水质粪大肠菌群的测定滤膜法(HJ347.1-2018部分代替HJ-T347-2007).pdf

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1、中中华华人人民民共共和和国国国国家家环环境境保保护护标标准准HJ 347.1-2018部分代替 HJ/T 347-2007水质粪大肠菌群的测定滤膜法Water qualityDetermination of fecal coliformMembrane filtration（发布稿）本电子版为发布稿。请以中国环境出版集团出版的正式标准文本为准。2018-12-26 发布2019-06-01 实施生生态态环环境境部部发 布i目次前言.ii1适用范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14方法原理.15干扰和消除.16试剂和材料.27仪器和设备.28样品.39分析步骤.310结果计算与表示.51

2、1精密度和准确度.612质量保证和质量控制.613废物处理.714注意事项.7附录 A（资料性附录）粪大肠菌群检验记录及报告格式.8ii前言为贯彻中华人民共和国环境保护法和中华人民共和国水污染防治法，保护生态环境，保障人体健康，规范水中粪大肠菌群的测定方法，制定本标准。本标准规定了测定地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的滤膜法。本标准是对 水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法（试行）（HJ/T 347-2007）滤膜法部分的修订。本标准首次发布于 2007 年，原起草单位为中国环境监测总站。本次为第一次修订。本次修订的主要内容如下：完善了方法原理的表述；增加了检出限；增加了规范性

3、引用文件、术语和定义、干扰和消除、仪器和设备、样品采集、样品保存、精密度和准确度、质量保证和质量控制、废物处理等章节；自本标准实施之日起，水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法（试行）（HJ/T347-2007）废止。本标准的附录A为资料性附录。本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。本标准起草单位：辽宁省环境监测实验中心。本标准验证单位：大连市环境监测中心、丹东市环境监测中心站、锦州市环境监测中心站、辽阳市环境监测站、铁岭市环境保护监测站和沈阳市疾病预防控制中心。本标准生态环境部2018年12月26日批准。本标准自2019年6月1日起实施。本标准由生态环境部解释。1水质粪大肠

4、菌群的测定滤膜法1适用范围本标准规定了测定水中粪大肠菌群的滤膜法。本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的测定。本方法的检出限：当接种量为 100 ml 时，检出限为 10 CFU/L；当接种量为 500 ml 时，检出限为 2 CFU/L。2规范性引用文件本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。GB/T 14581水质湖泊和水库采样技术指导HJ 494水质采样技术指导HJ/T 91地表水和污水监测技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1粪大肠菌群fecal coliforms又称耐热大肠菌群（thermotolera

5、nt coliforms）。44.5培养 24 h，能在 MFC 选择性培养基上生长，发酵乳糖产酸，并形成蓝色或蓝绿色菌落的肠杆菌科细菌。3.2菌落形成单位colony-forming units（CFU）单位体积样品中的细菌群落总数。4方法原理样品通过孔径为 0.45 m 的滤膜过滤，细菌被截留在滤膜上，然后将滤膜置于 MFC 选择性培养基上，在特定的温度（44.5）下培养 24 h，胆盐三号可抑制革兰氏阳性菌的生长，粪大肠菌群能生长并发酵乳糖产酸使指示剂变色，通过颜色判断是否产酸，并通过呈蓝色或蓝绿色菌落计数，测定样品中粪大肠菌群浓度。5干扰和消除5.1活性氯具有氧化性，能破坏微生物细胞内

6、的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（8.1）2时加入硫代硫酸钠溶液（6.6）消除干扰。5.2重金属离子具有细胞毒性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（8.1）时加入乙二胺四乙酸二钠溶液（6.7）消除干扰。6试剂和材料除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂或生物试剂，实验用水为蒸馏水或去离子水。6.1MFC 培养基。胰胨10 g蛋白胨5 g酵母浸膏3 g氯化钠5 g乳糖12.5 g胆盐三号1.5 g1%苯胺蓝水溶液10 ml1%玫瑰红酸溶液（溶于 8.0 g/L 氢氧化钠液中）10 ml将上述培养基中的成分（除苯胺蓝和玫瑰红酸外），溶解于 1000 ml 水中

7、，调节 pH 至7.4，分装于三角烧瓶内，于 115高压蒸汽灭菌 20 min，储存于冷暗处备用。临用前，按上述配方比例，用灭菌吸管分别加入已煮沸灭菌的 1%苯胺蓝水溶液 1 ml 及 1%玫瑰红酸溶液（溶于 8.0 g/L 氢氧化钠液中）1 ml，混合均匀。如培养物中杂菌不多，则不加玫瑰红酸亦可。加热溶解前，加入 1.2%1.5%琼脂可制成固体培养基。也可选用市售成品培养基。配制好的培养基避光、干燥保存，必要时在 53冰箱中保存，分装到平皿中的培养基可保存 24 周。配制好的培养基不能进行多次融化操作，以少量勤配为宜。当培养基颜色变化，或脱水明显时应废弃不用。6.2无菌滤膜：直径 50 mm

8、，孔径 0.45 m 的醋酸纤维滤膜，按无菌操作要求包扎，经 121高压蒸汽灭菌 20 min，晾干备用；或将滤膜放入烧杯中，加入实验用水，煮沸灭菌 3 次，15min/次，前 2 次煮沸后需更换水洗涤 23 次。6.3无菌水：取适量实验用水，经 121高压蒸汽灭菌 20 min，备用。6.4硫代硫酸钠（Na2S2O35H2O）。6.5乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2O8Na22H2O）。6.6硫代硫酸钠溶液：（Na2S2O3）=0.10 g/ml称取 15.7 g 硫代硫酸钠（6.4），溶于适量水中，定容至 100 ml，临用现配。6.7乙二胺四乙酸二钠溶液：（C10H14N2O8Na22

9、H2O）=0.15 g/ml称取 15 g 乙二胺四乙酸二钠（6.5），溶于适量水中，定容至 100 ml，此溶液可保存 30 d。7仪器和设备7.1采样瓶：1 L、500 ml 或 250 ml 带螺旋帽或磨口塞的广口玻璃瓶。37.2高压蒸汽灭菌器：115、121可调。7.3恒温培养箱：允许温度偏差 44.50.5。7.4过滤装置：配有砂芯滤器和真空泵，抽滤压力勿超过-50 kPa。7.5pH 计：准确到 0.1 pH 单位。7.6培养皿：直径 90 mm。7.7一般实验室常用仪器和设备。注：玻璃器皿及采样器具试验前要按无菌操作要求包扎，121高压蒸汽灭菌 20 min 备用。8样品8.1样

10、品采集点位布设及采样频次按照GB/T 14581、HJ/T 494和HJ/T 91的相关规定执行。采集微生物样品时，采样瓶（7.1）不得用样品洗涤，采集样品于灭菌的采样瓶中。样品采集量可根据水体实际情况而定，一般不少于250 ml。采集河流、湖库等地表水样品时，可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中，约距水面 1015 cm 处，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使样品灌入瓶内然后盖上瓶塞，将采样瓶从水中取出。如果没有水流，可握住瓶子水平往前推。采样量一般为采样瓶容量的 80%左右。样品采集完毕后，迅速扎上无菌包装纸。从龙头装置采集样品时，不要选用漏水龙头，采水前将龙头打开至最大，放水 35 min，然

11、后将龙头关闭，用火焰灼烧约 3 min 灭菌或用 70%75%的酒精对龙头进行消毒，开足龙头，再放水 1 min，以充分除去水管中的滞留杂质。采样时控制水流速度，小心接入瓶内。采集地表水、废水样品及一定深度的样品时，也可使用灭菌过的专用采样装置采样。在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，以免不同层次的搅扰。如果采集的是含有活性氯样品，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液（6.6），以除去活性氯对细菌的抑制作用（每 125 ml 容积加入 0.1 ml 的硫代硫酸钠溶液）；如果采集的是重金属离子含量较高的样品，则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠溶液（6.7），以消除干扰（每 125 ml

12、容积加入 0.3 ml 的乙二胺四乙酸二钠溶液）。注：15.7 mg 硫代硫酸钠（6.4）可去除样品中 1.5 mg 活性氯，硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯量调整。8.2样品保存采样后应在 2 h 内检测，否则，应 10以下冷藏但不得超过 6 h。实验室接样后，不能立即开展检测的，将样品在 4以下冷藏并在 2 h 内检测。9分析步骤9.1样品过滤根据样品的种类判断接种量，最小过滤体积为10 ml，如接种量小于10 ml时应逐级稀释。4先估计出适合在滤膜上计数所使用的体积，然后再取这个体积的1/10和10倍，分别过滤。理想的样品接种量是滤膜上生长的粪大肠菌群菌落数为2060个，总菌落数不得超

13、过200个。当最小过滤体积为10 ml，滤膜上菌落密度仍过大时，则应对样品进行稀释。1:10稀释的方法为：吸取10 ml样品，注入盛有90 ml无菌水（6.3）的三角烧瓶中，混匀，制成1:10稀释样品。样品接种量参考表见表1。表 1接种量参考表样品类型接种量（ml）1001010.110-210-310-410-5地表水水源水湖泊（水库）河流废水生活污水工业废水处理前处理后地下水用灭菌镊子以无菌操作夹取无菌滤膜（6.2）贴放在已灭菌的过滤装置（7.4）上，固定好过滤装置，将样品充分混匀后抽滤，以无菌水（6.3）冲洗器壁23次。样品过滤完成后，再抽气约5 s，关上开关。9.2培养用灭菌镊子夹取滤

14、膜移放在MFC培养基（6.1）上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将培养皿倒置，放入恒温培养箱内，44.50.5培养24 h2 h。9.3对照试验9.3.1空白对照每次试验都要用无菌水（6.3）按照步骤9.1和9.2进行实验室空白测定。9.3.2阳性及阴性对照将粪大肠菌群的阳性菌株（如大肠埃希氏菌Escherichia coli）和阴性菌株（如产气肠杆菌Enterobacter aerogenes）制成浓度为40600 CFU/L的菌悬液，分别按照9.19.2步骤培养，阳性菌株应呈现阳性反应，阴性菌株应呈现阴性反应，否则，该次样品测定结果无效，应查明原因后重

15、新测定。510结果计算与表示10.1结果判读MFC培养基上呈蓝色或蓝绿色的菌落为粪大肠菌群菌落，予以计数。MFC培养基上呈灰色、淡黄色或无色的菌落为非粪大肠菌群菌落，不予计数。结果判读参考图片见图1。图1结果判读参考图片10.2结果计算样品中的粪大肠菌群数（CFU/L），按照公式（1）进行计算：11000CCf（1）阳性菌落阴性菌落（箭头指示处）无菌落生长6式中：C样品中粪大肠菌群数，CFU/L；C1滤膜上生长的粪大肠菌群菌落总数，个；1000将过滤体积的单位由ml转换为L；f样品接种量，ml；注：若平行样结果都在 2060 CFU/L 范围内，最终结果取平均值以几何平均计算。10.3结果表示

16、测定结果保留至整数位，最多保留两位有效数字，当测定结果100 CFU/L时，以科学计数法表示。粪大肠菌群检验记录及报告格式参见附录A。11精密度和准确度11.1精密度6个实验室对低浓度（地下水，浓度均值为2.0102CFU/L）、中浓度（地表水，浓度均值为1.6105CFU/L）和高浓度（生活污水，浓度均值为1.6107CFU/L）三个不同浓度粪大肠菌群的实际样品和有证标准样品（浓度为3670 MPN/L，可接受范围为3307710 MPN/L）进行了6次重复测定：实验室内相对标准偏差范围分别为5.3%12%、0.81%2.1%、0.51%4.2%和7.7%9.8%；实验室间相对标准偏差分别为

17、6.8%、3.9%、4.0%和3.6%；实验室间95%置信区间见表2。表 2实验室间 95%置信区间低浓度（CFU/L）中浓度（CFU/L）高浓度（CFU/L）标准样品（CFU/L）均值95%置信区间均值95%置信区间均值95%置信区间均值95%置信区间2.01021.41022.91021.61059.81042.61051.61078.21063.01076.11023.81029.910211.2准确度6个实验室对含粪大肠菌群浓度为3670 MPN/L（可接受范围为3307710 MPN/L）的标准样品进行了6次重复测定：相对误差范围为-19%-32%；相对误差最终值为：-23%10%。

18、注：微生物检测数据为偏态分布，其测定结果全部经以 10 为底对数转换后进行计算。12质量保证和质量控制12.1培养基检验更换不同批次培养基时要进行阳性和阴性菌株检验，将粪大肠菌群测定的阳性菌株（如大肠埃希氏菌 Escherichia coli）和阴性菌株（如产气肠杆菌 Enterobacter aerogenes）配成适宜浓度，按样品过滤（9.1）的要求使滤膜上生长的菌落数为 2060 个，然后按培养（9.2）7的要求进行操作，阳性菌株应生长为蓝色或蓝绿色菌落，阴性菌株应生长为灰色、淡黄色、无色或无菌落生长。否则，该次样品测定结果无效，应查明原因后重新测定。12.2对照试验12.2.1空白对照

19、每次试验都要用无菌水做实验室空白测定（9.3.1），培养后的培养基上不得有任何菌落生长。否则，该次样品测定结果无效，应查明原因后重新测定。12.2.2阳性及阴性对照定期按照 9.3.2 进行阳性及阴性对照试验，阳性菌株应呈现阳性反应，阴性菌株应呈现阴性反应，否则，该次样品测定结果无效，应查明原因后重新测定。13废物处理使用后的废物及器皿须经 121高压蒸汽灭菌 30 min 或使用液体消毒剂（自制或市售）灭菌后，器皿方可清洗，废物作为一般废物处置。14注意事项当样品浑浊度较高时，应选用其他方法。8附录 A（资料性附录）粪大肠菌群检验记录及报告格式表 A.1粪大肠菌群测定检验记录项目名称：检验日期：年月日检验方法方法依据灭菌锅型号出厂编号培养箱型号出厂编号培养基灭菌温度（）培养温度（）样品编号：过滤体积ml滤膜上生长的菌落总数个稀释倍数（D）倍结果CFU/L检验者：校对：审核：注：可根据实际工作需要自行设计表格，至少要包括上述信息。表 A.2粪大肠菌群测定数据报告格式样品来源采/送样日期分析日期样品数量样品状态监测点位样品编号监测频次标准方法名称标准方法编号测定值：监测结果：备注注：可根据实际工作需要自行设计表格，至少要包括上述信息。