以SIRT1蛋白为靶标的药物分子设计和药理学研究.pdf

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1、目录Y2381435-目录目录.1缩略词简表.5主要实验仪器.6主要实验耗材与试剂.8摘要.9Abstract.12第1章Sirtuin蛋白结构功能及其小分子抑制剂和激动剂.151.1 引言.151.2 Sir tuin蛋白的功能.161.2.1 Sir tuin蛋白的去乙酰化反应.161.2.2 哺乳动物Sir tuin蛋白的分布、底物和功能.171.3 Sir tuin蛋白的结构.191.3.1 Sir tuin蛋白保守催化区域的结构.201.3.2 Sir tuin蛋白与乙酰化多肽的结合.201.3.3 Sir tuin蛋白与NAD+的结合.211.4 Sir tuin蛋白的催化机制.2

2、21.5 SIRT1的小分子抑制剂与激动剂.241.5.1 S1RT1小分子抑制剂的发现.241.5.2 SIRT1小分子激动剂的发现.261目录1.6 展望.291.7 参考文献.29第2章SIRT1的苯并味喃类小分子抑制剂的发现与研究.422.1 引言.422.2 实验材料和方法.432.2.1 SIRT1蛋白的表达纯化.432.2.2 小分子化合物的筛选.442.2.3 判断抑制剂的可逆性.452.2.4 酶动力学反应.462.2.5 同源模建和分子对接.462.2.6 蛋白质免疫印迹.472.3 实验结果和讨论.492.3.1 活性化合物的发现.492.3.2 化合物构效关系的讨论.5

3、12.3.3 化合物与SIRT1蛋白的结合模型.522.3.4 化合物16的抑制类型.572.3.5 抑制剂与SIRT1结合模型的验证.592.3.6 化合物16能够在细胞水平上抑制p53的去乙酰化.642.4 结论.652.5 参考文献.66第3章SIRT1的三氮理并噬二理类小分子抑制剂的发现与研究.692目录3.1 引言.693.2 实验结果和讨论.693.2.1 嚷二喋类衍生物在细胞水平上的评价.693.2.2 嚏二喋类衍生物抑制的可逆性.703.2.3 睡二噗类化合物的抑制类型.713.2.4 嘎二嗖类化合物的构效关系讨论.723.2.5 抑制剂与SIRT1的结合模型.753.2.6

4、结合模型的突变体实验验证.793.2.7 小分子化合物对SIRT1蛋白的抑制机制.813.3 总结.823.4 参考文献.82第4章SIRT1的二芳基酰腺类小分子激动剂的发现与研究.844.1 引言.844.2 实验材料和方法.864.2.1 SIRT3蛋白的表达纯化.864.2.2 SIRT2蛋白的表达纯化.864.2.3 小分子激动剂的筛选和ECp及最大激动倍数的测定.87424等温滴定量热实验（ITC）.874.2.5 测定激动剂对乙酰化多肽乂值的影响.88426蛋白质结晶、数据收集和结构解析.884.2.7 同源模建和分子对接.893目录4.2.8 化合物在细胞水平的稳定性实验.904

5、.3 实验结果和讨论.90431小分子激动剂的发现.904.3.2 二芳基酰腺衍生物的构效关系.914.3.3 化合物的底物选择性.974.3.4 SIRT3与a c-RHKKa t-AMC多肽的晶体复合物结构.984.3.5 SIRT3蛋白与不同的底物形成复合物时的构象变化.1034.3.6 SIRT1蛋白与a c-RHKKa c-AMC多肽的复合物结构模型.1054.3.7 SIRT1的小分子激动剂结合在被荧光基团扩大的狭缝中.1074.3.8 二芳基酰腺类化合物在细胞水平的稳定性、生物利用度和活性测定 1184.3.9 对寻找新的SIRT1激动剂的启示.1214.4 总结.1224.5

6、参考文献.122发表论文及获奖情况.128致谢.1294缩略词简表缩略词简表DTTDith io th r eito l二硫苏糖醇AMC7-Amino-4-Meth yl c o uma r in7-氨基_4-甲基香豆素Sir 2Silent Inf o r ma tio n Reg ula to r 2信息沉默因子2IPTGIso pr o pyl P-D-l-Th io g a la c to pyr a no side异丙基-P-D-硫代半乳糖首SDSSo dium Do dec yl Sulf a te十二烷基硫酸钠Tr isTr is(Hydr o x ymeth yl)Amino

7、meth a ne三羟甲基氨基甲烷EDTAEth ylenedia minetetr a a c etic Ac id乙二胺四乙酸DMSODimeth yl Sulf o x ide二甲基亚飒PBSPh o sph a te Buf f er ed Sa line磷酸盐缓冲液NAD+Nic o tina mide Adenine Dinuc leo tide烟酰胺腺喋吟二核甘酸BSABo vine Ser um Alb umin牛血清白蛋白CDCir c ula r Dic h r o ism圆二色谱NAD+Nic o tina mide Adenine Dinuc leo tide烟酰胺腺噂

8、吟二核甘酸NAMPTNic o tina mide Adenine Dinuc leo tide烟酰胺腺核糖磷酸转移酶TSATr ic h o sta tin A曲古抑菌素AIPTGIso pr o pyl p-D-1-Th io g a la c to pyr a no side异丙基-B-硫代毗喃半乳糖 昔GSTGluta th io ne S-tr a nsf er a se谷胱甘肽疏基转移酶GSHGluta th io ne谷胱甘肽DOXDo x ub inc in阿霉素5主要实验仪器主要实验仪器1.电子天平 0.01g(JT202N)2.电子天平 O.lmg(FA1004)3.电子天

9、平iRg(MX5)4.超低温冰箱(U410-86)5.层析实验冷柜(YC-1)6.高速低温离心机(So r va ll Bio f iig e Str a to s)7.高速低温离心机(So r va ll Evo lutio n RC)8.高速低温离心机(5417R)9.PCR 仪(Ver iti 96 well th er ma l c yc ler)10.pH 计(DELTA320)11.紫外分光光度计(U-0080D)12.标准移液器Eppendo r f13.DNA凝胶电泳仪(EPS-100)上海精天电子仪器公司上海衡平仪器仪表厂Mettler To ledoNew Br unswi

10、c k Sc ientif ic北京德天佑科技发展公司Th er mo Sc ientif icTh er mo Sc ientif icEppendo r fApplied Bio systemsMettler To ledoHita c h i天呈实验仪器有限公司14.蛋白凝胶电泳仪(Mini pr o tein tetr a system)Bio-Ra d15.鼓风干燥箱(DHG-9140A)16.立式压力蒸汽灭菌锅17.多功能酶标仪(po la r sta r o ptima)18.蛋白分离纯化系统(AKTA pur if ier)19.恒温晶体培养箱(Pr ec isio n)20.

11、纯水仪(Dir ec t-Q)21.恒温摇床(TS-211C)天呈实验仪器有限公司 上海博讯实业有限公司BMG La b tec hGE Hea lth c a r eTh er mo Sc ientif icMillipo r e天呈实验仪器有限公司6主要实验仪器22.恒温摇床(THZ-03M2R)23.脱色摇床(STS-2)24.胶片观察仪(WD-9406)25.凝胶成像分析仪(FR-980)26.垂直层流洁净工作台(CA-920-2)27.垂直层流洁净工作台(CA-920-2)28.倒置显微镜29.CO?恒温培养箱30.电热恒温水浴锅(DK-S22)31.制冷恒温混匀仪(MSC-100)

12、32.干热恒温器(MK200-2)33.96孔板振荡器(MB100-2A)34.超声波细胞粉碎机(SCIENTZ-IID)博彩生物科技有限公司上海琪特分析仪器公司北京市六一仪器厂上海复日科技有限公司上海上净净化设备公司上海上净净化设备公司上海长方光学仪器Th eimo Sc ientif ic上海精宏实验设备有限公司杭州奥盛仪器有限公司 杭州奥盛仪器有限公司 杭州奥盛仪器有限公司 宁波新芝生物科技公司7主要实验耗材与试剂主要实验耗材与试剂注：其它为实验室常用试剂与耗材。1.6/12/24 well细胞培养板Co ming2.96孔荧光酶标黑板（平底、中等吸附）Co sta r3.预装锲柱（Ni

13、-NTA）GE Hea lth c a r e4.分子筛(Super dex 75/200)GE Hea lth c a r e5.离子交换柱（mo no S/Q）GE Hea lth c a r e6.填料(Ni-NTA)No va g en7.晶体培养板Ha mpto n8.10/200以枪头Ax yg en9.酵母膏(Yea st Ex tr a c t)Ox o id10.蛋白陈(Tr ypto ne)Ox o id11.晶体筛选试剂盒Ha mpto n12.甘油Sig ma13.二抗（羊抗兔）Sig ma14.乙酰化p53抗体（#2525）Cell Sig na ling Tec h

14、 no lo g y15.P53 抗体(#2527)Cell Sig na ling Tec h no lo g y16.DMEMGib c o17.Antib io tic Antimyc o tic(抗生素)Gib c o18.小牛血清Gib c o19.胰蛋白酶(Tr ypsin)Gib c o20.单/多点突变试剂盒Str a ta g ene摘要摘要人类信息沉默因子1（SIRT1）是一种需要烟酰胺腺喋吟双核甘酸（NAD+）参与反应的去乙酰化酶，该蛋白通过催化多种蛋白和转录因子来参与许多重要 的生理过程，包括细胞凋亡、脂肪代谢、转录调控、胰岛素分泌和机体寿命等。因此，SIRT1蛋白与许

15、多疾病如衰老相关疾病和癌症等密切相关。研究发现，过表达酵母的Sir 2蛋白可以延长酵母寿命，而在小鼠中用化合物激动SIRT1的 去乙酰化活性能够降低小鼠血糖。另外，用SIRT1的小分子抑制剂抑制该酶的 酶活能够致死肿瘤细胞，其抑制剂具有潜在的抗癌效果。因此，寻找SIRT1蛋 白的小分子激动剂和抑制剂都有十分重要的意义。我们在体外通过荧光高通量筛选的方法发现了一类苯/蔡并联喃-苯甲酮类 化合物，该类化合物在体外对SIRT1的抑制活性是微摩尔级。我们通过同源模 建的方法构建了 SIRT1蛋白的结构模型，然后采用分子对接的方法将小分子放 入模型中。通过构效关系讨论，我们发现该类小分子结合在蛋白的C

16、口袋，与 附近的氨基酸Ph e 273、Ph e 312和He 347形成疏水作用，在分子的苯基间位引 入羟基有可能与Asn 346形成氢键作用。接着，我们又发现了一个在苯基的邻 位和间位都有羟基的衍生物（化合物16）,该化合物在体外实验中表现出更好的 抑制活性。我们测定了 16对SIRT1的抑制类型，并通过化合物结构改造、突变 体实验和醉动力学实验等方法验证了该化合物与SIRT1的结合模型。SIRT1蛋 白的C 口袋是NAD卡的烟酰胺部分在催化过程的结合位点，因此，16结合在C 口袋能够阻止NAD，形成有活性的构象，从而抑制去乙酰化反应的进行。另外，我们发现16在细胞水平上也能够抑制SIRT

17、1的去乙酰化活性。SIRT1蛋白的小分子激动剂可能对衰老相关疾病的治疗有一定的作用。我 们通过体外高通量荧光筛选方法发现了一类新结构的SIRT1小分子激动剂，实 验发现，该类激动剂对S1RT1的激动作用具有底物选择性，即只能激动带有荧 9摘要光标签的底物多肽参与的酶活反应。这种现象在SIRT1小分子激动剂的研究领 域十分常见，公认的SIRT1激动剂白藜芦醇和SRT化合物均有此现象，然而其 分子机制和成因并没有得到阐明。为了解释这种现象，我们培养了 SIRT1的同 源蛋白SIRT3和荧光底物多肽a c-RHKKa c-AMC的复合物晶体。通过解析该晶 体的结构，我们发现，荧光团分子香豆素（AMC

18、）扩大了蛋白催化区域的狭缝，其空间位阻作用导致多肽C端的氨基酸与蛋白之间无法形成氢键。被扩大的催 化区多了六个水分子，它们通过彼此之间的氢键作用稳定复合物的构象。我们 基于该复合物的结构构建了 SIRTl/a c-RHKKc-AMC复合物模型，并且提出了三 类小分子激动剂与蛋白-底物复合物的结合模型。通过对底物勺和及值测定，我们发现荧光基团的存在会降低多肽与蛋白之间的结合。模型显示，激动剂的 一部分与荧光团形成兀-冗相互作用，另一部分则插入催化狭缝中，稳定复合物的 构象并提高多肽与蛋白的亲和力。我们通过构效关系讨论、突变体实验和酶动 力学实验验证了结合模型的合理性。该研究为SIRT1蛋白的激动

19、机制提供了新 的发现，对SIRT1激动剂的发现也有一定的提示作用。另外，我们通过高通量筛选的方法发现了一类活性较好的SIRT1抑制剂，该类化合物均以三氮噗并嚏二噗为母核，它们在R位的不同取代表现出不同的 抑制活性，其IC50从3.5微摩尔到100微摩尔不等。在人类乳腺癌细胞MCF-7 中，该类化合物能够上调乙酰化p53的含量，说明它们在细胞水平上对SIRT1 的去乙酰化活性有抑制作用。通过分子对接，我们将化合物放入SIRT1的结构 中，根据构效关系提出了合理的结合模型，并且用突变体实验等手段验证了模 型的合理性。模型显示，化合物的母核结合在蛋白的C 口袋，其R位取代基结 合在B 口袋的上方。在

20、这种构象下，烟酰胺无法进入C 口袋，后续反应也无法 进行。我们的研究为SIRT1小分子抑制剂的发现提供了活性较好的前体化合物,这些结构新颖的小分子有可能成为治疗癌症的潜在药物。10摘要关键词：SIRT1,NAD+,抑制剂，激动剂，构效关系，C 口袋，兀-堆积，疏水 作用，氢键作用，结合模型Ab str a c tAbstractPh.D candidate:Jiahui Wu(Major:Molecular Pharmacology)Directed by:Prof.Dongxiang LiuHuma n Silent Inf o r ma tio n Reg ula to r 1(SIRT1

21、)is a n NAD-dependent dea c etyla se.SIRT1 is invo lved in multiple b io lo g ic a l pr o c esses via dea c etyla ting a b r o a d r a ng e o f pr o teins a nd tr a nsc r iptio n f a c to r s,inc luding a po pto sis,a dipo se meta b o lism,tr a nsc r iptio n,insulin sec tio n a nd lif espa n,wh ic h

22、 r ender s it a po tentia l ta r g et f o r th e desig n o f dr ug s a g a inst c a nc er,dia b etes a nd a g e-r ela ted disea ses.In yea st,o ver ex pr essio n o f Sir 2 pr o tein c o uld inc r ea se th e lif espa n o f yea st;tr ea tment th e o b ese mo del o f mo use with SIRT1 a c tiva to r s r

23、 educ ed th e b lo o d g luc o se to no r ma l levels.On th e o th er h a nd,tr ea tment th e c a nc er c ells with SIRT1 inh ib ito r s c o uld induc e c ell dea th,wh ic h ma y h a ve po tentia l a pplic a tio n in a nti-c a nc er studies.Her e we desc r ib ed new SIRT1 inh ib ito r s with th e sc

24、 a f f o ld o f b enzo f iir a n-3-yl(ph enyl)meth a no ne.Th e inh ib ito r s wer e pr edic ted to b ind in C po c k et o f SIRT1,f o r ming h ydr o ph o b ic inter a c tio ns with Ph e273,Ph e312 a nd Ile347.Intr o duc ing h ydr o x yl to meta po sitio n o f ph enyl ma y f o r m H-b o nd with Asn3

25、46.Indeed,(2,5-dih ydr o x yph enyl)(5-h ydr o x y-1-b enzo f ur a n-3-yl)meth a no ne(16),a n a na lo g ue with h ydr o x yls a t o r th o a nd meta po sitio ns,sh o wed g r ea ter inh ib itio n.Th e b inding mo de wa s va lida ted b y str uc tur a l mo dif ic a tio ns a nd k inetic studies.Sinc e

26、C po c k et is th e site wh er e th e nic o tina mide mo iety o f NAD*b inds a nd th e h ydr o lysis ta k es pla c e,b inding o f 16 in C po c k et wo uld b lo c k th e tr a nsf o r ma tio n o f NAD+to pr o duc tive c o nf o r ma tio n a nd h enc e inh ib it th e dea c etyla se a c tivity.Co nsisten

27、tly,16 12Ab str a c tinh ib ited SIRT1 th r o ug h up-r eg ula ting p53 a c etyla tio n o n c ellula r level.SIRT1 a c tiva to r s h a ve po tentia l th er a peutic a pplic a tio ns in th e tr ea tment o f a g e-r ela ted disea ses.Her e we r epo r ted a new c la ss o f c o mpo unds th a t a c tiva

28、te SIRT1 b y a f luo r esc ent a ssa y.Th e a c tiva tio n is dependent o n th e f luo r o ph o r e la b eled to th e sub str a te.To eluc ida te th e a c tiva tio n mec h a nism o f th e a c tiva to r s,we so lved th e c r ysta l str uc tur e o f SIRT3 in c o mplex with a c-RHKKa c-AMC peptide.Th e

29、 str uc tur e r evea led th a t b inding o f th e f luo r o ph o r e b lo c k ed th e H-b o nd f o r ma tio n a nd c r ea ted a c a vity b etween th e sub str a te a nd th e Ro ssma nn f o ld,in wh ic h six wa ter mo lec ules c o nnec ted th e sub str a te a nd th e Ro ssma nn f o ld via H-b o nd in

30、ter a c tio ns.We b uilt th e SIRT1/a c-RHKKa c-AMC c o mplex mo del b a sed o n th e SIRT3 c o mplex str uc tur e.Km a nd K 1,3,4th ia dia zo le wer e disc o ver ed to inh ib it SIRT1 dea c etyla se a c tivity th r o ug h a h ig h-th r o ug h put f luo r esc ent a ssa y.Th e IC50 va lues o f th e c

31、 o mpo unds a r e r a ng ing f r o m 3.5-100 rM.Th e c o mpo unds wer e disc o ver ed to up-r eg ula te a c etyl-p53 levels in h uma n b r ea st c ells MCF-7.Th e c o mpo unds,r epr esented b y c o mpo und 4,a r e no n-c o mpetitive inh ib ito r s a g a inst a c etyl-peptide,a nd mix ed-type inh ib

32、ito r s a g a inst NAD.Th en,th e c o mpo unds wer e do c k ed into th e str uc tur e o f SIRT1 a nd pr edic ted to b ind in th e C po c k et o f SIRT1,wh ic h wer e suppo r ted b y th e SAR a nd muta g enesis studies.Th e b inding o f th e inh ib ito r pr event NAD+f r o m tr a nsf o r ming to th e

33、 pr o duc tive c o nf o r ma tio n,th us th e f o llo wing c a ta lysis will b e inh ib ited.Co llec tively,h er e we 13Ab str a c tpr o vide a lea d c o mpo und a nd deta iled str uc tur a l inf o r ma tio n f b r develo pment o f mo r e po tent SIRT1 inh ib ito r s,wh ic h ma y f ind a pplic a tio

34、 ns in th e studies o r tr ea tment o f sir tuins-r ela ted disea ses.Key words:SIRT1,NAD+,inh ib ito r,a c tiva to r,str uc tur e-a c tivity r ela tio nsh ip,C po c k et,n-sta c k ing,h ydr o ph o b ic inter a c tio n,h ydr o g en b o nd,b inding mo de14第1章Sir tuin蛋白的结构功能及其小分子抑制剂和激动剂第1章Sir tuin蛋白的结

35、构功能及其小分子抑制剂和激动剂1.1 引言Sir tuin是在生命体中广泛存在的一种NAD+依赖性去乙酰化酶，许多证据 都证明sir tuin蛋白对于机体生命有重要的调控作用。在酵母中，这些特定的酶 通过去乙酰化组蛋白和形成7-氧代乙酰化ADP核糖（2，-0-AADPR）来调控基 因沉默。SIRT1是目前研究颇多的一种人类sir tuin蛋白，该蛋白具有广泛的生 物功能，它通过催化多种底物能够参与到许多重要的生物过程中。Sir tuin广泛存在于各种生命体中，细菌和古生菌的基因组一般只编码一种 sir tuin；真核生物通常有多种sir tuin,其中酵母除了 Sir 2p外还有四种（Hstl

36、-4）；而哺乳动物有七种sir tuin（SIRT1-7）L Sir tuin蛋白家族的成员在许多生物过程 中都起到十分重要的作用，例如它们可以参与机体寿命调控2、脂肪代谢3、胰 岛素的分泌4、神经退行性疾病酶活调控6以及凋亡等7。其中，sir tuin蛋白 最引人注意的功能是其对机体寿命的影响。Ka eb er lein等人证明了在酿酒酵母中,提高Sir 2蛋白的含量能够延长酵母30%的寿命接着，Sir 2蛋白延长寿命的 效果也在线虫和果蝇等模式生物中得到了证实8。目前，已经有许多关于sir tuin蛋白结构功能方面研究的文献报道，例如研 究者们解析出了酵母Sir 2、真菌Sir 2Af l

37、/Sir 2Af 2、人类SIRT1/2/3/5等蛋白晶体 结构,阐明了 Sir tuin蛋白的催化机制研究如烟酰胺碱基交换、酶与底物的结合，发现了许多sir tuin蛋白家族的底物及其通过调控底物参与的各种生理活动。经 过这几年的研究，目前我们已经对sir tuin蛋白的功能和结构有了比较清晰的认 识。15第1章Sir tuin蛋白的结构功能及其小分子抑制剂和激动剂1.2 Sir tuin蛋白的功能1.2.1 Sir tuin蛋白的去乙酰化反应Sir tuin蛋白家族在原核、真核甚至病毒中都调控关键的生物通路）其中，酵母Sir 2是最早被发现的一种sir tuin蛋白。Sir 2是一种组蛋白

38、去乙酰化酶10,不像其它去乙酰化酶如H1等只催化简单的乙酰化赖氨酸水解反应”，Sir 2通过 消耗NAD+来进行去乙酰化反应。反应后，赖氨酸的加乙酰基转移到NAD+的核 糖部位，形成了去乙酰化底物、20-AADPR和游离的烟酰胺。图1反映了基 本的酶反应过程。人类SIRT1蛋白也有相似的催化反应。这类酶的催化反应需要NAD+的参与，而NAD+的浓度取决于细胞的营养水 平巴因此，NAD+能够通过控制sir tuin的活性和下游的底物来很好地对细胞压 力做出反应。Sir tuin蛋白把NAD+转为烟酰胺，烟酰胺在高浓度条件下能够非 竞争性地结合在sir tuin蛋白分子上从而反馈地抑制sir tu

39、in的活性该酶活反 应的另一个产物20-AADPR也是一种信号分子14,但它在代谢调控中所起到 的作用还需要进一步的研究。16第1章Sir tuin蛋白的结构功能及其小分子抑制剂和激动剂图1、Sir 2催化蛋白质赖氨酸残基的去乙酰化。在该反应中，NAD,脱去一个烟 酰胺，赖氨酸的乙酰基转移到中间产物ADPR上形成2,-（7-AADPRo 2,-O-AADPR 从酶中释放之后，可以转化为AO.AADPR。在体内，烟酰胺也可以通过烟酰胺 核糖磷酸转移酶（Na mpt）形成中间体烟酰胺单核昔酸（NMN）,接着在烟配股 核昔酸腺昔酸基转移酶（Nmna t）的作用下重新形成NAD*（摘自文献1.2.2

40、哺乳动物sir tuin蛋白的分布、底物和功能序列比对的结果显示，哺乳动物的sir tuin能够分为四类：SIRT1-3属于第一 类，SIRT4属于第二类，SIRT5属于第三类而SIRT6/7属于第四类。这些sir tuin 蛋白分布在不同的亚细胞层中，它们催化的底物和进行的酶活反应也各不相同，具体见表1。哺乳动物sir tuin蛋白在细胞中的分布是独立的，SIRT1主要存在于 细胞核中，也有少量的存在于细胞质中。在某些情况下如胰岛素信号通路被抑 制时16,SIRT1的出核信号使其能够穿透细胞核转移到胞质中。SIRT2主要存在 于细胞质中，不过当细胞核从G2期转入M期时，核内也能检测到SIRT

41、2蛋白 17o SIRT3、SIRT4和SIRT5都有一段能够定位于线粒体的序列，己经有实验证 实这些蛋白存在于线粒体中艮SIRT6主要存在于细胞核中19,有报道称SIRT7 存在于核仁中2。，但该结果还需要进一步的证实。表1、哺乳动物sir tuin的分布、功能及催化底物。哺乳动物sir tuin 蛋白类别位置催化活性底物SIRT1I细胞核细胞质去乙酰化PGCla,FOXO1,FOXO3,p53,No tc h,NF-kB,HIFla,LXR,FXR,SREBPlc 等SIRT2I细胞质去乙酰化Tub ulin,PEPCK,F0X01,PAR3SIRT3I线粒体去乙酰化LCAD,HMGCS2

42、,GDH,OXPHOS 复合物,SOD2,17第1章Sir tuin蛋白的结构功能及其小分子抑制剂和激动剂IDH2 等SIRT4II线粒体ADP核糖基化GDHSIRT5III线粒体去乙酰化 去琥珀酰化 去丙二酸酰化CPS1SIRT6IV细胞核去乙酰化ADP核糖基化H3K9,H3K56SIRT7IV核仁未知未知较早的时候，sir tuin蛋白被分类为第三类组蛋白去乙酰化酶（HDAC）,因 为第一个被发现的酵母sir 2蛋白能够通过去乙酰化组蛋白H3和H4来沉默某些 基因位点21不过现在，人们更习惯用赖氨酸去乙酰化酶（KDAC）来称呼这 类酶,因为哺乳动物的sir tuin不仅能够去乙酰化组蛋白还

43、能够催化多种底物（见 表1）。除了去乙酰化功能外，SIRT4和SIRT6具有ADP核糖转移酶的功能22,而SIRT5则主要为赖氨酸去琥珀酰化和去丙二酸酰化的调控酶23。SIRT1是哺乳动物sir tuin中与酵母Sir 2同源性最高的NAD+依赖型去乙酰 化酶，也是目前研究最为广泛的sir tuin蛋白。在人类细胞中，SIRT1可以催化 组蛋白Hl、H2和H424,在这个过程中，SIRT1可以与PPARy结合。通过这个 作用，SIRT1抑制了 PPARy控制的基因，并且SIRT1的过表达可以减弱前体脂 肪细胞变成脂肪细胞第一个被发现的SIRT1非组蛋白底物是肿瘤抑制因子 p53,在DNA损伤或

44、氧化压力下，p53的去乙酰化会抑制p53依赖的凋亡加巴 因此，曾经有猜想认为提高SIRT1的活性可致瘤，但很快又有其它的实验结果。SIRT1通过调控FOXO转录因子可以增加细胞对氧化压力的抗性26;SIRT1可 以在脂肪细胞中通过调控FOXO1和PPARy来影响基因表达，并且调控胰岛素 分泌过程中起作用的基因，如在胰腺B细胞系和B细胞特异的SIRT1过表达小鼠 18第1章Sir tuin蛋白的结构功能及其小分子抑制剂和激动剂(BESTO mic e)中调控 unsupling 蛋白 2(UCP2)的表达 4 27。同时，SIRT1 可以通过调控PGCla和抑制NF-kB从而参与到提高葡萄糖代谢

45、和线粒体生成 的过程中28。因此，SIRT1通过催化多种底物，在许多生物过程中起到非常重 要的作用。在线粒体中有三种sir tuin蛋白SIRT3/4/5,其中SIRT3是主要的线粒体去乙 酰化酶290许多SIRT3的底物都在代谢稳态中起着非常重要的作用，例如SIRT3 通过可逆的去乙酰化长链酰基脱氢酶辅酶A(LCAD)来调控线粒体脂肪酸的氧 化另外，SIRT3也能够保护细胞免受活性氧自由基(ROS)的损伤与SIRT1和SIRT3相比，其它SIRT蛋白的功能研究的不甚多。细胞质的 SIRT2可以去乙酰化tub uliiA 但这其中的机制还不太清楚。线粒体蛋白SIRT4 似乎主要与代谢相关，SI

46、RT4可以使GDH进行ADP核糖化，从而抑制其活性，阻碍了氨基酸诱导的胰岛素分泌22a。SIRT5的主要作用不是去乙酰化而是赖氨 酸去琥珀酰化和去丙二酸酰化，而关于SIRT5在体内是否有去乙酰化活性以及 其它的转录后修饰作用仍需要进一步研究。SIRT6蛋白与基因组DNA的稳定性、代谢和衰老有关，SIRT6基因敲除的小鼠在早期就会死亡19o SIRT7可以激活 RNA聚合酶I的翻译，然而其作用的底物仍不太清楚20。1.3 Sir tuin蛋白的结构由于sir tuin蛋白特有的催化特性，底物乙酰化多肽和NAD+会以特定的方 式结合在这些酶的催化活性位点。目前，许多低等生物体的sir tuin蛋白

47、结构和 人类的SIRT1/2/3/5的晶体结构已经被解出。这里我们主要讨论sir tuin蛋白的保 守催化区域以及它们底物的复合物结构。序列比对的结果显示，所有的sir tuin蛋白都具有一段高度保守的序列，而 这段序列在催化过程中起着非常重要的作用。哺乳动物的SIRT1蛋白在N端和 C端各有约240个氨基酸长度左右的柔性区域，有证据显示这些柔性区域能够 19第1章Sir tuin蛋白的结构功能及其小分子抑制剂和激动剂促使酶与某些底物的结合33。实验发现，在酵母Sir 2蛋白的两端有Sir 4的结合 位点，使Sir 2和Sir 4能够在细胞中形成复合物所有的人类sir tuin都在N端 有一个

48、至少30个氨基酸的延伸，据推测可能是一种催化亚基。可以想象到这些 末端可以与底物大分子复合物的末梢区结合，从而进行后续的催化作用，41.3.1 Sir tuin蛋白保守催化区域的结构在sir tuin蛋白的保守催化区域约有250个氨基酸残基，这些氨基酸在所有 的生物体中都十分保守。目前，有许多sir tuin的蛋白结构被报道，包括古细菌 中的 Sir 2Af l3 Sir 2As36,人类的 SIRT13 SIRT238.SIRT339 和 SIRT5?酵 母的Hs t23细菌的c o b B,z和Sir 2Tm36c。通过比较这些sir tuin的晶体结构，我 们发现了一些共性。Sir tu

49、in蛋白的催化区域由两个主要的部分组成，较大的区 域采用了毗咤二核昔酸结合折叠构象，或者称为Ro ssma nn折叠构象，这种构象 经常存在于与NAD+/NADH或NADP+/NADPH结合的蛋白中。较小的区域由两 条插入Ro ssma nn折叠的氨基酸链组成，其中一条与结构中的锌原子结合，该锌 原子与四个固定的半胱氨酸距离相等；另一条则是一个含有一段柔性区域的螺 旋结构。在小区域和大区域中间有一个狭缝，该位置是乙酰化多肽、NAD*的烟 酰胺核糖环和一些小分子的结合口袋（图2）。由于这条狭缝是催化活性口袋，它 会随着结合物的不同而呈现不同的构象。因此，在同样的sir tuin蛋白中，大区 域和

50、小区域的相对位置也会发生变化。1.3.2 Sir tuin蛋白与乙酰化多肽的结合第一个被报道的多肽复合物是Sir 2Af 2与乙酰化底物的复合物结构接 着，人类SIRT3蛋白和它的底物Ac sC2的复合物结构也被报道从这些复合 物的晶体结构可以看出，乙酰化底物的氨基酸主链和sir tuin蛋白催化活性口袋 的氨基酸主链（大区域和小区域）通过氢键来相互作用。这种结合形成了反向 平行三条链的酶-底物的B-折叠，而这种类似于小折叠的相互作用固定了乙酰化20第1章Sir tuin蛋白的结构功能及其小分子抑制剂和激动剂 多肽的N端和C端走向（图2）。乙酰化的赖氨酸插入sir tuin的多肽结合口袋,扩大