(2.13)--10. 病毒学的研究方法 2021.ppt

《(2.13)--10. 病毒学的研究方法 2021.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《(2.13)--10. 病毒学的研究方法 2021.ppt（81页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、病毒学的研究方法病毒学的研究方法主要内容主要内容一、病毒学研究常用方法二、病毒感染研究一般流程三、理化因子对病毒的作用 组织和细胞培养技术分子生物学方法电子显微镜技术离心技术血清学方法一、病毒学研究常用方法普通离心机：最大转速6000 rpm高速离心机：最大转速为2000025000rpm 超速离心机：转速可达5000080000 rpm 分析性离心机:制备离心机和光学检测系统的结合离心技术离心结束后常需电镜检测纯度 一、病毒学研究常用方法 差速离心法：采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。密度梯度离心：采用甘油，蔗

2、糖，氯化铯配制成抗对流干扰连续密度梯度介质，把病毒粒子和杂质沉淀或浓缩到与它自身密度相等的位置。常用的离心分离方法离心结束后常需电镜检测纯度 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复23次效果会好一些。差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。A:等速度沉降，B:等密度沉降 1932年Ru

3、ska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM），电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。目前TEM的分辨力可达0.2nm。一、病毒学研究常用方法电子显微镜技术电子显微镜技术一、病毒学研究常用方法主要用于病毒的形态观察、大小测定、病毒的鉴定、病毒粒子三维重构等负染色法超薄切片技术免疫电镜技术冷冻电镜技术 通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度20-50nm，切片采用重金属盐染色，以增大反差.莱卡超薄切片

4、机超薄切片技术负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。肌动蛋白纤维的负染电镜照片负染色法冰冻蚀刻,亦称冰冻断裂。标本置于-100C的干冰或-196C的液氮中，进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻。在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构.冰冻蚀刻人冠状病毒（左）与SARS冠状病毒病毒粒子三维重构模型电镜观察发现痘病毒是整个病毒粒子通过吞噬作用进入细胞的组织培养法 (tissue

5、culture)或细胞培养(cellculture)法 是将离体活组织块或分散的组织细胞加以培养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最常用的基本方法。一、病毒学研究常用方法群体培养（左）和克隆培养（右）群体培养:将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层；克隆培养:将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。一、病毒学研究常用方法细胞培养技术原代和次代细胞培养：分离病毒最为敏感 二倍体细胞：用于病毒分离和疫苗制备 传代细胞系：用于病毒的分离鉴定

6、和抗病毒药物筛选研究。常用的细胞系有人宫颈癌细胞（Hela）、传代地鼠肾细胞（BHK21）、人喉上皮癌细胞（Hep-2）、传代非洲绿猴肾细胞（Vero）病毒基因转染细胞系：用于病毒基因调控和抗病毒药物的研究。常用的细胞培养细胞培养技术细胞培养特点 1.细胞的变化细胞的变化有些病毒在细胞内增殖时可引起特有的细胞病变，称为细胞病变效应(CPE)。常见的变化有细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落等。有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等 作用于细胞膜，可使邻近的细胞相互融合，形成多核巨细胞或称融合细胞。有些病毒(如狂犬病病毒、麻疹病毒等)可在培养细胞中形成胞浆或核内的包涵体。病毒培养时出现的CPE正常细胞

7、正常细胞细胞病变(Cytopathic effect,CPE)2.2.红细胞吸附红细胞吸附 (hemadsorption,HAd)(hemadsorption,HAd)n 流感或副流感病毒等感染细胞后，由于细胞膜上出现了血凝素(haemagglutinin,HA)，具有吸附脊椎动物(豚鼠、鸡、猴等)红细胞的能力，这一现象称红细胞吸附，常用来测定具有HA的粘病毒与副粘病毒的增殖。若有相应的抗血清，则能中和细胞膜上的HA，HAd不再发生，称红细胞吸附抑制试验。3.3.干扰现象干扰现象(interference)(interference)n 某些病毒感染细胞时不出现CPE或其他易于测出的变化(如H

8、Ad)，但能干扰在其后感染的另一病毒的增殖。如风疹病毒感染Vero细胞时CPE不明显，但它能干扰后感染的埃可病毒(ECHOV)的增殖，从而阻抑后者所特有的CPE。4.4.细胞代谢的改变细胞代谢的改变 n 病毒感染细胞的结果可使培养液的pH值改变，说明细胞的代谢在病毒感染后发生了变化。这种培养环境的生化改变也可作为判断病毒增殖的指标。噬菌斑：病毒固体培养基上的微生物，产生溶菌现象 107109克隆感染（溶菌不彻底晕圈）。空斑或蚀斑：单层细胞中被病毒感染导致死亡的细胞区叫空斑，一个空斑由一个病毒颗粒感染引起的。不同的病毒引起的空斑形态和大小不同。动物病毒与相应的动物单层细胞反应产生的结果（裂解细胞

9、）枯斑：植物病毒感染植物叶面以后所产生的局部病理病死反应 细胞培养特点病毒的数量与感染性测定 1.1.蚀斑测定蚀斑测定n 是一种检查和准确滴定病毒感染性的方法。将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。病毒吸附后，再覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散。结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中可产生一个局限性的感染灶。用活性染料(如中性红)染色，则活细胞着色，受病毒感染而破坏的细胞不着色，形成肉眼可见的蚀斑(plaque)。每个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒形成的，称作蚀斑形成单位(plaque forming unit,PFU)。病毒悬液中的感染性病毒量的滴度可用PFUml表示

10、。2.50%2.50%组织细胞感染量组织细胞感染量 (TCID50)(TCID50)测定法测定法 n 该方法是测定病毒能使50%的组织培养细胞发生感染的最小量。一般是将病毒悬液作10倍的系列稀释，分别接种细胞，经一定时间后观察CPE、血细胞吸附等指标，以最高稀释度能感染50%细胞的量为终点。最后用统计方法计算出50%组织细胞感染量（50%tissue culture infectious dose,TCID50)。细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）：由病毒增殖引起的细胞改变，称细胞病变效应。不同种类病毒可引起。细胞圆缩、分散、溶解，如肠道病毒、鼻病毒、披膜病毒、痘病毒等

11、；细胞融合成多核巨细胞，如疱疹病毒、副粘病毒、呼吸道合胞病毒；细胞肿胀、颗粒增多、病变细胞聚集成葡萄状，如腺病毒；胞质出现空泡，如SV40细胞；细胞浆或核内出现嗜酸性或嗜碱性包涵体，一至数个不等，如狂犬病毒和巨细胞病毒；轻微病变，如正粘病毒、狂犬病毒、冠状病毒和逆转录病毒等；培养液pH的变化。CPE小结小结 血清学方法一、病毒学研究常用方法中和试验：适用于病毒鉴定，机体中抗体的检测，分析病毒抗原的性质，疫苗接种效果评估等 补体结合试验血凝抑制试验：常用于正粘病毒和副粘病毒感染的诊断和病毒亚型鉴定及抗原变异的监测，如流感病毒的分型 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosor

12、bent assay，ELISA）放射免疫试验（radio immunol assay，RIA）免疫荧光检测（immunofluorescence assay，IFA）凝胶扩散法（gel-diffusion test)病毒感染的血清学诊断n 原理是用已知病毒抗原来检测病人血清中有无相应抗体，故须待病人感染后体内产生抗体时才能检出。n 另外，在采取临床标本及病人血清应注意病程，必须采取患者急性期血清与恢复期血清(双份血清)进行血清学试验。若第2次血清抗体滴度比第1次高出4倍以上时，才有诊断意义。1.中和试验(neutralizing test,NT test)是病毒在活体内或细胞培养中被特异性抗

13、体中和而失去感染性的一种试验。中和抗体(netralizing antibodies,NTAb)是作用于病毒表面抗原(衣壳或包膜)的抗体，同种不同型病毒间一般无交叉，特异性高，而且抗体在体内维持时间长。中和抗体阳性不一定表示正在感染中，也可能因以前有过隐性感染所致。因此，中和试验适用于人群免疫情况的调查，在临床诊断上较少使用。2.补体结合试验(complement fixation test,CF test)n 用已知病毒可溶性(CF)抗原来检测病人血清中相应(CF)抗体。CF抗原是病毒的内部抗原，同种异型间常有交叉，故特异性较中和试验低。但CF抗体出现较早，消失较快，故CF阳性可作为近期感染

14、的指标。3.血凝抑制试验(hemagglutinatia inhibition test,HI test)n 具有HA的病毒能凝集鸡、豚鼠、人等的红细胞，称血凝现象。这种现象能被相应抗体抑制，称HI试验。其原理是相应抗体与病毒结合后，阻抑了病毒表面的HA与红细胞的结合。本试验简易、经济，特异性高，常用于粘病毒及乙型脑炎病毒感染的辅助诊断及流行病学调查，也可鉴定病毒的型与亚型。n病毒 +鸡RBC =凝集（血凝试验）n病毒 +特异性抗体+鸡RBC=不凝集n （血凝抑制试验）沉淀反应 双向免疫扩散分子生物学方法一、病毒学研究常用方法聚合酶链反应（polymerase chain reaction，P

15、CR）转印杂交：Southern blot、Nouthern blot和Westhern blot蛋白质组学：肽图谱基因组学：核酸序列测定及基因功能基因工程：抗病毒疫苗或抗病毒的大分子多肽、病毒载体（一）标本的采集与运送（二）病毒的分离与鉴定（三）病毒感染的快速诊断二、病毒感染研究一般流程 标本的采集与运送是实验成败的关键，必须注意标本采集的时间、部位、方法、正确的处理和运送。应尽可能在发病的初期、急性期采集 选择相应部位采集标本 应在采集和运送中注意冷藏：冻存的标本忌反复冻融 近：用于病毒分离、抗原或核酸检测的标本应尽量取自病变部位或接近病变部位 多：标本的量不能太少，如有可能一次取多种标本

16、，在病程急性期和恢复期都取标本。净：避免污染标本，特别是用于病毒分离或PCR检测的标本。（一）标本的采集与运送n应注意下列原则：n1.对本身带有杂菌(如咽拭子、粪便)或易受污染的标本，要进行病毒分离培养时，应使用抗生素。n2.因病毒在室温中易失去活性，标本应低温保存并尽快送检。n3.血清学诊断标本的采取应在发病初期和病后23w内各取1份血清，以便对比双份血清抗体效价的动态变化。标本的处理：应尽可能无菌操作。标本接种：1 细胞培养 2鸡胚接种：正、副粘病毒科、疱疹病毒、痘病毒适宜用鸡胚分离。3动物接种：选择合适的动物（选择年龄、体重适中的动物，分离病毒一般选用雄性动物）（二）病毒的分离与鉴定病毒

17、的分离1.动物接种n 是最原始的病毒培养方法，根据病毒种类不同，选择敏感动物及适宜接种部位，如嗜神经性病毒（狂犬病毒）可接种于小鼠脑内，痘病毒可接种于家兔角膜或皮内。2.鸡胚培养 n 鸡胚对多种病毒敏感。一般采用孵化914天的鸡胚，根据病毒种类不同，将病毒标本 接种于鸡胚的不同部位，最常用的鸡胚接种部位有：羊膜腔、尿囊腔、绒毛尿囊膜和卵黄囊等。病毒的鉴定（二）病毒的分离与鉴定病毒的纯化：离心病毒的大小和形态：电镜细胞培养特点：细胞培养核酸类型鉴别和序列测定：PCR乙醚敏感试验：是否具有脂类包膜 血清学反应：免疫荧光抗体技术（三）病毒感染的快速诊断 形态学检查：光学显微镜检查：包涵体 电子显微镜

18、检查 病毒抗原检测：ELISA 病毒核酸检测：核酸杂交、凝胶电泳技术、PCR血清学诊断：n 快速诊断主要是指从含有病毒标本及感染机体的血清中检测病毒颗粒、蛋白抗原、IgM抗体和核酸等，往往在数小时内即可得出结果。形态学检查n1.电镜和免疫电镜检查 n2.普通光学显微镜检查 有些病毒在宿主细胞内增殖后，在细胞的一定部位(胞核、胞浆或两者兼有)出现一个或数个、圆形或椭圆形、嗜酸性或嗜碱性的结构，即包涵体。包涵体对病毒感染的诊断有一定价值。内基氏小体negri body病毒蛋白抗原检查 n 用荧光素、放射性同位素、过氧化物酶等标记抗体，采用免疫学和分子生物学技术，检测标本中的病毒蛋白抗原，具有敏感、

19、特异、快速等优点。n1.免疫荧光技术(immunofluorescence,IF)n2.固相放射免疫测定(solid-phase radioimmunoassay,SPRIA)n3.酶免疫技术(enzyme immunoassay,EIA)此法可检测多种病毒及其抗体，主要是酶免疫组化法和酶联免疫吸附试验法(ELISA)。特异性IgM抗体的检测 n 检测病毒特异性IgM抗体可诊断急性感染，特别是对证实孕妇感染风疹病毒尤为重要，但应注意类风湿因子(IgM)的干扰。另外，检测早期抗原的抗体是快速诊断的另一途径。如检测针对EBV的早期抗原(EA)、核心抗原(EANA)和衣壳抗原(VCA)等的抗体，可以

20、区别急性或慢性EBV感染。此外，分子生物学检测技术、气相色谱技术等，均可用来分析和鉴定病毒感染。检测病毒核酸 n1.核酸杂交技术 用于病毒检测的有斑点杂交、细胞内原位杂交、DNA印迹杂交、RNA印迹杂交等。n2.核酸扩增法 目前多数病毒基因已通过分子克隆技术被明确了核苷酸序列，使得DNA扩增技术逐步发展为常规诊断技术之一。n3.基因芯片技术 基因芯片n 又称DNA芯片、生物芯片（biochip）。n 其原理是：将已知的生物分子探针或基因探针，大规模或有序排布于小块硅片等载体上，与待测样品中的生物分子或基因序列相互作用和并行反应，在激光的激发下，产生的荧光谱信号被接受器收集，计算机自动分析处理数

21、据并报告结果。其优点是：可以一次性完成大量样品DNA序列的检测和分析，解决了传统核酸杂交技术的许多不足。芯片技术在病毒等微生物学诊断和流行病学调查方面有着广阔的应用前景。病毒感染的病理学、流行病学疫苗的研制病毒的分子进化病毒功能基因组和蛋白质组学研究后续研究三、理化因子对病毒的作用三、理化因子对病毒的作用 保护作用-有益于病毒的生存；诱变作用-造成病毒某些生物学特性的改变；灭活作用-使病毒活性丧失.病毒的灭活实际上就是丧失病毒的感染性。一方面通过改变和破坏病毒的核酸，使其不能完成复制、转录和翻译等功能；另一方面通过破坏病毒粒子的蛋白质结构，妨碍病毒粒子对敏感细胞的吸附和侵入，阻止病毒核酸进入宿

22、主细胞。通过了解病毒对各种理化因子作用的表现，对于我们从事病毒学的研究和实际，诸如病毒的消毒、提纯、病毒材料或毒种的保存、突变体的获得、疫苗的筛选等都具有重要的实际意义。病毒通常在低温下稳定存在，在高温容易失活。大多数病毒于55-60在几分钟或十几分钟被灭活。而在0 以下则能良好保存，特别是在干冰温度(-70 )和液氮温度(-196 )下能长期保存其感染性。根据经验推算，病毒在不同温度下的感染半衰期分别为：60 以秒计；37 以分计；20 以小时计算；4 以天计算；，-70 以月计算；-196 以年计算。热对病毒的灭活作用主要是通过使蛋白质变性来实现的。1.1.温度温度 电离辐射的直接作用是物

23、质吸收射线产生的次级电子直接作用于核酸分子，造成核酸分子电离，共价键断裂；而间接作用是射线首先作用于核酸分子周围的水分子，形成自由基(OH-、H+、)和自由电子，通过它们间接地作用于核酸分子，使其损伤。非电离辐射的紫外线属电磁波辐射，其波长范围为328210nm，其最大杀伤病毒的波长是265nm，因释放的能量较低，穿透力差，没有电离辐射杀病毒力强。紫外线的破坏作用主要是通过形成嘧啶二聚体或链断裂、分子内或分子间交联以及核酸与蛋白质之间的交联。核酸的结构发生变化，使其不能复制和转录，导致病毒的灭活，但病毒蛋白质的免疫原性仍保持。2.2.辐射辐射pH一般来说，大多数病毒在pH6-8的环境中保持稳定

24、，在pH5以下或者pH9.0以上的环境中，则迅速失活。不同病毒对pH的敏感性差异较大，在实践工作中，必须具体情况具体分析。3.pH3.pH、酶类、脂溶剂、酶类、脂溶剂酶类不同的酶作用于病毒的方式有所不同，因此不同的病毒对酶的敏感性差异较大。大多数情况因壳体或包膜提供保护，使病毒的核酸不被核酸酶降解。但是对于黄瓜花叶病毒因壳体蛋白质亚基之间结合比较疏松，核酸酶容易渗入，即使用低浓度的RNA酶处理也会失去感染性。而象胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等因降解包膜糖蛋白突起或者壳体蛋白，使病毒不能吸附宿主细胞而失去感染性。脂溶剂有包膜病毒均对脂溶剂敏感，但对不同脂溶剂的敏感程度有所差别。一般说来，乙醚具

25、有最大的破坏作用，氯仿次之，丙酮的溶解力最弱。无包膜的病毒一般都对脂溶剂有抗性。1)石碳酸和SDS主要用于病毒核酸的提取，解离病毒的壳体蛋白，释放出病毒的核酸。2)吐温和去氧胆酸钠等去垢剂具有破坏病毒包膜的作用。3)高浓度的尿素和胍因能作用于氢键和氨基酸残基上非极性侧链之间的疏水键，而使病毒蛋白变性。4.4.蛋白质变性剂蛋白质变性剂蛋白质变性剂蛋白质变性剂染料及其光动力作用某些病毒在可见光作用下，经过中性红、美蓝、甲苯胺蓝等染料处理，就能迅速失活。这一现象称为染料的光动力学作用。主要原因是这些染料易于渗透病毒体的蛋白质而与核酸结合，扰乱或置换了核酸分子中嘧啶碱基，造成病毒核酸结构的破坏；而对病

26、毒的蛋白质无严重损害作用，病毒一般都能保持免疫原性。这种必须在有氧条件才能进行，并且因还原剂的存在而缓解。甲醛是病毒学中普遍使用的一种病毒灭活剂。甲醛通过与含胺基的碱基结合，使病毒的核酸变性；若以高浓度的甲醛处理，通过与病毒蛋白质的胺基结合，再与酰胺交联，导致病毒蛋白质的变性，阻止核酸的逸出。甲醛对单链核酸的病毒最为有效，双链核酸对甲醛具有较强的抵抗力。戊二醛的灭活作用明显强于甲醛。5.5.醛类醛类一些化学物质如甘油、蔗糖、谷氨酸钠等,能够减轻病毒在保存过程中其它理化因子对病毒的损伤，达到保持病毒的感染性、抗原性等生物活性：1.甘油它是一种广泛使用的病毒保护剂，一般采用50%甘油盐水中，大多数细菌内杀灭但病毒却存活几十天、几个月、几年2.二甲基亚砜可以减少冷冻过程中微小冰晶的形成，因此对冻存的病毒有保护作用3.病毒冻干保护剂常用的有明胶、血清、胨、白蛋白、谷氨酸钠、葡萄糖、蔗糖等。它们对病毒的保护作用是多方面。如5-10%的糖类等低分子物质是通过使干燥样品的最终水分不致过低，防止蛋白质变性；而高分子物质则能促进病毒制品在冻干过程中的升华干燥，当冻干的病毒加水复原时，还能提高溶解性。6.6.保护剂保护剂QUESTIONS:ELISA原理?通过单层细胞培养,如何确定病毒感染?请设计一个分离HBV病毒的纯化路线?