备课素材：如何判断细胞的活性 高一上学期生物人教版必修1.docx

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1、如何判断细胞的活性细胞活性是判断体外培养细胞在某些条件下是否能正常生长的重要指标,检测方法如下：一、染色计数法1. 化学染色法 染色计数法是细胞培养中检查细胞死活最常用的方法，直接利用死细胞和活细胞对染料的不同亲和力，检查细胞活性，能在光学显微镜下观察到染色结果。可分为两类：死细胞着色法和活细胞着色法。使死细胞着色的常用染料有台盼蓝、苯胺黑、伊红Y。能使活细胞着色的常用染料有结晶紫、亚甲基蓝、甲苯胺蓝等。其中最常用的是台盼蓝染色法。细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色，而活细胞能阻止染料进入细胞内，故可以鉴别死细胞与活细胞。通过细胞计数可得出细胞的存活率。

2、本染色法方便实用，价格低廉，操作简单。但是台盼蓝染色时，时间不宜过长，否则部分活细胞也会着色，会干扰计数。而且，细胞没有经过固定，形态不清晰。2. 荧光染色法 一些荧光染料对死细胞和活细胞也有不同的作用效果，利用荧光显微镜检测细胞活性。如碘化丙啶（PI），被活细胞排斥但能穿透正在死亡或已经死亡细胞的细胞膜，因此活细胞不被染料上色，只有死细胞或凋亡细胞才能被染上红色。吖啶橙（AO）能透过质膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。溴乙锭（EB）仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。也可应用AO-EB双染法鉴定细胞死活。 这种检测方法相比传统的染料，具有灵敏度高，操作简

3、便，结果容易分辨等特点，而且利用双染法还可以分辨活细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞、死亡细胞。在细胞凋亡的检测上有很广泛的应用。 缺点在于，要求特殊的仪器进行检测，如荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜或流式细胞仪。而且通过荧光染料具有毒性，操作时需要带手套。二、克隆（集落）形成试验 克隆形成试验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续分裂增殖6次以上，其后代所组成的细胞群体，称为克隆或集落。一般情况，每个克隆可含50个以上的细胞，大小在0.31.0mm3之间。通过计算克隆形成率，可对单个细胞的增殖潜力做定量分析。常见的方法有平板克隆形成试验、软琼脂形成试验等。 这种方

4、法常见于抗肿瘤药物敏感性试验，肿瘤放射生物学试验等。虽然该方法比MTT和SRB法的敏感性更强。但是该方法较为繁琐并耗时，不适合同时监测大量样品，而且在手动计数过程中带有非常大的不确定性，特别是当形成的细胞克隆大小差异较大时，很难得到更有效、精确的数据。无分解能力的细胞也无法用该法检测活性。三、比色法1.MTT法 又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。MTT方法很简单、快捷、准确地测定细胞的增殖反应，而且能避免由于人为操作因素造成试验误差，大大地

5、提高了实验结果的准确性和重现性。MTT方法目前大多用于检测培养细胞的生长和增殖、新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤细胞敏感性试验等。加之其价格低廉，成为目前各实验室检测细胞活性的首选方法之一。2. Alamar Blue法 Alamar Blue是一种安全、稳定、易溶于水且对细胞无毒的新型染料，可通过荧光产生或颜色变化指示细胞的代谢。活细胞线粒体酶能够将蓝色的氧化形式Alamar Blue变成红色的还原形式，同时发生可量化的荧光变化，无活性的细胞不能还原Alamar Blue。荧光的强度或红色的强度反映了细胞增殖的程度，其颜色变化可用酶标仪测定；荧光变化可用荧光测定仪检测，激发波长530nm，散色波

6、长590nm，使用荧光方法时具有更优秀的敏感性。在细胞浓度比较低的情况下，Alamar Blue法比MTT法具有更高的灵敏性。3. 乳酸脱氢酶（LDH）释放法 LDH是活细胞浆内酶，当细胞损伤，细胞膜通透性变化时，会将LDH释放到培养液中。因此培养液中该酶的活性与被裂解的细胞数量成正比。由LDH催化的酶促反应在催化乳酸生成丙酮酸的过程中使氧化型辅酶I（NAD）变成还原型辅酶I（NADH+H），后者再通过递氢体一吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）还原碘硝基氯化四氯唑（INT），INT接受氢离子被还原成紫红色的化合物，酶标仪检测其OD值。与结晶紫染色法和MTT比色法进行灵敏度、重复性和相关性比较，该法简便

7、，灵敏度高，敏感性、客观性、试剂成本及测定速度等都要优于结晶紫染色法和MTT比色法。4. ATP含量测定法 内源性ATP是活体细胞最基本的能量来源，细胞死亡时，ATP迅速水解。因此，测定内源性ATP的含量可以及时反映细胞的活性和活细胞的数量。其原理是，活细胞在有氧和ATP的条件下，荧光酶催化荧光素发出荧光（波长为562nm），强度与ATP含量呈正相关。故所测得的荧光强度可间接反映出存活细胞量。5.放射性检测法 细胞中的蛋白质的合成与细胞核内DNA的复制是细胞增殖的基本前提，通过测定细胞DNA和蛋白质的合成代谢状态，也可判断细胞的生活状态。检测蛋白质合成一帮用放射性核素35S-甲硫氨酸标记，检测DNA复制一般用3H-TdR标记，此方法又称为同位素掺入法。以3H-TdR掺入法为例，胸腺嘧啶脱氧核苷（TdR）是DNA合成的原料，因此3H-TdR加入细胞培养液后，可被活细胞摄取，细胞增殖越多，所掺入的3H-TdR量就越大。检测细胞的3H-TdR放射性强度就可反映出细胞活力及增殖状况。 细胞有活性意味着细胞结构与功能保持正常状态，可通过检测细胞内外特定活性成分分布及含量（膜结构与功能是否完好、活性蛋白能否合成、能量供应是否正常等）、DNA复制及细胞增殖等具体的指标作为判断细胞活性的依据。学科网（北京）股份有限公司