医学免疫学检验-免疫荧光技术课件.docx

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1、医学免疫学检验-免疫荧光技术课件篇一：免疫荧光技术简介免疫荧光技术简介技术支持|扫瞄次数：416|时间：2023-2-22PriCells-免疫荧光技术Immunofluorescencetechnique1941 年，Coons 等于首次承受荧光素进展标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进展抗原定位的技术称为荧光抗体技术fluorescentantibodytechnique。该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性缺乏， 技术程序也还比较简单。一、荧光免疫技术的概念：免疫荧光技术 Immunofluorescencete

2、chnique又称荧光抗体技术， 是标记免疫技术中进展最早的一种。将抗原或抗体用荧光素进展标记，标记的抗原或标记的抗体与相应的抗体或抗原反响后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术称为免疫荧光素技术。免疫荧光细胞化学分直接法、夹心法、间接法和补体法。二、荧光免疫技术分类：（1） 荧光抗体显微镜技术：抗原抗体反响后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。（2） 免疫荧光测定技术：抗原抗体反响后，利用特别仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法三、荧光的产生：物质吸取外界能量而进入激发状态，在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。这种物质，称为荧光素。由光激发所引起的荧光，

3、为光致荧光；由化学反响所引起的荧光，为化学荧光。四、荧光素的荧光特性：（1） 停顿供能，荧光现象随即终止（2） 对光的吸取和荧光的放射具高度选择性入射光波长放射光波长（3） 荧光效率：荧光效率=放射荧光的光量子数/吸取光的光量子数（4） 荧光猝灭现象：荧光素的辐射力量减弱五、常见荧光素：（1） 异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)：FITC 纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC 分子量为 389.4，最大吸取光波长为 490495nm，最大放射光波长为 520 5

4、30nm，呈现光明的黄绿色荧光。FITC 在冷暗枯燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。（2） 四乙基罗丹明(rhodamine,RB200)：RB200 为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸取光波长为570nm，最大放射光波长为 595600nm，呈现橘红色荧光。（3） 四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamineisothiocynate,TRITC)：TRITC 为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸取光波长为 550nm，最大放射光波长为 620nm，呈现

5、橙红色荧光，与FITC 的翠绿色荧光比照鲜亮，可协作用于双重标记或比照染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。（4） 镧系：镧系螯合物某些 3 价稀土镧系元素如铕Eu3、铽Tb3、铈Ce3等的螯合物经激发后也可放射特征性的荧光，其中以Eu3 应用最广。Eu3 螯合物的激发光波长范围宽，放射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于区分荧光免疫测定。（5） 藻红蛋白P-phycoerythrin，PE：PE 是在红藻中所觉察的一种可进展光合作用的自然荧光色素，分子量为 240kD 的蛋白，最大吸取峰为 564nm，当使用 488nm 激光激发时其放射荧光峰值约为 576nm，对于单激光器的流式

6、细胞仪来说，推举使用 58521nm 的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推举使用 57513nm 的带通滤光片。FL2 探测器检测PE。（6） 多甲藻叶绿素蛋白 peridininchlorophyllprotein，PerCP： PerCP 是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中觉察的，是一种蛋白复合物，分子量约为 35kD，最大激发波长的峰值在 490nm 四周，当被 488nm 氩离子激光激发后，放射光的峰值约为 677nm。FL3 探测器检测PerCP。（7） 碘化丙啶propidiumiodide，PI：可选择性地嵌入核酸DNA、RNA的双螺旋碱基对中。在对DNA 染色时，需用RNase 对

7、细胞进行处理，以排解RNA 对DNA 荧光定量精度的影响。在 488nm 波长激发下， PI 的放射光谱为 610-620nm。FL2 探测器检测PI。常见荧光素的特性：（1） FITC：黄色结晶粉末，吸取光：490495nm，放射光： 520530nm，光明的黄绿色荧光。（2） RB200：橘红色粉末,吸取光 570nm，放射光 595600nm，橘红色荧光。（3） TRITC：紫红色粉末，吸取 550nm，放射光 620nm，橙红色荧光。（4） 镧系：Eu、Tb（5） PE：吸取光 490560nm，放射光 595nm，红色荧光。（6） 其它：酶作用后产生荧光物质。酶作用后产生荧光物质：酶

8、底物产物激发光放射光B-GMUGMU360450 APMUPMU360450HRPHPA 二聚体 317414酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如，4-甲基伞酮-D 半乳糖苷受-半乳糖苷酶的作用分解成 4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为 360nm， 放射光波长为 450nm。其他如碱性磷酸酶的底物 4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。镧系螯合物某些 3 价稀土镧系元素如铕(Eu3+)、铽(Tb3+)等的螯合物可放射特征性的荧光，而且激发光波长范围宽、放射光波长范围窄、荧光衰变时间长，最适合于时间区分荧光免疫测定。

9、六、适宜荧光素的选择：（1） 具有与蛋白质形成共价键的化学基团。（2） 荧光效率高，标记后下降不明显。（3） 荧光色泽与背风光泽比照鲜亮。（4） 标记后能保持生物学活性和免疫活性（5） 标记方法简洁、快速。（6） 安全无毒篇二：医学免疫学CDC 试验CDC 试验一.试验原理细胞外表抗原与相应的抗体IgG13 或IgM特异性结合形成的免疫复合物，可通过经典途径激活补体形成攻膜复合体而导致细胞膜穿孔。因此，水溶性染料如台盼蓝可进入受损细胞，染成蓝色，为阳性反响；不带抗原的细胞，未损伤，不染色，为阴性反响。二.试验步骤 1.胸腺细胞悬液制备颈椎脱臼法处死小鼠暴露胸腔，分别出胸腺镊子夹住胸腺反复轻轻研

10、磨单个细胞PBS 洗次，1000rpm，10min参加 5%小牛血清PBS 制备细胞悬液调整细胞浓度至 3-4107/ml 三.结果推断细胞膜穿孔的细胞呈蓝色，细胞膜完整的活细胞不着色。细胞毒性作用的推断标准如下：阴性反响()死细胞占 0-10%可疑阳性反响() 死细胞占 11-20%弱阳性反响(+)死细胞占 21-50%阳性反响(+)死细胞占51-80%强阳性反响(+)死细胞占 81-100%四.结果记录1.表格记录2.照片展现五.争论.第组成阳性的缘由：试验中参加抗原、抗体、补体、LC。抗原抗体能形成抗原抗体免疫复合物，通过经典途径激活补体，形成攻膜复合物，从而导致细胞膜穿孔，细胞受损，台

11、盼蓝进入细胞，染成蓝色，呈阳性反响。说明CDC 试验必需要有抗原、抗体、补体共同参与。.第组成阴性的缘由：试验中参加抗体、 LC。由于无抗原和补体， 不能形成抗原抗体免疫复合物，也无补体，因此不能形成攻膜复合物，不 能使细胞膜穿孔，细胞无损伤，台盼蓝无法进入细胞，不能被染成蓝色， 呈阴性反响。说明CDC 试验必需要有补体的参与。.第组呈阴性的缘由：试验中参加LC 和补体，由于无抗原抗体， 所以没有抗原抗体免疫复合物的形成，补体不能被激活，不能形成攻膜复合物，细胞无受损，台盼蓝不能进入而不被染色，呈阴性反响。说明CDC 试验必需要有抗原、抗体的参与。.第组呈阴性的缘由：试验中只参加LC，既无抗原

12、抗体免疫复合物的形成，也无补体，细胞无受损，台盼蓝不能进入而不被染色，呈阴性反响。说明CDC 试验必需要有抗原、抗体、补体的共同参与。篇三：免疫学诊断技术免疫学诊断技术军事医学科学院附属医院陈建魁主要内容：第一节其次节第三节第四节第五节第六节抗原抗体反响免疫学检测常用标记技术免疫细胞的检测免疫分子的检测免疫相关基因的检测免疫学检测方法的应用第一节抗原抗体反响抗原抗体反响:抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反响。应用抗体或抗原检测未知抗原或抗体，可以对感染性、非感染性致病因子或疾病相关因子进展诊断或关心诊断。1、特异性 2、适合比例性 3、可逆性抗原抗体反响的特异性：一种抗原一般只能与由

13、它刺激所产生的抗体结合，这种抗原抗体结合反响的专一性即特异性。抗原抗体结合力的大小，常用亲和力(affinity) 或亲合力(avidity)来表示。亲和力是指抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原打算基之间的结合强度。亲合力是指整个抗体分子与整个抗原之间的结合强度。适合比例性：抗体含量抗原含量前带等价带后带在抗原抗体特异性反响时，当抗原与抗体到达最适比例时，沉淀物形 成最多。假设抗原或抗体极度过剩则无沉淀物形成，这种现象称为带现象。消灭在抗体过量时，称为前带。在抗原过量时，称为后带。抗体过剩抗原抗体比例适宜抗原过剩网格学说latticetheory 可逆性：Ag+Ab K亲和常数=AgAb抗

14、原抗体反响的影响因素1、电解质浓度 2、酸碱度pH:683、温度3742 抗原抗体反响类型：依据抗原性质、消灭结果的现象、参与反响成分的不同，可将抗原抗体反响分为：凝集反响沉淀反响补体参与的反响承受标记物的抗原抗体反响等颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗体结合后形成凝集团块，这一类反响称为凝集反响(agglutination)。该类反响可检测到ug/ml 水平的抗体。1. 直接凝集反响细菌或红细胞等颗粒性抗原抗体2. 正向间接凝集反响载体颗粒可溶性抗原例如，用 球蛋白包被的胶乳颗粒,检测病人血清中的抗人 球蛋白的抗体(类风湿因子)。3. 反向间接凝集反响载体颗粒抗体可溶性抗原可溶性抗原(如：

15、血清蛋白质、细胞裂解液等)与相应抗体结合后消灭沉淀物，此类反响称为沉淀反响(precipitation)。液相沉淀反响絮状沉淀反响环状沉淀反响抗血清抗原+抗原抗体+免疫比浊法：在定量抗体中分别参加不同浓度的抗原，经肯定时间后可形成免疫复合物。用浊度计测量反响液体的浊度，复合物形成越多，浊度越高，可依据标准曲线计算出样品中的抗原含量。该法快速简便，可取代免疫集中法测定Ig 含量。凝胶内沉淀反响免疫集中技术免疫电泳技术火箭电泳单向集中试验对流电泳双向集中试验免疫电泳AgAbAg其次节免疫学检测常用的标记技术免疫标记技术(immunolabellingtechnique)是指用荧光素、放射性核素、酶

16、、发光剂或电子致密物质(胶体金、铁蛋白)作为示踪剂标记抗体或抗原进展的抗原抗体反响。此类方法具有灵敏、特异、快速，能够定性、定量甚至定位测定，结果易于观看、适合自动化检测等很多优点。广泛用于各种生物活性物质的分析鉴定与定量检测。依据标记物与检测方法不同，标记技术可分为:免疫荧光技术放射免疫测定免疫酶标技术发光免疫分析免疫金标记技术主要的免疫标记物类别荧光素标记物FITC、藻红蛋白PE用途免疫组化免疫分析测定放射性核素酶 3H、51Cr、32P、125I、131I免疫分析测定免疫组化免疫分析测定HRP、AP化学发光物Luminol 金属颗粒胶体金免疫分析测定免疫组化免疫分析测定用荧光素与抗体连接

17、成荧光抗体，再与待检标本中的抗原反响，抗原抗体复合物散发荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。(一)免疫荧光显微技术1 直接荧光法：将荧光素直接标记抗体，作标本染色。优点:简便易行。缺点:每检查一种抗原必需制备相应的荧光抗体。2 间接荧光法：首先用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。优点:敏感性高，制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检查。缺点：非特异性荧光简洁增多。3 补体结合免疫荧光法行示踪。在抗原-抗体反响时参加补体，使之与抗原-抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗补体抗体进直接法间接法补体法 双标记法(二)流式细胞术(flowcytometry，FCM)免疫荧光技术应用

18、于流式细胞仪,可对细胞的外表标志(抗原或受体) 进展快速、准确的分析和自动检测,并可将不同类型的细胞分选收集。FCM 还可对同一细胞的多种参数(如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等)进展多信息分析，是生命科学争论领域广泛应用的一项技术。(三)荧光免疫测定(fluoroimmunoassay，FIA)1.荧光偏振免疫测定：(fluorescencepolarizationimmunoassay， FPIA)荧光物质经偏振光蓝光照耀而跃入激发态，在恢复至基态后可释放出光子，经偏振仪形成偏振光，测定其强度可得到样品中待测物质的浓度。主要用于小分子物质(特别是药物浓度)的测定。3.酶联荧光免疫测定(e

19、nzymelinkedfluoro-immunoassay，ELFIA)应用具有潜在荧光的物质作为酶的底物，经过酶解反响产生高强度荧光，可用荧光仪进展定量测定。放射免疫测定法(radioimmunoassay,RIA)是用放射性核素标记抗原或抗体进展免疫学检测的技术。将放射性核素的高灵敏性和抗原抗体反响的特异性相结合,使检测的敏感度达pg/ml 水平。常用的放射性核素有 125I 和 131I。常用于微量物质测定，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛等药物以及IgE 等。三、免疫酶标技术以酶标记抗体(或抗原)用于免疫学检测，通过酶催化底物显色，对细胞或组织标本中的抗原-抗体复合物进展定位、定性分析；亦可依据酶催化底物显色的深浅程度，定量测定体液中抗原或抗体的含量。