T_CMBA 011-2020 人外周血单个核细胞的采集、分离和保存.docx

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1、ICS07.080C40CMBA团体标准T/CMBA0112020人外周血单个核细胞的采集、分离和保存Collection,SeparationandPreservationofPBMCfromHumanPeripheralBlood2020-12-28发布2020-12-28实施中国医药生物技术协会发布T/CMBA0112020目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14总则.25实验原理.26实验方法.26.1材料.26.2步骤.37质量控制.47.1活细胞计数.47.2RNA的质量控制.57.3DNA的质量控制.5参考文献.6IT/CMBA0112020前言本文件按GB

2、/T1.1-2020给出的规则起草。本文件由中国医药生物技术协会归口。本文件起草单位：中国医药生物技术协会组织生物样本库分会、生物芯片上海国家工程研究中心、上海芯超生物科技有限公司、广州中医药大学第二附属医院（广东省中医院）。本文件主要起草人：郜恒骏、沈晓莹、杜莉利、亓垚、张小燕、许靖曼、陈明敏、陈曲波、叶扬、李迪。IIT/CMBA0112020人外周血单个核细胞的采集、分离和保存1范围本文件规定了采集、分离和保存人外周血单个核细胞的实验原理、实验方法和质量控制。本文件适用于科研用人外周血单个核细胞的采集、分离和保存，若用于临床，应按照临床相关要求进行操作。2规范性引用文件下列文件中的内容通过

3、文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T38576-2020人类血液样本采集与处理3术语和定义以下术语和定义适用于本文件。3.1外周血单个核细胞PeripheralBloodMononuclearCell,PBMC外周血中具有单个核的细胞，包含淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和其他少量细胞（造血干细胞等）。3.2淋巴细胞分离液LymphocyteSeparationMedium一种密度介于1.0751.090g/ml之间而近似于等渗的溶液，用它做密度梯度离心，使一定

4、密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。3.3RPMI-1640培养基RPMI-1640Medium洛斯维帕克纪念研究所（RoswellParkMemorialInstitute,RPMI）研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号。3.4二甲基亚砜Dimethylsulfoxide,DMSO非质子极性溶剂，常用于化学反应、PCR反应以及在细胞、组织和器官的保存中用作玻璃化低温冷冻防护剂。DMSO用于细胞冷冻培养基内，可以保护细胞免受冰晶引起的机械性损伤。它也可以用1T/CMBA0112020于主培养、亚培养、重组异倍体、杂交瘤等系列细胞株，胚胎干细胞（ESC）和造血干细胞的冷

5、冻保藏。另外常常与BSA或FBS混合使用。3.5台盼蓝TrypanBlue也称台盼兰、锥虫蓝、曲利苯蓝，细胞活性染料，常用于检测细胞膜的完整性，检测细胞是否存活。活细胞不会被染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。台盼蓝可被巨噬细胞吞噬，故可用于巨噬细胞的活体染色剂。3.6知情同意InformedConsent供体对生物样本（本文件中为“外周血”）捐赠的目的和研究用途等明了和认可。以生物样本供体自愿同意参与为原则，以当事双方共同签署知情同意书为具体体现。3.7脱氧核糖核酸DeoxyribonucleicAcid,DNA染色体主要组成成分，同时也是主要遗传物质。3.8核糖核酸RibonucleicAc

6、id,RNA存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸、核糖和碱基构成。4总则本文件采用密度梯度离心法进行人PBMC的分离，此方法适用范围广、性价比高、结果稳定。此外还有加速红细胞沉降法、塑料吸附法、Colotta法、分离管法等。这些方法分离的PBMC应符合后续实验要求。5实验原理外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分离液作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；PBMC的比重小于或等于分离液比重，离心后漂浮于分离液的液面上，也

7、有少部分细胞悬浮在分离液中。吸取分离液液面的细胞，就可从外周血中分离到PBMC。6实验方法6.1材料6.1.1主要设备：生物安全柜、低温水平式离心机、血球计数板、显微镜、血细胞分离机等。2T/CMBA01120206.1.2主要耗材：真空采血管（ACD/EDTA/肝素抗凝）、离心管、移液管、无菌吸头、冻存管、巴氏吸管、移液器、辅助移液器、注射器、无菌棉球、镊子、橡皮止血带等。6.1.3主要试剂：RPMI-1640培养基、胎牛血清、DMSO、淋巴细胞分离液（20时密度为1.0770.001g/ml）、台盼蓝染色液、碘酒、75酒精等。6.2步骤6.2.1PBMC的采集6.2.1.1获得供体知情同意

8、后，按照GB/T38576-2020常规无菌抽取新鲜外周血至ACD/EDTA/肝素抗凝管中。6.2.1.2获得供体知情同意后，使用血细胞分离机，按照操作手册规范地采集；将采集到的血液或细胞尽快分离PBMC，在采集、处理和运输过程中避免冷冻和冷藏。6.2.2PBMC的分离6.2.2.1分离前的准备：洁净实验室的常规消毒，紫外灯照射洁净间和生物安全柜，且保持台面的整洁；准备好本次分离所需离心管、移液管、无菌吸头、冻存管、巴氏吸管、移液器、辅助移液器、注射器、RPMI-1640培养基、胎牛血清、DMSO、淋巴细胞分离液等。淋巴细胞分离液和RPMI-1640培养基应提前置于室温。6.2.2.2分离PB

9、MC：取出无菌离心管，加入淋巴细胞分离液；同时将所得外周血样本用生理盐水/PBS等体积稀释，并充分混匀，形成外周血的稀释液；再将稀释液加入到淋巴细胞分离液中，应将稀释液缓慢匀速地加至淋巴细胞分离液面之上，确保血液稀释液和淋巴细胞分离液形成明显分层（上层为血液稀释液，下层为淋巴细胞分离液）。6.2.2.3室温低速离心（500g，下同）20min。6.2.2.4离心毕，可见离心管中液体形成明显分层，从上到下依次为血浆与RPMI-1640混合液层、单个核细胞白膜层、人淋巴细胞分离液层及红细胞层。用巴氏管或无菌吸头小心吸取白膜层，置于新的离心管中，注意不要吸到淋巴细胞分离液；补充适量的细胞培养基或缓冲

10、液，用移液管吹打均匀。6.2.2.5室温低速离心10min。6.2.2.6吸弃上清液，保留细胞沉淀，补充适量的细胞培养基或缓冲液，轻柔且充分吹打均匀后，离心洗涤细胞：4低速离心5min。6.2.2.7重复步骤6.2.2.6。6.2.2.8离心毕，吸弃上清液，进行活细胞计数。6.2.2.9将PBMC按照一定密度种入培养板或培养瓶继续培养，也可将PBMC冻存备用。6.2.3PBMC的冻存和复苏6.2.3.1进行活细胞计数，根据计算得到的PBMC总数，计算冻存所需管数。6.2.3.2取出所需数量冻存管，标记好细胞编号、细胞总数和冻存日期。6.2.3.3配制冻存液。3T/CMBA01120206.2.

11、3.4在PBMC细胞沉淀中加入一定体积配制好的细胞冻存液，轻柔且充分吹打均匀；将吹打均匀的细胞悬液分装入冻存管中，1ml冻存液可用于51055106个细胞的冻存。6.2.3.5常规将细胞程序性降温。注：某些细胞冻存液无需程序性降温。6.2.3.6将经过程序性降温的冻存管转入液氮容器中，并记录好细胞冻存管放置的位置。6.2.3.7PBMC复苏时，提前将水浴箱开启到37，操作人员注意做好防护，迅速从液氮中取出所需管数细胞，将冻存管轻轻放入复苏设备，使细胞快速融化。6.2.3.8在无菌离心管中加入适量的完全培养基，将细胞冻存管中细胞悬液吸出置于离心管中，室温低速离心10min，计数，按一定密度接种于

12、培养板或培养瓶。注：完全培养基指的是90%培养基+10%胎牛血清。6.2.4用于RNA抽提的PBMC预处理6.2.4.1将含有PBMC的细胞悬液转移至离心管，室温低速离心。6.2.4.2离心毕，去掉上清，加入适量PBS小心将细胞沉淀吹打均匀，室温低速离心。6.2.4.3重复6.2.4.2操作两次。6.2.4.4将细胞重悬浮于RNA保护液中，转移至无核酸酶的离心管中。4可保存13天，-20可保存30天左右，如需长期保存，请置于-80冰箱或液氮罐中。6.2.4.5RNA抽提时，将保存PBMC的离心管从存储设备中取出，恢复至室温后，立即进行RNA抽提。6.2.5用于DNA或蛋白抽提的PBMC预处理6

13、.2.5.1将含有PBMC的细胞悬液转移至离心管，室温低速离心。6.2.5.2离心毕，去掉上清，加入适量PBS小心将细胞沉淀吹打均匀，室温低速离心。6.2.5.3重复6.2.5.2操作一次。6.2.5.4加入适量PBS缓冲液将细胞沉淀吹打均匀，将细胞悬液转移至无核酸酶的离心管，室温低速离心。6.2.5.5去掉上清，将细胞沉淀-80冻存。6.2.5.6DNA抽提时，将保存PBMC的离心管从存储设备中取出，待细胞沉淀融化后，立即进行DNA抽提。蛋白抽提时，将保存PBMC的离心管从存储设备中取出，置于冰上，待细胞沉淀融化后，立即进行蛋白抽提。7质量控制7.1活细胞计数4XPBMC=Nv2n104T/

14、CMBA01120207.1.1总则选择合适的活细胞计数法进行计数，常用的有台盼蓝染色等方法。7.1.2台盼蓝染色方法将细胞沉淀用RPMI-1640培养基补充，充分吹打均匀后，用精确量程的移液器吸取适量细胞悬液，置于EP管中，随之在EP管中加入适量台盼蓝，使其终浓度为0.04%，充分混匀，台盼蓝染色3min，取适量细胞悬液匀速加入血细胞计数板，倒置相差显微镜下计数：分别计数四大格未染成蓝色的细胞总数和染成蓝色的细胞总数，将结果记录在专用计数本上。利用如下公式计算分离所得PBMC总数和存活率：4SPBMC=NY100%注：X：细胞总数；Y：四大格染成蓝色细胞总数；N：四大格细胞总数；n：细胞悬液

15、稀释倍数；v：细胞悬液总体积；S：细胞存活率（%）。7.2RNA的质量控制应对RNA的浓度、纯度与完整性进行质量检测。7.2.1RNA的浓度可使用分光光度、荧光染料等方法进行检测。7.2.2RNA的纯度可使用分光光度、琼脂糖凝胶电泳等方法进行检测。7.2.3RNA的完整性可使用微流控分析、琼脂糖凝胶电泳等方法进行检测。7.3DNA的质量控制应对DNA的浓度、纯度与完整性进行质量检测。7.3.1DNA的浓度可使用分光光度、荧光染料等方法进行检测。7.3.2DNA的纯度可使用分光光度、琼脂糖凝胶电泳等方法进行检测。7.3.3DNA的完整性可使用琼脂糖凝胶电泳等方法进行检测。5T/CMBA01120

16、20参考文献1HigdonLE,LeeK,TangQ,etal.Virtualglobaltransplantlaboratorystandardoperatingproceduresforbloodcollection,PBMCisolation,andstorage.TransplantDirect,2016,2(9):e101.2YangJ,DiazN,AdelsbergerJ,etal.TheeffectsofstoragetemperatureonPBMCgeneexpression.BMCImmunol,2016,17:6.3GrievinkHW,LuismanT,KluftC,e

17、tal.Comparisonofthreeisolationtechniquesforhumanperipheralbloodmononuclearcells:Cellrecoveryandviability,populationcomposition,andcellfunctionality.BiopreservBiobank,2016,14(5):410-415.4HummonAB,LimSR,DifilippantonioMJ,etal.IsolationandsolubilizationofproteinsafterTRIzolextractionofRNAandDNAfrompatientmaterialfollowingprolongedstorage.Biotechniques,2007,42(4):467-470,472._6