分解纤维素的微生物的分离资料省名师优质课赛课获奖课件市赛课一等奖课件.ppt

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1、分解纤维素微生物分分解纤维素微生物分离离YNMZZXYNMZZXzjxzjx第1页纤维素与纤维素酶纤维素与纤维素酶1.1.纤维素纤维素 纤维素是一个由纤维素是一个由葡萄糖葡萄糖首尾相连而成首尾相连而成高分高分子子化合物，是含量最丰富化合物，是含量最丰富多糖多糖类物质。类物质。一、基础知识一、基础知识 植物根、茎、叶等器官都含有大量纤维素。植物根、茎、叶等器官都含有大量纤维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高天然产其中棉花是自然界中纤维素含量最高天然产物物。第2页 土壤中一些微生物能够产生纤维素酶土壤中一些微生物能够产生纤维素酶,把把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。纤维素分解为葡萄糖，后再利用。第

2、3页 纤维素是地球上含量最丰富多糖类物质，纤维素是地球上含量最丰富多糖类物质，植物每年产生纤维素超出植物每年产生纤维素超出7070亿吨亿吨，其中，其中40%-60%40%-60%能被土壤中能产生纤维素酶微生物所利用，不能被土壤中能产生纤维素酶微生物所利用，不会大量积累。会大量积累。在草食性动物等消化道内，也在草食性动物等消化道内，也共生有分共生有分解纤维素微生物解纤维素微生物，其原理也是产生纤维素酶，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素能力。而分解纤维素，而人没有分解纤维素能力。人类可应用分解纤维素微生物将秸秆人类可应用分解纤维素微生物将秸秆等废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理

3、服等废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理服装面料等。装面料等。第4页2.2.纤维素酶纤维素酶 纤维素酶是一个纤维素酶是一个复合酶复合酶，普通认为它，普通认为它最少最少包含三种组分包含三种组分，即，即C C1 1酶酶(外切酶外切酶)、C CX X酶酶(内切酶内切酶)和葡萄糖苷酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维二糖纤维二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纤维素纤维素第5页取二支取二支20mL20mL试管试管试验：纤维素酶分解纤维素试验试验：纤维素酶分解纤维

4、素试验各加入一张滤纸条各加入一张滤纸条各加入各加入pH4.8pH4.8，物质量为，物质量为0.1mol/L0.1mol/L醋酸醋酸钠缓冲液醋酸醋酸钠缓冲液11ml11ml和和10ml10ml甲甲 乙乙在乙试管中加入在乙试管中加入1mL1mL纤维素酶纤维素酶两支试管固定在锥形瓶中，放在两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min140r/min摇床上振荡摇床上振荡1h1h结果：乙试管滤纸条消失结果：乙试管滤纸条消失 讨论讨论：乙试管滤纸条为何会消失？甲试管作用是什么？：乙试管滤纸条为何会消失？甲试管作用是什么？第6页提醒：提醒：本试验本试验自变量是纤维素酶有没有自变量是纤维素酶有没有，自变量操纵

5、方法是：在，自变量操纵方法是：在一支试管中添加适量（一支试管中添加适量（1mL1mL）纤维素酶溶液，在另一支试管不添）纤维素酶溶液，在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入加纤维素酶，但需加入等量缓冲液等量缓冲液，不能加入蒸馏水，不然会，不能加入蒸馏水，不然会影响溶液影响溶液pHpH。试验分析：试验分析：P P2727小试验是怎样组成对照？小试验是怎样组成对照？第7页刚果红染色法刚果红染色法 刚果红能与纤维素形成红色复合物刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与，而不与水解后纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。水解后纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。（二）纤维素分解菌筛选（二）纤维素分解菌筛选 当我们在含有纤

6、维素培养基中加入刚果红时，当我们在含有纤维素培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中纤维素形成刚果红能与培养基中纤维素形成红色复合物红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素复纤维素复合物就无法形成，培养基中就会出现合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素以纤维素分解菌为中心透明圈分解菌为中心透明圈，这么我们就能够经过是，这么我们就能够经过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。第8页第9页二、实二、实 验验 设设 计计 请你依据试验流程图和提供三个资料以及请你依据试验流程图和提供三个资料以及“操作提操作提醒醒”，在思索相关问

7、题基础上，设计出一个详细试验方，在思索相关问题基础上，设计出一个详细试验方案。案。土壤取样土壤取样选择培养选择培养梯度稀释梯度稀释 将样品涂布在判别纤将样品涂布在判别纤 维素分解菌培养基上维素分解菌培养基上 筛选产生透筛选产生透 明圈菌落明圈菌落第10页分布环境分布环境1 1、土壤取样：、土壤取样：富含纤维素环境中富含纤维素环境中操作步骤操作步骤 生物与环境生物与环境相互依存关系相互依存关系，在富含纤维素环，在富含纤维素环境中纤维素分解菌含量相对提升，所以从这种土境中纤维素分解菌含量相对提升，所以从这种土壤中壤中取得取得目标微生物目标微生物几率要高几率要高于普通环境。于普通环境。原因原因第11

8、页实例：树林中多年落叶形成腐殖土，多年积累实例：树林中多年落叶形成腐殖土，多年积累枯枝败叶等。枯枝败叶等。讨论讨论:假如找不到适当环境，能够将滤纸埋在假如找不到适当环境，能够将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？滤纸应该埋在土壤中多深？将滤纸埋在土壤中将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对能使纤维素分解菌相对集中集中，实际上是，实际上是人工设置人工设置纤维素分解菌生存纤维素分解菌生存适适宜环境宜环境。普通应将滤纸埋于深约。普通应将滤纸埋于深约10cm10cm左右土壤左右土壤中。中。第12页2 2、选择培养、选择培养

9、增加纤维素分解菌浓度增加纤维素分解菌浓度，以确保能够从样，以确保能够从样品中分离所需要微生物。品中分离所需要微生物。目标：目标：制备选择培养基：制备选择培养基：操作：操作：将土样加入装有将土样加入装有30ml选择培养基锥形瓶中，选择培养基锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养养12天，直至培养液变浑浊。也可重复选择天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。培养。第13页培养基成份分析培养基成份分析培养基组成培养基组成提供主要营养物质纤维素粉纤维素粉 5g碳源（能源）碳源（能源）NaNO3 1g氮源、无机盐氮源、无机盐KCl 0.5g Na2H

10、PO47H2O 1.2gKH2PO4 0.9g MgSO4 7H2O 0.5g无机盐无机盐酵母膏酵母膏 0.5g生长因子、碳源、氮源生长因子、碳源、氮源水解酵素水解酵素 0.5g氮素、生长因子氮素、生长因子溶解后，蒸馏水定容至溶解后，蒸馏水定容至1000mL水水第14页提醒：自变量为培养基种类，即普通培养基和选择培提醒：自变量为培养基种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维或者将纤维素改为葡萄糖。素改为葡萄糖。A A A A、旁栏中配方是液体培养基还是固体培养基？为何？、旁栏中配方是液体培养基还是固体培养基？为何？、旁栏中配

11、方是液体培养基还是固体培养基？为何？、旁栏中配方是液体培养基还是固体培养基？为何？是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）B B B B、这个培养基对微生物是否含有选择作用？假如含有，、这个培养基对微生物是否含有选择作用？假如含有，、这个培养基对微生物是否含有选择作用？假如含有，、这个培养基对微生物是否含有选择作用？假如含有，是怎样进行选择？是怎样进行选择？是怎样进行选择？是怎样进行选择？有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能有选择作用，本配方中纤维素作为主要

12、碳源，只有能分解纤维素微生物能够大量繁殖。分解纤维素微生物能够大量繁殖。C C C C、你能否设计一个对照试验，说明选择培养基作用、你能否设计一个对照试验，说明选择培养基作用、你能否设计一个对照试验，说明选择培养基作用、你能否设计一个对照试验，说明选择培养基作用第15页 在选择培养条件下，能够使那些能够在选择培养条件下，能够使那些能够适应适应这种营养条件微生物得到这种营养条件微生物得到快速繁殖快速繁殖，而那些，而那些不不适应适应这种营养条件微生物繁殖被这种营养条件微生物繁殖被抑制抑制，所以能，所以能够起到够起到“浓缩浓缩”作用。作用。为何选择培养能够为何选择培养能够“浓缩浓缩”所需微生物？所需

13、微生物？第16页思索：本试验流程与课题思索：本试验流程与课题2 2中试验流程有哪些异同中试验流程有哪些异同？本试验流程与课题本试验流程与课题2 2流程区分以下。课题流程区分以下。课题2 2是将土样制成菌悬液直接涂布在是将土样制成菌悬液直接涂布在以尿素为唯一以尿素为唯一氮源选择性培养基上，直接分离氮源选择性培养基上，直接分离得到菌落。本得到菌落。本课题经过课题经过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，后，再将菌液涂布在判别培养基上。其它步骤再将菌液涂布在判别培养基上。其它步骤基本一致。基本一致。第17页按照课题按照课题1 1稀释操作方法，将选择培养后培稀释操作方法，

14、将选择培养后培养基进行等比稀释养基进行等比稀释10101 110107 7倍。倍。3.3.梯度稀释梯度稀释101102103104105106第18页4.4.将样品涂布到将样品涂布到判别纤维素分解菌判别纤维素分解菌培养培养基上基上（1 1）制备判别培养基）制备判别培养基:（2 2）涂布平板：）涂布平板：将稀释度为将稀释度为10104 410106 6菌悬液各取菌悬液各取0.1ml0.1ml涂涂布到平板培养基上，布到平板培养基上，3030倒置培养。倒置培养。第19页培养基组成培养基组成提供主要营养物质CMC-Na 510g碳源碳源酵母膏酵母膏 1g碳源、氮源、生长因子碳源、氮源、生长因子KH2P

15、O4 0.25g无机盐无机盐土豆汁土豆汁 100mL碳源、生长因子碳源、生长因子琼脂琼脂 15g凝固剂凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏水定容至上述物质溶解后，加蒸馏水定容至1000mL氢元素、氧元素氢元素、氧元素判别纤维素分解菌培养基判别纤维素分解菌培养基(水溶性羧甲基纤维素钠水溶性羧甲基纤维素钠)第20页方法一：先方法一：先 ，再加入刚果红进，再加入刚果红进行颜色反应。行颜色反应。方法二：在方法二：在 时就加入刚果红。时就加入刚果红。培养微生物培养微生物倒平板倒平板5.刚果红染色法刚果红染色法 挑选产生透明圈菌落，普通即为分解纤挑选产生透明圈菌落，普通即为分解纤维素菌落。维素菌落。第21页这两种

16、方法各有哪些优点与不足？这两种方法各有哪些优点与不足？染色法染色法染色法染色法优点优点优点优点缺点缺点缺点缺点方法一方法一方法一方法一方法二方法二方法二方法二颜色反应基本颜色反应基本上是纤维素分上是纤维素分解菌作用解菌作用1.1.操作繁琐操作繁琐2.2.刚果红会使菌落之间刚果红会使菌落之间发生混杂发生混杂操作简便不操作简便不存在菌落混存在菌落混杂问题杂问题1.1.产生淀粉酶微生物也产生淀粉酶微生物也产生含糊透明圈产生含糊透明圈(假阳性反应假阳性反应)2.2.有些微生物能降解色有些微生物能降解色素，形成显著透明圈素，形成显著透明圈第22页方法一中方法一中NaCl溶液作用？溶液作用？思索：思索：漂

17、洗作用漂洗作用，洗去洗去与纤维素与纤维素结合不牢刚果红结合不牢刚果红，以以免出现透明圈不够清楚免出现透明圈不够清楚。用这方法。用这方法能够判断酶活力能够判断酶活力大小大小。实际上刚果红是结合到培养基多糖底物，但。实际上刚果红是结合到培养基多糖底物，但分解纤维素细菌能够产生纤维素酶，能分解这个多分解纤维素细菌能够产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这么刚果红就不能结合上去了，糖底物成为单糖，这么刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就能够使结合不牢刚果红洗去，这么就氯化钠溶液就能够使结合不牢刚果红洗去，这么就留下大大小小透明圈，大透明圈当然分解纤维素能留下大大小小透明圈，大透明圈当然分解纤维素

18、能就强！就强！第23页比较项目比较项目分解尿素细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养基基原理原理培养基类培养基类型型目标鉴鉴定定培培养养基基原理原理现象现象方法方法将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有尿素做氮源选择尿素做氮源选择培养基上培养基上将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有纤维素粉做碳源纤维素粉做碳源选择培养基上选择培养基上固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基筛选菌株筛选菌株选择培养选择培养第24页比较比较项目项目分解尿素细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养原理原理培养基类培养基类型型目标鉴鉴定定培培养养基基原理原理现象现象方法方法在细菌分解尿素化学反应在细菌分解尿素化学反应中

19、，细菌合成中，细菌合成脲酶脲酶将将尿素尿素分解成了分解成了氨氨，氨会使培养基，氨会使培养基碱性增强，碱性增强，pHpH升高升高。在培。在培养基中加入养基中加入酚红指示剂酚红指示剂，如，如果果pHpH升高指示剂会升高指示剂会变变红红刚果红能够与纤维素形成刚果红能够与纤维素形成红色复合物红色复合物，当，当纤维素被纤维素被纤维素酶催化分解纤维素酶催化分解后红色后红色复合物无法形成，培养基复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解上就会出现以纤维素分解菌为菌为中心透明圈中心透明圈观察菌落周围是否有着色观察菌落周围是否有着色环带出现来判定尿素分解菌环带出现来判定尿素分解菌观察菌落周围是否出现观察菌落周

20、围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌透明圈来筛选纤维素分解菌脲酶检测法脲酶检测法刚果红染色法刚果红染色法第25页 在在产生显著透明圈产生显著透明圈菌落，挑取并接菌落，挑取并接种到纤维素分解菌选择培养基上，在种到纤维素分解菌选择培养基上，在30300 0C C 37 370 0C C培养，可取得培养，可取得纯化培养纯化培养。6 6、纯化培养、纯化培养第26页分解分解纤维纤维素微素微生物生物分离分离纤维素酶纤维素酶种类、作用、催化活力种类、作用、催化活力刚果红染色刚果红染色筛选原理筛选原理试试验验设设计计土壤取样土壤取样选择培养选择培养涂布培养涂布培养纯化培养纯化培养前置染色法前置染色法后置染色法后

21、置染色法富含纤维素土壤富含纤维素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量染色判别染色判别分离出分解菌分离出分解菌课堂总结课堂总结第27页四、结果分析与评价四、结果分析与评价 1.1.培养基制作是否合格以及选择培养基是否筛选出培养基制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落菌落 对照培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培对照培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。养基制作合格。假如观察到产生透明圈菌落，则说明可能取得了假如观察到产生透明圈菌落，则说明可能取得了分解纤维素微生物。分解纤维素微生物。2.2.分离结果是否一致分离结果是否一致 因为在土壤中细菌数量远远高于真菌和放线菌数因为在土壤中细菌数量远远高于真菌和放线菌数量，所以最轻易分离得到是细菌。但因为所取土样环境量，所以最轻易分离得到是细菌。但因为所取土样环境不一样，不一样同学也可能得到真菌和放线菌等不一样不一样，不一样同学也可能得到真菌和放线菌等不一样分离结果。分离结果。第28页