分子生物学实验技术实验操作指南.docx

《分子生物学实验技术实验操作指南.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学实验技术实验操作指南.docx（22页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、分子生物学试验技术试验操作指南2名目1 植物基因序列分析32 引物设计的原则43 试剂的配置和灭菌54 植物基因组DNA 的提取65 DNA 的定量86 DNA 的电泳98 PCR 产物的回收129 PCR 产物连接T 载体和感受态细胞的转化1410 菌落液PCR1711 质粒 DNA 的提取1912 质粒 DNA 的酶切211植物基因序列分析1. 基因组DNAgenomic DNA, gDNA：功能基因包括三个根本序列：5上游区，转录区和 3下游区。2. 5上游区和 3下游区：转录起始位点上游和转录终止位点下游的序列，主要起到基因表达调控作用。3. 转录区：转录起始位点和转录终止位点之间的序

2、列，经核不均一 RNA 最终被加工为成熟的 mRNA。4. 信使RNAmessenger RNA, mRNA：由 DNA 的一条链作为模板转录而来的，携带遗传信息的能指导蛋白合成的一类单链核糖核酸。由编码区、上游的 5非编码区和下游3非编码区组成，5端带有 7-甲基鸟苷-三磷酸帽子构造，3端有多腺苷酸尾巴。5. 互补DNAcomplementary DNA, cDNA：具有与某 mRNA 链呈互补的碱基序列的单链 DNA。6. 蛋白质编码区sequence coding for amino acids in protein, CDS ：与蛋白质序列一一对应的 DNA 序列，且该序列中间不含其它

3、非该蛋白质对应的序列。只有外显子，不含内含子。7. 5非翻译区5-untranslated region, 5UTR：mRNA 位于基因转录起始位点至编码区翻译起始密码子之间挨次。8. 3非翻译区3-untranslated region, 3UTR：mRNA 位于编码区翻译终止密码子下游一段不被翻译的序列。32引物设计的原则1. 引物长度：一般为 20-25bp。假设产物长度等于或小于 500bp，可选用 16-18bp 的引物； 假设产物长达 5kb，则需要用更长的引物。 加有酶切位点的引物可适当延长。2. 引物的特异性：最好在模板cDNA 的保守区内设计，设计好后需要通过序列比对判别其特

4、异性。3. 引物GC 含量：GC 含量在 40%60%之间，以 45-55%为宜。4. 引物Tm：Tm 值是 DNA 熔解温度，指把 DNA 的双螺旋构造降解一半时的温度。引物所 对 应 模 板 序 列 的 Tm 值 最 好 在 72 左 右 。 至 少 要 在 55-80 之 间 。Tm=2(A+T)+4(C+G)5. 引物序列随机性：ATGC 最好随机分布，避开 5 个以上嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。引物自身：不能含有很长的结实的自身互补序列，尤其是引物3端回折形成的发夹一6.不要般超过 3bp。引物之间：两个引物之间不应有很长的结实的互补或同源碱基，尤应避开3端的互补7.重叠。8. 引物

5、 3端：引物 3末端和模板的碱基完全配对； 防止发夹构造和二聚体形成。9. 引物的 5端：引物的 5端可以修饰，加酶切位点、标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA 序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列。43 试剂的配置和灭菌一、试剂的配置：1. 利用电子天平称取固体试剂或者量筒或移液器量取液体试剂溶于适量的溶剂。2. 如需调整pH 值，需要pH 计的测定下用酸或碱滴定至目标pH。3. 试剂配置的原则是先配置浓度高的各组分溶液，然后再将各组分溶液混合获得各种缓冲溶液和试剂的贮存液，灭菌后低温保存，需要时再稀释到工作液浓度使用。二、试剂和耗材的高压蒸汽灭菌：在高温高压

6、条件下，利用湿热使细菌、真菌、芽孢、孢子等微生物的蛋白变性，进而死亡到达灭菌的效果。主要适用于耐高温、高压，不怕潮湿的试剂与耗材。1. 预备：向高压蒸汽灭菌锅内加水至水位标记线，将预备灭菌的试剂及耗材用牛皮纸包好，装入锅内套层中物品放置不宜过多，锅内应留出确定空间；然后拧紧锅盖。2. 加热：加热，当压力表上升到所需压力时一般为100KPa/121，灭菌 15-30min。3. 完毕：待压力表降至“0”时，翻开锅盖，取出灭菌物品。4. 留意事项：严格遵照操作规程，防止意外事故发生；易燃，易爆物品禁用高压蒸气灭菌；瓶装液体灭菌时，应留有适当排气出口，灭菌完毕后再密闭；耗材灭菌完毕后最好烘干。三、试

7、剂的过滤灭菌：承受过滤法除去微生物，适合于对热不稳定的试剂。将待过滤溶液吸入注射器，通过压力使溶液经过过滤器内含孔径为 0.22-0.45m 的过滤膜进入无菌容器。54 植物基因组 DNA 的提取一、试验目的：去除蛋白质、RNA 等高分子物质，去除多糖、多酚等次生物质，获得高品质的植物基因组DNA，可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern 杂交等试验。二、试验原理：十六烷基三甲基溴化胺cetyltriethylammonium bromide, CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中0.7M NaCl， CT

8、AB 与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后参与异丙醇或乙醇沉淀即可使核酸分别出来。三、试验试剂：1. 2%CTAB 提取缓冲液：2% w/vCTAB，100mM Tris-ClpH8.0，20mM EDTApH8.0，1.4M NaCl2. 1M Tris-ClpH8.0：称量 121.1g Tris 碱于 1L 烧杯中，参与约 800ml ddH2O 充分溶解，参与浓盐酸调整至pH 为 8.0，将溶液定容至 1L。留意：pH 以定容和溶液冷却至室温时为准。3.0.5M EDTApH8.0称量 186.1g EDTA-Na 2H O 于

9、1L 烧杯中，参与约 800ml ddH O 充分溶解，参与 NaOH222调整至pH 为 8.0，将溶液定容至 1L。留意：pH 以定容和溶液冷却至室温时为准。4.氯仿/异戊醇24:1, v/v5.无水乙醇6.75%乙醇7.ddH2O四、试验步骤：1. 将 2% CATB 提取缓冲液置于 60水浴溶解。2. 取 1-2 片叶子，液氮研磨成粉末，转移到离心管中，参与 500l 2% CATB 提取缓冲液。3. 65保温 30min，每隔 10min 轻轻摇动混匀。4. 冷却 2min 后，参与等体积氯仿-异戊醇，猛烈震荡。5. 10,000rpm，离心 10min。6. 取上清液参与的离心管中

10、，参与 2-2.5 倍体积无水乙醇，缓慢上下摇动30s 混匀。107. 10,000rpm 离心 10min，弃尽上清，保存沉淀。8. 用 70%乙醇清洗沉淀两次。9. 室温下空气晾干沉淀。10. 沉淀溶于 30-50l ddH2O，定量并电泳检测。五、留意事项：1. 为保证DNA 分子的完整性，操作过程中动作要轻柔。2. 2%CTAB 提取缓冲液在低于 15时会析出沉淀，在将其参与冷冻的植物材料中之前必需预热。3. DNA 产物应保存在-20，防止反复冻融。附 Trizol 法提取 RNA 的流程演示：1. 向100mg 液氮研磨过的植物粉末中参与 1ml TrizolInvitrogen试

11、剂并重悬。2. 13,000 rpm 离心 10min，将上清转移到的RNase-free 的离心管中。3. 参与 200l 氯仿，充分混匀。4. 13, 000 rpm 室温离心 10 min，留神吸取 400l 左右的上清转移到的离心管中。5. 参与 400l 异丙醇，-20放置 10 min，沉淀RNA。6. 4，13, 000 rpm 离心 10 min，弃上清。7. 参与 1 ml 75%的乙醇，润洗沉淀。8. 13, 000 rpm 室温离心 5 min，弃上清，并吸去残留液体。9. 空气中开盖晾干 5-10 min，使乙醇挥发干净。10. 参与 50l RNase-free dd

12、H2O 溶解并测定浓度与纯度。5 DNA 的定量一、试验目的：检测DNA 的浓度和纯度，为后续DNA 分析试验供给依据。二、试验原理：DNA 链上碱基的苯环构造在紫光区具有较强吸取，其吸取峰在 260nm 处。当 OD2601时，dsDNA 浓度约为 50g /ml，ssDNA 浓度约为 37g /ml，寡核苷酸浓度约为 30g /ml 。当 DNA 样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA 吸光度的准确测定。一般状况下同时检测同一样品的 OD260、OD280，计算其比值来衡量样品的纯度。纯 DNA： OD260/OD2801.81.9，说明有 RNA 污染；1.6，说明有蛋白

13、质、酚等污染。三、试验试剂：1. DNA 样品2. ddH2O3. 缓冲液四、试验步骤：1. 紫外分光光度计开机预热 10min。2. 用 ddH2O 洗涤比色皿，吸水纸吸干。3. 参与溶解样品的缓冲液后，调零。4. 将待测样品适当稀释后，分别测定260nm 和 280nm 波长时的OD 值。计算待测样品的浓度与纯度。DNA 样品纯度：OD260/OD280。DNA 样品的浓度g/l=OD260 稀释倍数 50 / 1000注：取样量和稀释倍数由比色皿或仪器类型确定。（1） 一般比色皿：取 30l DNA 溶液溶于 3ml ddH2O；（2） 微量比色皿：取 2l DNA 溶液溶于 100l

14、ddH2O；（3） Nano-drop：取 2l DNA 溶液直接测定。6 DNA 的电泳一、试验目的：学习和把握琼脂糖电泳法鉴定DNA 的原理和方法。二、试验原理：琼脂糖凝胶电泳是用于分别、鉴定和提纯 DNA 片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA 在碱性条件下pH8.0 带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动。不同 DNA 分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。GoldView 是一种可代替溴化乙锭EB的型核酸染料，承受琼脂糖电泳检测DNA 时，GoldView 与核酸结合后能产生很强的荧光信号。三、试验试剂：

15、1. 加样缓冲液0.25%溴酚蓝，40%w/v蔗糖2. TAE 电泳缓冲液储存液50x，1L：242g Tris 碱，57.1ml 冰乙酸，100ml 0.5M EDTApH8.0工作液1x：40 mM Tris-乙酸，1 mM EDTApH8.03. Goldview 核酸染料4. 基因组DNA 或质粒DNA 等四、试验步骤：1. 将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。2. 取适量琼脂糖溶解在电泳缓冲液中 1-25Kb 大小的 DNA 用 1%的凝胶，20-100Kb 的DNA 用 0.5%的凝胶，200-2023bp 的 DNA 用 1.5%的凝胶，摇

16、匀，置于微波炉中加热至完全溶化。3. 将 Goldview 核酸染料参与到冷却到 60的琼脂糖溶液中，将琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上10l 每 100ml 琼脂糖凝胶。4. 待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内参与电泳缓冲液，然后拔出梳子。5. 将 DNA 样品与加样缓冲液混匀，用微量移液器将混合液加到样品槽中，记录样品的点样次序和加样量。6. 安装电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，翻开电源，调整电压，进展电泳。电泳完毕后，取出凝胶，在凝胶成像系统中进展观看和记录。7 目的基因的 PCR 扩增一、试验目的：学习和把握聚合酶链式反响的根本原理和应用。二、试验原理：PCR 反响由变性-退火-延

17、长三个根本反响步骤构成：1. 变性：模板 DNA 经加热至 95左右确定时间后，使模板DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反响作预备。2. 退火：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合。三、试验试剂：3. 延长：DNA 模板-引物结合物在Taq DNA 聚合酶的作用下，以dNTP 为反响原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制原理，合成一条的与模板 DNA 链互补的半保存复制链。重复循环变性-退火-延长三过程，就可获得更多的“半保存复制链”，而且 这种链又可成为下次循环的模板。每完成一

18、个循环需 24 分钟， 23 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。1. TaqTaKaRa LA Taq2. dNTP MixtureTaKaRa3. 引物4. 基因组DNA5. ddH2O四、试验步骤：1. 合成的引物在离心机中短暂离心后溶于适量ddH2O 中，成为 100M 的储存液，放置于-20保存备用。使用前将引物稀释成 10M 的工作液。2. 在微量离心管中配置以下PCR 体系并混匀试剂使用量l使用量l植物DNA12LA Taq0.21dNTP14引物 I0.52引物 IIPCR buffer5x ddH2O0.5314.82103.

19、 放置于PCR 仪中按以下程序运行：94 5min；94 30sec，55 1min，72 1min， 30 cycle；72 5min；16 保温。4. 取出PCR 产物，电泳检测。五、留意事项：1. 引物设计需合理。2. 退火温度需适宜，必要时可结合梯度PCR 仪使用。8 PCR 产物的回收一、试验目的：参照博迈德多功能DNA 纯化回收试剂盒 获得高质量 DNA；除去蛋白如酶等，RNA，无机盐NaCl 超过 150mM 对 T4 连接酶有抑制作用，小于 100bp 的短片段如引物DNA，有机小分子如 dNTP 等。二、试验原理：在高离序盐存在的状况下，DNA 片断选择性的吸附于离心柱内的硅

20、基质膜上，再通过一系列快速的漂洗离心的步骤，使用去蛋白液和漂洗液将引物、核苷酸、蛋白酶等杂质去除，最终使用低盐和高pH 值的洗脱缓冲液将纯洁DNA 从硅基质膜上洗脱。三、试剂盒组成：1. 溶胶/结合液2. 漂洗液3. 洗脱液4. 吸附柱5. 收集管四、操作步骤琼脂糖凝胶回收：1. 在长波紫外灯下，用干净刀片将所需回收的DNA 条带切下，尽量切除不含DNA 的凝胶，得到凝胶体积越小越好。2. 将切下含有 DNA 条带凝胶放入 1.5ml 离心管，称重。先称一个空 1.5ml 离心管重量， 然后放入凝胶块后再称一次，两次重量相减，得到凝胶的重量。3. 加 3 倍体积溶胶/结合液DB凝胶重为 100

21、mg，则参与 300l 溶胶液 。假设凝胶浓度大于 2% ，应参与 6 倍体积溶胶液。4. 56水浴放置 10min或直至胶完全溶解。每 2-3min 涡旋震荡一次帮助加速溶解。5. 将上一步所得溶液参与吸附柱EC 中吸附柱放入收集管中，室温放置 1min，12,000rpm离心 30-60sec，倒掉收集管中的废液。6. 参与 500l 漂洗液WB 请先检查是否已参与无水乙醇!，12,000rpm 离心 30sec，弃掉废液。7. 参与 500l 漂洗液WB，12,000rpm 离心 30sec，弃掉废液。8. 将吸附柱EC 放回空收集管中，12,000rpm 离心 2min，尽量除去漂洗液

22、，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反响。9. 取出吸附柱 EC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加 50l 洗脱缓冲液EB洗脱缓冲液事先在 65-70水浴中加热效果更好，室温放置2min，12,000rpm 离心 1min。假设需要较多量DNA，可将得到的溶液重参与吸附柱中，离心1min。五、操作步骤PCR 产物或者酶切片段等回收:1. 每 100l PCR 扩增后体系或者酶切后体系参与500l 溶胶/结合液DB，充分混匀。假设初始体系小于 100l，请事先用双蒸水调整至 100l。2. 将上一步所得溶液参与吸附柱EC 中吸附柱放入收集管中，室温放置 1min，12,000rpm离心 3

23、0-60sec，倒掉收集管中的废液。3. 从今步骤参见琼脂糖凝胶DNA 回收的操作步骤 6-9。六、留意事项:1. 切胶回收时，紫外灯观看对 DNA 片段有损坏作用，应当尽可能使用能量低的长波紫外线，并且尽可能的缩短紫外线下处理的时间。2. 全部的溶液应当是澄清的，假设环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应当直接使用，可在 37水浴加热几分钟，即可恢复澄清。使用前应当恢复到室温。3. 第一次使用前请先在漂洗液 WB 中参与指定量无水乙醇，参与后请准时打钩标记已参与乙醇，以免屡次参与!4. 溶胶液/结合液中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避开沾染皮肤，眼睛和衣服。假设沾染皮肤、眼睛时，要马

24、上用大量清水或者生理盐水冲洗。5. pH 值7.5 时，吸附膜吸附 DNA 的效率最高。假设切下来的凝胶中含有电泳缓冲液太多，造成溶胶后溶胶液pH 偏高，会导致回收率降低。溶胶后，假设溶胶液照旧保持黄色，说明pH 正常；假设变成橘红色或者淡紫色，说明pH 偏高，可在胶充分溶解后加5-10l 3M 醋酸钠pH5.2将 pH 值调到 5-7黄色。6. 洗脱液EB 不含有螯合剂EDTA， 不影响下游酶切、连接等反响。也可以使用水洗脱， 但应当确保pH 大于 7.5， pH 过低影响洗脱效率。用水洗脱，DNA 片段应当保存在 20。DNA 片段假设需要长期保存，可以用 TE 缓冲液洗脱10mM Tri

25、s-HCl，1mM EDTA，pH 8.0，但是 EDTA 可能影响下游酶切反响，使用时可以适当稀释。9 PCR 产物连接 T 载体和感受态细胞的转化参照TaKaRa pMD18-T载体试剂盒和博迈德感受态试剂盒一、试验目的：PCR 产物的连接和克隆。二、试验原理：T 载体是两侧的 3端添加了“T”的线性化载体，由于大局部耐热性DNA 聚合酶进展PCR 反响时都有在 PCR 产物的 3末端添加一个“A”的特性，所以使用 T 载体可以大大提高PCR 产物的连接、克隆效率。T 载体包含 LacZ 基因，通过表达 -半乳糖苷酶，在含有 IPTG， X-gal 的平板培育基上，可进展蓝白斑筛选，选择阳

26、性克隆。大多数T 载体供给氨苄青霉素两种筛选标记，有的T 载体供给氨苄青霉素和卡那霉素两种筛选标记。三、试验试剂：1. T 载体试剂盒2. PCR 回收产物3. ddH2O4. 感受态细胞5. LB 培育基固体培育基：10 g/L NaCl, 10 g/L 蛋白胨, 5 g/L 酵母提取物, 15 g/L 琼脂粉液体培育基：10 g/L NaCl, 10 g/L 蛋白胨, 5g/L 酵母提取物6. 氨苄青霉素Ampicillin, Amp 储存液：100 mg/ml工作液：100 g/ml7. 异丙基硫代半乳糖苷Isopropyl -D-1-Thiogalactopyranoside, IPT

27、G 储存液：100mM工作液：0.5mM5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside8.,X-Gal储存液：20 mg/ml工作液：200l/ 100ml LB 培育基或者 50l / 9cm 平板14四、试验步骤：试剂使用量lT 载体0.5PCR 回收产物适量Solution 5ddH2O补足到 101. 在微量离心管中配置以下反响体系并混匀：一般状况下，连接时载体DNA 和外源片段的摩尔比为 1:210。1l T 载体50g摩尔数约为 0.03 pmol。PCR 产物的使用量ng=nmol x 660 x

28、 bp 数2. 在PCR 仪中 16反响 30min。室温25也能正常进展连接反响，但反响效率略微降低。2Kb 的PCR 产物连接时，需延长至 1h。3. 取感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚溶化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中一次转化感受态细胞的建议用量为50-100l，置于冰浴中。4. 向感受态细胞悬液中参与连接产物DNA 体积不要超过感受态细胞悬液体积的格外之一；为防止转化试验不成功，可以保存局部连接反响液，以重转化，将损失降到最低，轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰中放置30min。5. 将离心管置于 42水浴中放置 90sec，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却 2 min，该过程不

29、要摇动离心管。6. 向每个离心管中参与 500l 不含抗生素 LB 培育基，混匀后 37振荡培育150 rpm，摇床振荡培育 45-60min，使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。7. 取适量菌液连接产物的转化菌液建议离心重悬于200l LB 液体培育基，取 100l 用于涂布；保存剩余的菌液于 4冰箱中，视平板上菌落生长状况打算去留加到含有X-Gal、IPTG、Amp 的 LB 固体培育基平板上，用细菌涂布器或玻璃珠将细胞均匀涂开。8. 平板中的液体完全吸取后，倒置平板，37培育 12-16h。9. 选择白色菌落进展鉴定。五、留意事项1. PCR 产物最好切胶回收，以免杂质影响克隆效

30、率。2. Solution 需要在冰中溶解，并避开反复冻融。3. 感受态细胞应保存在-70，不行屡次冻融和放置时间过长，以避开降低感受态细胞的转化效率。4. 最好使用颖配置的培育基。10 菌落液PCR一、试验目的：检测重组质粒是否成功，外源片段是否正确插入到质粒载体中。二、试验原理：直接以菌体热解后暴露的DNA 为模板进展PCR 扩增外源插入片段。三、试验试剂：1. ddH2O2. PCR MixTaKaRa Premix Taq3. 引物4. LB 培育基5. TAE 电泳缓冲液6. 琼脂糖四、试验步骤菌落 PCR：1. 在微量离心管中加 3 l 无菌水。2. 为平板上将要挑取的菌落标上号码

31、，用无菌牙签选择单菌落，将菌落转至 PCR 管中牙签在无菌水中洗一下，然后将牙签点在 LB 平板上，记录号码。试剂使用量lPCR Mix5引物 I0.5引物 II0.5ddH2O33. 在微量离心管中配置以下PCR 体系：4. 目的基因PCR 扩增。5. PCR 产物电泳检测。五、试验步骤菌液 PCR：1. 挑起白色单菌落，于含有相应抗生素的1ml LB 液体培育基中培育 3-4h。2. 取 1l 菌液作为PCR 反响模板，其余菌液连续培育用于保存。试剂使用量l菌液1PCR Mix5引物 I0.5引物 II0.5ddH2O23. 在微量离心管中配置以下PCR 体系：4. 目的基因PCR 扩增。

32、5. PCR 产物电泳检测。11 质粒 DNA 的提取参照博迈德质粒小量快速提取试剂盒一、试验目的：去除基因组DNA、蛋白质等高分子物质，去除其他细菌成分，获得高品质的质粒 DNA， 可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR 等试验。二、试验原理：承受改进 SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下选择性地结合溶液中的质粒 DNA，再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最终低盐、高 pH 值的洗脱缓冲液将纯洁质粒DNA 从硅基质膜上洗脱。三、试剂盒组成：1. RNase A 溶液2. 溶液P1、P2 和P33. 漂洗液4. 洗脱液5. 吸附柱6. 收集管四、试验步

33、骤：1. 挑起白色单菌落，于含有相应抗生素的LB 液体培育基中培育 8-12h。2. 取 1ml 菌液保存，其余菌液用于提取质粒DNA。3. 取 1.5-4.5ml 过夜培育菌液，9,000rpm 离心 30sec，尽可能的倒干上清，收集菌体。4. 用 250l 溶液P1 重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。5. 加 250l 的溶液P2，温存地上下翻转 4 -7 次使菌体充分裂解。6. 加 350l 溶液P3，马上温存地上下翻转 4 -7 次，充分混匀时会消灭白色絮状沉淀， 13,000rpm 离心 5min，留神取上清。7. 将上一步所得上清参与吸附柱AC 中吸附柱放入收集管中，13,000

34、rpm 离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液。8. 参与 500l 漂洗液WB请先检查是否已参与无水乙醇!，12,000rpm 离心 30sec，弃掉废液。9. 参与 500l 漂洗液WB，12,000rpm 离心 30sec，弃掉废液。10. 将吸附柱AC 放回空收集管中，13,000rpm 离心 2min，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反响。11. 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50l 洗脱缓冲液 EB洗脱缓冲液事先在 65-70水浴中加热效果更好，室温放置 2min，12,000 rpm 离心 1min。假设需要较多量质粒，可将得到的溶

35、液重参与离心吸附柱中， 离心 1min。洗脱体积越大，洗脱效率越高。假设需要质粒浓度较高，可以适当削减洗脱体积， 但是最小体积不应少于 30l，体积过小降低质粒洗脱效率，削减质粒产量。12. 电泳检测质粒DNA 提取结果。五、留意事项：1. 第一次使用时，将试剂盒所带的全部RNase A 参与溶液P1 后终浓度 100g/ml 置于 2-8保存。2. 环境温度低时溶液P2 中SDS 可能会析出浑浊或者沉淀，可在 37水浴加热几分钟， 即可恢复澄清，不要猛烈摇摆，以免形成过量的泡沫。3. 溶液P3 中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避开沾染皮肤、眼睛和衣服。假设沾染皮肤、眼睛时，要用大量清

36、水或者生理盐水冲洗。将溶液P3 放在冰上预冷， 可以提高产量。4. 第一次使用前请先在漂洗液WB 中参与指定量无水乙醇，充分混匀，参与后请准时在方框打钩标记已参与乙醇，以免屡次参与!5. 洗脱液EB 不含有螯合剂EDTA， 不影响下游酶切、连接等反响。也可以使用水洗脱， 但应当确保pH 大于 7.5， pH 过低影响洗脱效率。用水洗脱，DNA 片段应当保存在 20。DNA 片段假设需要长期保存，可以用 TE 缓冲液洗脱 10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0，但是 EDTA 可能影响下游酶切反响，使用时可以适当稀释。12 质粒 DNA 的酶切一、试验目的：检测重组质粒是否成

37、功，外源片段是否正确插入到质粒载体中。二、试验原理：限制性核酸内切酶是可以识别DNA 的特异序列，并在识别位点或其四周切割双链DNA的一类内切酶。按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的状况不同，分为三类： 第一类I 型限制性内切酶、其次类II 型限制性内切酶和第三类 III 型限制性内切酶。现在商业化的内切酶一般都是II 型限制性内切酶，具有以下三个特点：1. 识别位点的特异性：每种酶都有其特定的 DNA 识别位点，通常是由 4，5，6 或 7甚至更多个核苷酸组成的特定序列靶序列。2. 识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的构造，即双链的核苷酸挨次呈回文构造。识别序列有一个中心

38、对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全一样。 如 EcoRI 的识别挨次为：5” GAA|TTC 3”3” CTT|AAG 5”垂直线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸挨次都是 GAATTC或CTTAAG。3. 切割位点的标准性： 双链 DNA 被酶切后，可形成粘性末端或平末端DNA 分子。粘性末端：穿插切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸挨次是互补的， 可形成氢键。如 EcoRI 的识别挨次为：5” G”AA|TT_C 3”3” C_TT|AA”G 5”_和”表示在双链上穿插切割的位置，切割后生成 5”G5”.AATTC，3”CTTAA.和 3”G 二个DNA 片段，各有一个单链末端

39、，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA 连接酶的作用而“粘合”。平头末端：在同一位置上切割双链，产生平头末端。如 EcoRV 的识别位置是：5” GAT”|ATC 3”3” CTA”|TAG 5” 表示在双链上穿插切割的位置，切割后形成 5” GATATC 3”和3”CTA 和 TAG5”二个片段，这种末端同样可以通过DNA 连接酶连接起来。三、试验试剂：1. 质粒DNA2. 酶切缓冲液TaKaRa3. 限制性内切酶TaKaRa4. ddH O25. TAE 电泳缓冲液6. 琼脂糖四、试验步骤：试剂使用量l质粒DNA510X 酶切缓冲液1限制性内切酶0.5ddH O22.51. 在微量离心管中配置如下酶切体系：2. 适宜温度反响 3 小时。3. 琼脂糖凝胶电泳检测。五、留意事项:1. 质粒酶切所用缓冲液参照试剂名目选择。单酶切选用产品附带的缓冲液，双酶切依据试剂名目选择最适缓冲液。2. 一般 1 g 质粒至少加 1 U 酶，酶切体系中酶的体积不超过 1/10。3. 依据试剂名目选择最适酶切温度。