DB31∕T 1377.5-2022 实验鸡和鸭　第5部分：遗传质量控制(上海市).pdf

《DB31∕T 1377.5-2022 实验鸡和鸭　第5部分：遗传质量控制(上海市).pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DB31∕T 1377.5-2022 实验鸡和鸭　第5部分：遗传质量控制(上海市).pdf（14页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、ICS 65.020.30CCS B 44上海市 地方准DB31/T 1377.52022实验鸡和鸭第5部分:遗传质量控制Laboratory chicken and duck-Part 5：Genetic quality control2022-10-28 发布2023-02-01 实施 发布 出版准.中国标上海市市场监督管理局DB31/T 1377.52022目 次前言.H引言.M1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14封闭群鸡和鸭的引种及繁殖方式.15封闭群的遗传质量监测.25.1 抽样.25.2 检测方法.25.3 监测频率.26结果判定.26.1 计算.26.2 位点分析.2

2、6.3 判定.2附录A（规范性）实验鸡微卫星DNA标记检测方法.3附录B（规范性）实验鸭微卫星DNA标记检测方法.6参考文献.8DB31/T 1377.52022前 言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。本文件是DB31/T 1377实验鸡和鸭的第5部分。DB31/T 1377已经发布了以下部分：第1部分:微生物学监测；第2部分:寄生虫监测,第3部分:配合饲料营养成分；第4部分:设施及环境,第5部分:遗传质量控制。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由上海市科学技术委员会提出并组织实施。

3、本文件由上海市实验动物标准化技术委员会归口.本文件起草单位:上海实验动物研究中心、北京维通利华实验动物技术有限公司、上海交通大学、中 国农业科学院上海兽医研究所、上海市农业科学院畜牧兽医研究所。本文件主要起草人;赵勇、韩凌霞、孟和、魏晓锋、陈鸿军、孙竹筠、范春、陈国强、胡建华、孙彤、俞赵荣、陈永军、刘惠莉。mDB31/T 1377.52022引 言实验动物标准化是实验动物科学研究高质量发展的基础工作，只有实现实验动物标准化，动物实验 结果才具有均一性、可重复性及可比性。标准的研究、制定与发布实施是开展实验动物标准化管理的重 要依据，也是促进实验动物资源整合优化、开放共享的基础保障。禽类实验动物

4、中最常用的是鸡和鸭。DB31/T 1377实验鸡和鸭是指导上海市禽类实验动物标准化的基础性和通用性标准，由5个部分 构成。第1部分:微生物学监测。规范了实验鸡和鸭需要监测的微生物种类及相应微生物的检测 方法。一第2部分:寄生虫学监测。规范了实验鸡和鸭的寄生虫学监厕的检测要求、检测项目、检测程 序、检测方法、检测内容和结果判定。一第3部分;配合饲料营养成分。规范了实验鸡和鸭配合饲料的质量要求、卫生要求、营养成分、营养成分测定要求、检测规则、标签、包装、贮存和运输要求。-第4部分:设施及环境。规范了实验鸡和鸭的环境及设施条件的建筑、工艺布局、饲养条件、废 物处理、运输及检测等要求。第5部分:遗传质

5、量控制。规范了实验鸡和鸭的繁殖方法、遗传质量监测和结果判定。DB31/T 1377实验鸡和鸭细化了实验动物国家标准原有内容，补充了关键性技术标准，为实验鸡 和鸭质量全面评价提供了基本参数，推动实验动物质量标准化和新资源共享服务,有利于保证动物实验 结果的可靠性和医用生物材料的安全性验证，并为进一步完善我国实验动物标准体系等方面发挥作用。IVDB31/T 1377.52022实睢鸡和鸭 第5部分：遗传质量控制1范围本文件规定了实验鸡和鸭的繁殖方法、遗传质量监测和结果判定。本文件适用于上海市封闭群实验鸡和鸭的遗传质量控制。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条

6、款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。GB 14923实验动物哺乳类实验动物的遗传质量控制NY/T 541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义GB 14923界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1封闭群 closed colony以非近亲交配方式进行繁殖生产的，在不从外部引入新个体的条件下，至少连续繁殖4代的种群。来源：GB 149232010,2.12,有修改二3.2杂合度 heterozygosityh某一基因座上的等位基因是杂合体的频率。3.3基因频率 gene frequency

7、特定位点上一种等位基因占该位点全部等位基因的比率。3.4近交系数 inbreeding coefficient个体的等位基因来自共同的祖先基因的概率。4封闭群鸡和鸭的引种及繁殖方式4.1 种禽的遗传背景应明确或来源清楚，资料完整，包括但不限于：来源、品系名称、引种日期、世代及 主要生物学特征。4.2 应保持基因多态性，避免近交系数随繁殖代数增加而过快上升。4.3 采用最佳避免近交法、循环交配或随机交配法。4.4 种群的雄雌个体比例宜为1：81；10。1DB31/T 1377.520225封闭群的遗传质量监测5.1 抽样5.1.1 种群规模不大于100羽的，随机抽取不少于25羽，雌雄不限。5.1

8、.2 种群规模大于100羽的，选取15%的比例，随机抽取，雌雄不限。5.2 检测方法5.2.1 采用微卫星分子标记方法检测鸡，按照附录A执行。5.2.2 采用微卫星分子标记方法检测鸭，按照附录B执行。5.3 监测频率每个世代每个种群至少利用微卫星DNA标记方法进行1次监测。6结果判定6.1 计算利用群体遗传学软件计算，实验鸡计算公式按照A.5执行,实验鸭计算公式按照B.5执行。6.2 位点分析当所用微卫星标记位点对被检群体的多态信息含量大于0.5,则该位点可继续用于判定，否则应增 加或更换标记位点。6.3 判定6.3.1 群体的平均近交系数为负值，判为封闭群。6.3.2 杂合度大于0.5,判为

9、封闭群。2DB31/T 1377.52022附录A(规范性)实验鸡徽卫星DNA标记检测方法A.1原理微卫星标记(microsatellite)又被称为短串联重复序列(short tandem repeats,STR)或简单重复序 列(simple sequence repeats,SSR),是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由2个6个核 甘酸的串联重复片段构成。重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富,常用于群体遗 传学结构分析。通常通过PCR扩增，利用特定软件对扩增产物的分子量大小作为等位基因进行检测。A.2试剂基因组DNA提取试剂盒，商品化PCR扩增试剂盒,PCR引物和

10、荧光素HEX和FAM标记探针。A.3步骤A.3.1基因组DNA提取按照NY/T 541的规定，从鸡翅静脉采集被检实验鸡的抗凝血提取基因组DNA。A.3.2引物信息及分组将联合国粮食及农业组织(FAO)推荐的用于鸡遗传多样性分析的14对微卫星标记，依据扩增产 物的分子量大小，分成2个组，分别标记荧光素HEX和FAM,同组内的位点可同时进行基因型检测。位点信息见表A.1,表A.1实验鸡遗传检测微卫星位点信息及分组组合标记引物序列(5f 3)片段大小 bp荧光标记退火温度 CAADL0268CTC CAC CCC TCT CAG AACTACAA CTT CCC ATC TAC CTA CT1121

11、16FAM60ADL0278CCA GCA GTC TAC CTYT CCTATTGT CAT CCA AGA ACA GTGTG112-122HEX60LEI0094GAT CTC ACC AGT ATG AGC TGCTCTCAC ACT GTAACA CAG TGC246262FAM58MCW0216GGG TTT TAC AGG ATG GGACGAGT TTC ACT CCC AGG GCT CG146 148214 218FAM60MCW0248GTT GTT CAA AAG AAG ATG CAT GTTGCAT TAA CTG GGC ACT TTCFAM6159MCW0069

12、GCA CTC GAG AAA ACT TCC TGCGATT GCT TCAGCA AGC ATG GGA GGA156170HEX3DB31/T 1377.52022表A.1实髓鸡遗传检测微卫星位点信息及分组(续)组合标记引物序列(57)片段大小 bp荧光标记退火温度 PBMCW0081GTT GCT GAG AGC CTG GTG CAGCCTGTA TGT GGA ATT ACT TCT C114134FAM58MCW0222GCA GTT ACA TTG AAA TGA TTC CTTC TCAAAA CAC CTA GAA GAC219-221FAM58MCW0295ATC ACT

13、 ACA GAA CAC CCT CTCTATGTA TGC ACG CAG ATA TCC88100FAM62LEI0166CTC CTG CCC TTA GCT ACG CA TAT CCC CTG GCT GGG AGTTT345355FAM60LEI0234ATG CAT CAG ATT GGT ATT CAA CGT GGC TGT GAA CAAATATG217299HEX58MCW0037ACC GGT GCC ATC AAT TAC CTA TTA GAAAGC TCA CAT GAC ACT GGG AAA151155FAM59MCW0111GCT CCA TGT GAA G

14、TG GTTTAATG TCC ACT TGT CAA TGATG99 107FAM55MCW0016ATG GCG CAGAAG GCAAAG CGATATTGG CTT CTG AAG CAG TTG CTA TGG143 147HEX57A.3.3 PCR 反应反应程序：95匕5 min；94 30 s,退火30 s,72 30 s,30个35个循环；729再延伸10 min；298 保存。A.4 PCR产物的检测用灭菌去离子水将PCR扩增产物适量稀释。取稀释产物2 mL和含分子量标准的缓冲液8 mL混 合，95七变性5 min,立即置于冰上,5 min后电泳。在测序仪上完成PCR产物的

15、电泳检测，利用软件收 集电泳结果，进行PCR产物分子量分析和基因型的判定。A.5数据分析A.5.1杂合度杂合度的计算见公式(A.1)：九=-”,(1 .(A.i)n 一 1式中：h 杂合度；P：某个位点的第z个等位基因的样本频率；n-检测样本中序列的数量。4DB31/T 1377.52022A.5.2近交系数近交系数的计算见公式（A.2）；式中：1/2个体工的近交系数；-各代遗传结构的半数;-父亲到共同祖先的代数;母亲到共同祖先的代数;共同祖先自身的近交系数;M1+n2+l=N 亲本相关通径链中的个体数。5DB31/T 1377.52022附录B（规范性）实鸭微卫星DNA标记检测方法B.1 基

16、因组DNA提取鸭腿静脉或蹊静脉采集被检实验鸭的抗凝血，提取基因组DNA。B.2 PCR反应体系反应条件：95七预变性5 min；94 变性30 s,50 C64寸退火30 s,729延伸30 s,30个35个 循环;729再延伸10 min；298 C保存。B.3 PCR产物检测取5 PL PCR产物与1 ML 6又上样缓冲液混匀，根据其产物片段的大小分别用2%2.5%的琼脂 糖凝胶，电泳检测,紫外灯下观察结果并拍照。上样前，根据检测结果用灭菌去离子水将PCR的扩增产 物稀释适宜倍数后，取稀释产物2 kL和含分子质量标准的上样缓冲液8 2L混合,95匕变性5 min,取 出后立即置于冰上。5

17、min后，将变性的PCR产物上样，电泳，收集荧光信号，形成胶图，进行数据提 取、分子质量标准设定和PCR产物片段大小的计算，以及基因型的判定。B.4 数据分析采用生物统计学软件计算群体等位基因和基因频率。其他同A.5。B.5 结果判定结合饲养管理，在未从外部引入新个体的条件下已连续繁殖4个世代以上，则判为符合实验用（见 表 B.l）0表B.1实验鸭遗传检测微卫星位点信息及分组组合标记名称引物序列（5f3）片段大小/bp荧光标记退火温度/CCAUD004TCCACTTGGTAGACCTTGAGTGGGATTCAGTGAGAAGCCT202222HEX62CAUD005CTGGGTTTGGTGGA

18、GCATAATACTGGCTGCTTCATTGCTG248266FAM61ACAUD011TGCTATCCACCCAATAAGTGCAAAGTTAGCTGGTATCTGC129142HEX52CAUD013ACAATAGATTCCAGATGCTGAAATGTCTGAGTCCTCGGAGC87 105FAM58CAUDO23CACATTAACTACATTTCGGTCTCAGCC/XAAGAGTTCAACAGG164167EAM526DB31/T 1377.52022表B.1实验鸭遗传检测微卫星位点信息及分组(续)组合标记名称引物序列(5f3)片段大小/bp荧光标记退火温度/CACAUD026AC

19、GTCACATCACCCCACAGCTTTGCCTCTGGTGAGGTTC142152FAM61CAUD035GTGCCTAACCCTGATGGATGCTTATCAGATGGGGCTCGGA221239FAM63BCAUD032GAAACCAACTGAAAACGGGCCCTCCTGCGTCCCAATAAG118126FAM58CAUD027AGAAGGCAGGCAAATCAGAGTCCACTCATAAAAACACCCACA112122HEX64APHO8AAAGCCCTGTGAAGCGAGCTATGTGTGTGCATCTGGGTGTGT176187HEX53APH13CAACGAGTGACAA

20、TGATAAAACAATGATCTCACTCCCAATAG243255HEX56APH18TTCTGGCCTGATAGGTATGAGGAATTGGGTGGTTCATACTGT149153FAM58APH20ACCAGCCTAGCAAGCACTGTGAGGCTTTAGGAGAGATTGAAAA166172HEX58CAPHO9GGATGTTGCCCCACATATTTTTGCCTTGTTTATGAGCCATTA104130FAM58APH21CTTAAAGCAAAGCGCACGTCAGATGCCCAAAGTCTGTGGT132 139HEX597DB31/T 1377.52022参考文献Cl NY/T 1673畜禽微卫星DNA遗传多样性检测技术规程2鸡微卫星数据库.https：/www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/GG/index3鸭基因组数据.https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/88398