3，5-磷酸二酯键，释放出焦磷酸。二、冈崎片段（Okazaki fragments）1.Leading strand(前导链)：在 3 5 链为模板时，以 5 3 方向连续合成的新生 DNA。2.Okazaki fragments（冈崎片段）：在方向为 5 3 的模板链上，DNA聚合酶以 5 3 方向合成小片段 DNA，这些连接起来的片段即称为冈崎片段 3.：Lagging st

27、rand(滞后链)：不连续合成的 DNA 链 三、RNA 引物（RNA Primer）加蛋白酶抑制剂二硫酸铵沉淀法蛋白质混合物的分级分离加入硫酸铵盐离心弃去上清液重新再溶解蛋白通过透析脱盐结果目标蛋白和溶解度相似的蛋白与溶解度差异较大的蛋白及非蛋白类物质相互分离盐析利用蛋白质的性质溶解度下分子通过大多数蛋白质的分子质量超过了故会留在透析袋内到达平衡时透析袋内的小分子浓度相同故此需要多次更换周围的溶液有效地降低小分子在蛋白质溶液中的浓度四凝胶过滤层析原理柱子中的固定相为多孔凝胶颗粒具有一而小分子进入凝胶颗粒后被洗脱因此不同分子是基于它们的大小不同而被分离的多孔凝胶颗粒不溶的高度亲水的洗脱体积从样

28、品被加到柱子上开始到其被洗脱出柱子所流过柱子缓冲液的总体积空体积柱子内部除去凝胶颗粒以外的剩 1.Primase(引物酶):合成一段 RNA引物,为冈崎片段和前导链的合成提供 3-OH。引物酶由 RNA 聚合酶聚合而成。2.与所有 RNA 聚合酶一样，引物酶不需要引物就可以开始合成，它能直接在单链 DNA 模板上合成 RNA。3.引物酶合成的引物有 DNA 聚合酶进行延伸。DNA 聚合酶负责前导链和冈崎片段的合成。四、DNA 解旋、复制需的酶和蛋白质：1.DNA解 旋：DNA 解 旋 酶（Helicase）、拓 扑 异 构 酶 I（Topoisomerase I）、拓扑异构酶 II（Topoi

29、somerase II）、单链结合蛋白（SSB protein）2.DNA 复制：DNA聚合酶和、引物酶、DNA连接酶、其他蛋白质 G2 原 核 生 物 中 基 因 的 转 录（Transcription in prokaryotes）一、转录的三个阶段（three phases of transcription）1.反义链（Antisense(-)strand）【模板链（Template strand）】：转录中作为模版使用的 DNA 链。2.正义链（Sense(+)strand）【编码链（Coding strand）】：与转录产物 RNA 具有相同序列的 DNA 链。加蛋白酶抑制剂二硫酸铵

30、沉淀法蛋白质混合物的分级分离加入硫酸铵盐离心弃去上清液重新再溶解蛋白通过透析脱盐结果目标蛋白和溶解度相似的蛋白与溶解度差异较大的蛋白及非蛋白类物质相互分离盐析利用蛋白质的性质溶解度下分子通过大多数蛋白质的分子质量超过了故会留在透析袋内到达平衡时透析袋内的小分子浓度相同故此需要多次更换周围的溶液有效地降低小分子在蛋白质溶液中的浓度四凝胶过滤层析原理柱子中的固定相为多孔凝胶颗粒具有一而小分子进入凝胶颗粒后被洗脱因此不同分子是基于它们的大小不同而被分离的多孔凝胶颗粒不溶的高度亲水的洗脱体积从样品被加到柱子上开始到其被洗脱出柱子所流过柱子缓冲液的总体积空体积柱子内部除去凝胶颗粒以外的剩 3.大肠杆菌

31、RNA 聚合酶进行的三个转录阶段：起始（initiation）、延伸（Elongation）和终止（Termination）二、启动子和起始（Promoters and initiation）1.Promoter(启动子)：是指 RNA聚合酶识别、结合并开始转录的一段 DNA 序列,位于基因上游(5 端)。2.启动子的识别需要因子，它可增加 RNA 聚合酶和启动子的特异性结合，减少非特异性结合。3.两个重要的原核启动子元件（promoter elements）（1）-35 sequence：亚基识别并结合位点；共有序列 TTGACA （2）-10 sequence：亚基识别、有助于解旋；共有序

32、列 TATAAT 三、延伸（Elongation）1.核心酶(core enzyme)：转录开始后，因子从转录复合体上脱落下来，所留下的酶即为核心酶。（1）特点：需要 DNA 模板；具有 5 3 的聚合酶活性，但没有 3核酸外切酶活性；4NTPs（ATP，GTP，CTP，UTP）为底物；不需要底物；有 DNA 解旋酶活性。（2）伸长的 RNA 链是由核心酶催化的 2.三重复合体：RNA 聚合酶、DNA 模板和新的 RNA 转录产物复合物。3.转录泡(transcription bubble):转录过程中 DNA 解旋的区域。加蛋白酶抑制剂二硫酸铵沉淀法蛋白质混合物的分级分离加入硫酸铵盐离心弃去

33、上清液重新再溶解蛋白通过透析脱盐结果目标蛋白和溶解度相似的蛋白与溶解度差异较大的蛋白及非蛋白类物质相互分离盐析利用蛋白质的性质溶解度下分子通过大多数蛋白质的分子质量超过了故会留在透析袋内到达平衡时透析袋内的小分子浓度相同故此需要多次更换周围的溶液有效地降低小分子在蛋白质溶液中的浓度四凝胶过滤层析原理柱子中的固定相为多孔凝胶颗粒具有一而小分子进入凝胶颗粒后被洗脱因此不同分子是基于它们的大小不同而被分离的多孔凝胶颗粒不溶的高度亲水的洗脱体积从样品被加到柱子上开始到其被洗脱出柱子所流过柱子缓冲液的总体积空体积柱子内部除去凝胶颗粒以外的剩四、终止（Termination）1.转录持续进行直到到达终止序

34、列。2.Termination sequence(终止序列)：提供转录终止信号的 DNA序列，也称为终止信号或终止位点；终止序列通常是一段富含 GC的区域，使得解旋过程减缓或暂时停止。3.原核基因典型的终止序列(信号)：反向重复序列也称回文序列。（1）一段富含 GC的回文序列(palindrome)以及随后的一段寡聚A.4.原核生物终止序列典型特征：富含 GC的回文序列 5.缺少发夹结构的终止子需要另外的 终止因子（一种蛋白）去识别终止位点，停止转录。G3 操纵子（operons）一、操纵子：入门 1.操纵子(operons):是成簇排列的结构基因受单个操纵位点控制，与调节基因一起包装结构基因

35、的表达受到协调调控。原核生物基因组中的一个表达调控序列（一个转录单位），由若干功能相关的结构基因串联在一起，其转录受到同一调控系统的调控。-form teacher 2.操纵子模型：加蛋白酶抑制剂二硫酸铵沉淀法蛋白质混合物的分级分离加入硫酸铵盐离心弃去上清液重新再溶解蛋白通过透析脱盐结果目标蛋白和溶解度相似的蛋白与溶解度差异较大的蛋白及非蛋白类物质相互分离盐析利用蛋白质的性质溶解度下分子通过大多数蛋白质的分子质量超过了故会留在透析袋内到达平衡时透析袋内的小分子浓度相同故此需要多次更换周围的溶液有效地降低小分子在蛋白质溶液中的浓度四凝胶过滤层析原理柱子中的固定相为多孔凝胶颗粒具有一而小分子进入凝

36、胶颗粒后被洗脱因此不同分子是基于它们的大小不同而被分离的多孔凝胶颗粒不溶的高度亲水的洗脱体积从样品被加到柱子上开始到其被洗脱出柱子所流过柱子缓冲液的总体积空体积柱子内部除去凝胶颗粒以外的剩 （1）一系列结构基因（structural gene）：编码调控蛋白质的基因;（2）一个操纵基因位点（operator site）:调控结构基因转录的DNA 序列；（3）一个调控基因（regulator gene）:编码识别操纵基因序列的蛋白质。二、乳糖操纵子（the lac operon）1.编码参与乳糖代谢的关键酶：（1）半乳糖苷透性酶（galactoside permease）-可使乳糖穿过细胞膜进入

37、细胞；（2）-半乳糖苷酶（-galactosidase）-可水解乳糖生成葡萄糖、半乳糖。2.编码的第三个酶：硫代半乳糖苷酰基转移酶 3.诱导（induction）机制：在诱导前细胞内极少-半乳糖苷酶可将乳糖分解成异乳糖，然后异乳糖打开 lac 操纵子上这三种基因细菌中许多编码蛋白质的转录开关。4.lac操纵子诱导物：异乳糖、异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）（不是大肠杆菌的代谢产物）【诱导物：凡能诱导操纵子开启的效应物称为诱导物】5.lac操纵子结构基因：（1）lacZ-编码-半乳糖苷酶 （2）lacY-编码半乳糖苷透性酶 加蛋白酶抑制剂二硫酸铵沉淀法蛋白质混合物的分级分离加入硫酸铵盐离心弃去上清

38、液重新再溶解蛋白通过透析脱盐结果目标蛋白和溶解度相似的蛋白与溶解度差异较大的蛋白及非蛋白类物质相互分离盐析利用蛋白质的性质溶解度下分子通过大多数蛋白质的分子质量超过了故会留在透析袋内到达平衡时透析袋内的小分子浓度相同故此需要多次更换周围的溶液有效地降低小分子在蛋白质溶液中的浓度四凝胶过滤层析原理柱子中的固定相为多孔凝胶颗粒具有一而小分子进入凝胶颗粒后被洗脱因此不同分子是基于它们的大小不同而被分离的多孔凝胶颗粒不溶的高度亲水的洗脱体积从样品被加到柱子上开始到其被洗脱出柱子所流过柱子缓冲液的总体积空体积柱子内部除去凝胶颗粒以外的剩 （3）lacA-编码硫代半乳糖苷酰基转移酶 三种结构基因被转录成一

39、条多顺反子 mRNA(polycistronic mRNA)。然后翻译合成所以的三种酶【多顺反子 mRNA-确保了对三种基因产物产量的协调调节】三、乳糖阻遏蛋白（lac 阻遏物）1.lacI基因具有能够和 RNA聚合酶结合的自身启动子（Plac），转录出 lac 阻遏物 mRNA，从而合成 lac 阻遏物蛋白单体。【阻遏物：凡能导致操纵子关闭，阻遏转录过程的效应物称为辅助阻遏物】2.作用机制：（1）在没有诱导物的情况下，lacI基因被转录，生成的阻遏物蛋白结合于 lac 操纵子的操纵基因位点（Olac），阻止 lacZ、lacY、lacA 基因的转录。（2）诱导时，诱导物和阻遏物结合，引起阻遏

40、物的构象改变，从而降低它与 lac 操纵基因位点的结合力，然后 lac 阻遏物从操纵基因位点解离下来，RNA 聚合酶（已位于启动子位点的邻近位置）开始转录 lacZ、lacY、lacA 基因。【诱导物使 lac 阻遏物失活，因而使结构基因得以转录】（3）移去诱导物，lac 阻遏物迅速与操纵基因位点结合，转录过程几乎立即被抑制。加蛋白酶抑制剂二硫酸铵沉淀法蛋白质混合物的分级分离加入硫酸铵盐离心弃去上清液重新再溶解蛋白通过透析脱盐结果目标蛋白和溶解度相似的蛋白与溶解度差异较大的蛋白及非蛋白类物质相互分离盐析利用蛋白质的性质溶解度下分子通过大多数蛋白质的分子质量超过了故会留在透析袋内到达平衡时透析袋

41、内的小分子浓度相同故此需要多次更换周围的溶液有效地降低小分子在蛋白质溶液中的浓度四凝胶过滤层析原理柱子中的固定相为多孔凝胶颗粒具有一而小分子进入凝胶颗粒后被洗脱因此不同分子是基于它们的大小不同而被分离的多孔凝胶颗粒不溶的高度亲水的洗脱体积从样品被加到柱子上开始到其被洗脱出柱子所流过柱子缓冲液的总体积空体积柱子内部除去凝胶颗粒以外的剩四、分解代谢物激活蛋白/cAMP受体蛋白（CAP/CRP）1.lac操纵子高水平转录所需要的一个特点蛋白-分解代谢物激活蛋白（CAP）或 cAMP受体蛋白（CRP）。（1）该二聚体蛋白不能和 DNA 结合，需和 cAMP形成复合物 （2）CRP-cAMP 复合物和

42、lac 启动子（恰好位于 RNA 聚合酶结合位点上游）结合，可提高 RNA 聚合酶结合力，继而激活 lac 操纵子的转录。2.只有当乳糖存在而葡萄糖缺乏时，lacZ、lacY、lacA 基因才会被转录。（原理：见书）五、正调控和负调控 1.正调控（positive control/regulation）：指调控蛋白与 DNA 结合后可以提高转录效率。2.负调控(negative control/regulation）：阻遏物结合后阻止结构基因的转录。lac 操纵子是基因表达负调控。【lac 操纵子是同时受正、负调控的】G7 真核生物 mRNA 前体的加工 一、概述 1.真核生物中，编码蛋白质的

43、基因的转录产物是 mRNA 前体，需经过一系列的加工才能成为功能性 mRNA 分子。加蛋白酶抑制剂二硫酸铵沉淀法蛋白质混合物的分级分离加入硫酸铵盐离心弃去上清液重新再溶解蛋白通过透析脱盐结果目标蛋白和溶解度相似的蛋白与溶解度差异较大的蛋白及非蛋白类物质相互分离盐析利用蛋白质的性质溶解度下分子通过大多数蛋白质的分子质量超过了故会留在透析袋内到达平衡时透析袋内的小分子浓度相同故此需要多次更换周围的溶液有效地降低小分子在蛋白质溶液中的浓度四凝胶过滤层析原理柱子中的固定相为多孔凝胶颗粒具有一而小分子进入凝胶颗粒后被洗脱因此不同分子是基于它们的大小不同而被分离的多孔凝胶颗粒不溶的高度亲水的洗脱体积从样品

44、被加到柱子上开始到其被洗脱出柱子所流过柱子缓冲液的总体积空体积柱子内部除去凝胶颗粒以外的剩 2.mRNA前体加工过程：（1）5端加上 5帽子【加帽】（2)RNA剪接；（3）3多聚腺苷酸化【多聚腺苷酸化】二、5端加工：加帽 帽子可以保护初级转录物的 5端免受核糖核酸酶的攻击；只有真核生物编码蛋白质的基因的 RNA转录物加帽，原核生物的 mRNA、真核生物 rRNA和 tRNA都不加帽。三、RNA 剪接（RNA splicing）1.RNA 剪接（RNA splicing）:从 DNA模板链中出来的初级转录物除去内含子，并将相邻外显子的末端连接起来形成功能性的 mRNA 分子的过程。2.剪接位点（

45、splicing site）（1）5剪接位点-位于内含子的 5端，常为 GU（2）3剪接位点-位于内含子的 3端，常为 AG 3.反应：（1）分支点腺苷酸残基的 2-OH攻击 5剪接位点的 3，5-磷酸二酯键使之断裂；（2）内含子的 5端回转与分支点序列的腺苷酸残基形成异常 2，5 键。4.两步转酯反应（transesterification reaction）加蛋白酶抑制剂二硫酸铵沉淀法蛋白质混合物的分级分离加入硫酸铵盐离心弃去上清液重新再溶解蛋白通过透析脱盐结果目标蛋白和溶解度相似的蛋白与溶解度差异较大的蛋白及非蛋白类物质相互分离盐析利用蛋白质的性质溶解度下分子通过大多数蛋白质的分子质量超

46、过了故会留在透析袋内到达平衡时透析袋内的小分子浓度相同故此需要多次更换周围的溶液有效地降低小分子在蛋白质溶液中的浓度四凝胶过滤层析原理柱子中的固定相为多孔凝胶颗粒具有一而小分子进入凝胶颗粒后被洗脱因此不同分子是基于它们的大小不同而被分离的多孔凝胶颗粒不溶的高度亲水的洗脱体积从样品被加到柱子上开始到其被洗脱出柱子所流过柱子缓冲液的总体积空体积柱子内部除去凝胶颗粒以外的剩 （1）转酯反应：在两步 RNA剪接反应中，一个磷酸酯键与另一个发生交换的反应。（2）因磷酸酯键数目没变，故没有 ATP的消化。（3）剪接的两步连续转酯反应：A.第一步转酯反应：分支点腺苷酸残基的 2-OH攻击 5剪接位点的 3，

47、5-磷酸二酯键使之断裂，游离出来的 5磷酸与分支位点腺苷酸残基的 2羟基连接。B.第二步转酯反应：外显子的新 3-OH攻击 3剪接位点的磷酸二酯键，将两个外显子连接起在一起并释放套索状的内含子。5.剪接体（spliceosome）:在将被去除的内含子处所形成的一个多组分复合体，使内含子环化。（1）组成：含有 5 种 RNA（U1、U2、U4、U5、U6），统称为核内小RNA（snRNA），每种 snRNA长 100300nt，与几种蛋白质形成复合物。这些 RNA-蛋白质复合物称作小核内核糖蛋白（snRNP）四、3 端加工：剪切和多聚腺苷酸化（cleavage and polyadenylati

48、on）1.mRNA 多聚腺苷酸化：RNA 的 3端剪切后加上约 200 个腺苷酸残基组成的 poly(A)尾。2.多聚腺苷酸化信号序列（polyadenylation sifnal sequnence）（1）位于：mRNA 前体的近 3端 加蛋白酶抑制剂二硫酸铵沉淀法蛋白质混合物的分级分离加入硫酸铵盐离心弃去上清液重新再溶解蛋白通过透析脱盐结果目标蛋白和溶解度相似的蛋白与溶解度差异较大的蛋白及非蛋白类物质相互分离盐析利用蛋白质的性质溶解度下分子通过大多数蛋白质的分子质量超过了故会留在透析袋内到达平衡时透析袋内的小分子浓度相同故此需要多次更换周围的溶液有效地降低小分子在蛋白质溶液中的浓度四凝胶过

49、滤层析原理柱子中的固定相为多孔凝胶颗粒具有一而小分子进入凝胶颗粒后被洗脱因此不同分子是基于它们的大小不同而被分离的多孔凝胶颗粒不溶的高度亲水的洗脱体积从样品被加到柱子上开始到其被洗脱出柱子所流过柱子缓冲液的总体积空体积柱子内部除去凝胶颗粒以外的剩（2）信号：5-AAUAAA-3 3.poly(A)尾可以保护成熟 mRNA 免受核酸酶消化，并稳定整个分子，也可增强 mRNA 的翻译。H1 遗传密码(The Genetic Code)一The genetic code(遗传密码)1.遗传密码（genetic code）：mRNA 上的核苷酸序列和多肽链氨基酸序列之间的关系 2.终止密码子（Stop

50、 codons）：不编码任何氨基酸的密码子-UAA、UAG、UGA 3.起始密码子（Start codon）：核糖体阅读 mRNA 的第一个密码子-AUG 二、遗传密码的特征（The Features of the Genetic Code）1.遗传密码是连续的三联体密码；2.遗传密码是简并的；3.前两个碱基通常足以确定一种特定氨基酸；（降低碱基突变引起的危害）4.性质相似的氨基酸的密码子具有相似的序列；（降低碱基突变引起的危害）5.64个密码子中只有 61 个为氨基酸编码；加蛋白酶抑制剂二硫酸铵沉淀法蛋白质混合物的分级分离加入硫酸铵盐离心弃去上清液重新再溶解蛋白通过透析脱盐结果目标蛋白和溶解