T_CVDA 4-2022 动物中东呼吸综合征冠状病毒中和抗体检测技术.docx

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1、学兔兔标准下载ICS11.220B41T/CVDA团体标准T/CVDA42022动物中东呼吸综合征冠状病毒中和抗体检测技术DetectingtechniqueofneutralizationantibodyagainstMERS-CoVinanimals2022-07-19发布2022-07-25实施中国兽药协会发布学兔兔标准下载T/CVDA42022目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13缩略语.14试剂和材料.15器材和设备.25.1器材.25.2设备.26.动物血清.26.1样品采集.26.2样品制备.26.3样品处理.27VNT试验操作.27.1安全防护.27.2材料准备.37.

2、3检测操作.38结果观察与判定.48.1染色结果观察.48.2结果判定.4I学兔兔标准下载T/CVDA42022前言本标准按照GB/T1.1-2020给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中国兽药协会提出并归口管理，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所起草。本标准主要起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、宁夏大学、中牧实业股份有限公司。本标准主要起草人：步志高，刘任强，温志远，山丹，龚振兴，张蕾，华荣虹，葛金英，王喜军，王翀。本标准为首次发布。II学兔兔标准下载T/CVDA42022动物中东呼吸综合征冠状病毒中和抗体检测技术1范围

3、本标准规定了用于动物东呼吸综合征病毒血清中和抗体定量测定的病毒中和试验（VNT）的实验操作方法及结果判定标准。本标准适用于动物血清中中东呼吸综合征冠状病毒中和抗体的定性检测和定量测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则。GB/T66822008分析实验室用水规格和试验方法。GB194892008实验室生物安全通用要求。GB14922-94：实验动物微生物学和寄生虫学检测等级（啮齿类和兔

4、类）。3缩略语下列缩略语适用于本文件。MERS：中东呼吸综合征（MiddleEastrespiratorysyndrome）；VNT：病毒中和试验（viralneutralizationtest）；BSL-2：生物安全2级实验室（BiosafetyLaboratoryLevel2）；DMEM：细胞基础培养基（DulbeccosEaglesMinimumEssentialMedium）；PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate-BufferedSaline）；TCID50：半数组织培养感染量（MedianTissueCultureInfectiveDose）；VSV：水泡性口炎病毒（Vesicu

5、larStomatitisVirus）；eGFP：增强绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein）；Sprotein：纤突蛋白（spikeprotein）。4试剂和材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。4.1水：GB/T6682-2008，ddH2O。4.2中东呼吸综合征冠状病毒抗体阴性血清，为利用ELISA和RT-PCR方法验证均为阴性的骆驼阴性血清（由标制单位提供）。4.3中东呼吸综合征冠状病毒抗体阳性血清，为rLa-MERSs重组新城疫病毒两次免疫骆驼2w后收集的阳性血清（由标制单位提供）。4.4稀释用DMEM（见A.1）。4.5细胞培养用DMEM（见A.

6、2）。4.6细胞培养用抗生素溶液（见A.3）。4.7VeroE6细胞（由标制单位提供）。1学兔兔标准下载为载体，缺失自身G蛋白，同时表达中东呼吸综合征病毒S蛋白和eGFP，滴度应10TCID50/mL。T/CVDA420224.8重组水泡性口炎病毒毒株VSVG-MERSs-eGFP（由标制单位提供）：以水泡性口炎病毒Indiana毒株5.05器材和设备5.1器材5.1.18道移液器50L200L（2%）。5.1.2细胞培养板：96孔微量平底培养板。5.1.3细胞计数器。5.1.4U型底96孔板。5.1.5细胞培养瓶离心管（1.5mL，15mL，50mL）；吸头（20L200L）。5.2设备5.

7、2.1恒温培养箱：375%二氧化碳培养箱。5.2.2显微镜：倒置荧光显微镜。5.2.3冰箱：普通冰箱和超低温冰箱。5.2.4BSL-2级生物安全柜。5.2.5离心机。5.2.6恒温水浴箱。6.动物血清6.1样品采集动物血清采集时应做好个人防护（带N95口罩、手套，穿生物安全防护服），配备含75%酒精、碘伏、止血绷带的应急处理箱。6.2样品制备374无菌静脉采集动物血液不少于2mL，静置60min。放置1h至过夜后，6000r/min离心5min，收集上清，-20以下保存待检。样品采集应详细记录相关信息。6.3样品处理采集和制备血清中的废弃物应置于生物安全垃圾袋内，集中高压处理。7VNT试验操作

8、7.1安全防护本检测应在满足GB19489-2008的BSL-2级生物安全实验室内进行。进行本检测的人员应采取针对2学兔兔标准下载T/CVDA42022性防护措施（佩戴口罩、手套、着长袖工作服）。废弃病毒液应弃于0.1%氢氧化钠溶液中。7.2材料准备7.2.1细胞VeroE6细胞按照常规方法，用含10%胎牛血清的DMEM液培养基在375%二氧化碳培养箱中培养。1个75cm2的细胞培养瓶（15mL培养液）细胞刚长成单层后（4106个/mL），可用于4块96孔（细胞数为1104个/孔）细胞培养板的检测。7.2.2检测用培养板以96孔细胞培养板进行检测。提前1624h将VeroE6细胞铺在96孔板中

9、，长成单层备用。7.2.3血清灭活SPF级小鼠免疫中东呼吸综合征冠状病毒S蛋白，三次免疫后无菌采血，制备阳性血清。未免疫SPF级小鼠，无菌采血，制备阴性血清。待测血清、阳性血清、阴性血清在56下灭活30min。灭活时，将血清样本放在56恒温水浴箱内，水面要高于血清液面，但不要超过试管高度。7.3检测操作7.3.1血清的稀释7.3.1.1在培养板上分别标记清楚待检血清、阳性血清、阴性血清对应样品编号，每个样品的同一个稀释度设4个重复，稀释直接在U型底96孔培养板中进行。7.3.1.2在U型底96孔板中加入50L稀释用DMEM。第一行中加入50L血清样品，每个样品共设4个重复。7.3.1.3用50

10、L8道移液器对血清样品进行连续的2倍稀释，每个稀释度共设4个重复。产生1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256的稀释倍数。弃掉从最后一行孔中吸出的50L液体。7.3.2病毒的回归滴定7.3.2.1在U型底96孔板进行病毒回归测定的稀释，第110每孔中加入100L稀释用DMEM，用于病毒滴度的回归测定；在第1112列中加入150L稀释用DMEM用作细胞对照。7.3.2.2VSVG-MERSs-eGFP病毒液在-80及以下温度保存。用时取出1份，置于生物安全柜中融化，立即用稀释用DMEM将病毒稀释成200TCID50/50L，稀释总体积满足每个细胞培养板不少于5

11、mL。7.3.2.3向病毒回归测定的稀释对照板第1列加入100LVSVG-MERSs-eGFP病毒（400TCID50）。7.3.2.4病毒和培养基混匀后，从第1列吸取100L加入到第2列，如此连续稀释至第10列。每稀释一次要更换一次吸头。7.3.2.5弃去第10列稀释的VSVG-MERSs-eGFP病毒液50L，弃于0.1%氢氧化钠溶液中。7.3.2.6弃去96孔细胞培养板中的培养基，将上述稀释好的病毒用50L8道移液器从高稀释毒向低稀释度依次加入细胞培养板中，每孔加50L。37作用1h后再补细胞培养用DMEM，每孔加100L，从病毒高稀释孔向病毒低稀释孔依次加入。7.3.3病毒与血清的中和

12、7.3.3.1病毒的加入待测血清样品测定板内全部各孔均加入7.3.2.2稀释的VSVG-MERSs-eGFP病毒50L（200TCID50）。用8道移液器加入病毒液，从血清稀释倍数低的孔向血清稀释倍数高的孔的方向依次加入病毒液，并且吸头不应接触液面。加入病毒后以培养板盖盖好。7.3.3.2中和将上述全部培养板从生物安全柜中取出，置37温箱中，中和6090min（最多不超过90min）。3学兔兔标准下载T/CVDA420227.3.4弃去96孔细胞培养板中的培养基，将血清与病毒中和后的样品对应加入96孔细胞培养板中，每孔50L。加样时用8道移液器加样，从血清稀释倍数低的孔向血清稀释倍数高的孔的方

13、向依次加入血清和病毒的混合样品。7.3.5.将细胞培养板放入细胞培养箱中作用1h后，每孔补加100L细胞培养用DMEM，从血清低稀释孔向血清高稀释孔依次加入。7.3.6培养全部培养板置375%二氧化碳培养箱中培养48h。8结果观察与判定8.1染色结果观察8.1.1观察顺序按病毒回归滴定板、血清对照样、待测血清样顺序观察。8.1.2观察结果记录在荧光显微镜下观察荧光情况，观察每孔所有视野，依次记录病毒回归滴定结果、细胞对照、培养基对照、阴性血清对照、阳性血清对照及待测血清结果。8.2结果判定8.2.1判定成立条件病毒回归滴定结果的计算值应介于100300TCID50/50L之间；细胞对照、培养基

14、对照、阴性血清对照、阳性血清对照均成立。8.2.2结果判定当细胞对照、培养基对照、阴性血清对照、阳性血清对照均成立时，方可进行判定，判定时间为培养48h。被检血清孔50%荧光被抑制，判为阳性，如低于50%判为阴性。血清能够抑制50%荧光的最高稀释倍数，判定为该血清的中和抗体滴度。当中和抗体滴度8时判为阳性。4学兔兔标准下载T/CVDA42022附录A（规范性附录）溶液配制A.1稀释用DMEM培养基无菌量取DMEM培养990mL，抗生素溶液(见A.3)10mL。4保存。A.2细胞培养用DMEM培养基无菌量取DMEM培养基870mL，加入胎牛血清100mL、100mM/LL-谷氨酰胺20mL、抗生

15、素溶液（见A.3)10mL。4保存。A.3细胞培养用抗生素溶液以DMEM培养基溶解市售抗生素，达到青霉素浓度100IU/mL链霉素浓度100mg/mL，分装后-20保存。5学兔兔标准下载T/CVDA42022附录B（资料性附录）中东呼吸综合征冠状病毒纤突蛋白基因序列B.1中东呼吸综合征冠状病毒纤突蛋白基因序列ATGATACACTCAGTGTTTCTACTGATGTTCTTGTTAACACCTACAGAAAGTTACGTTGATGTAGGGCCAGATTCTGTTAAGTCTGCTTGTATTGAGGTTGATATACAACAGACTTTCTTTGATAAAACTTGGCCTAGGCCAATTG

16、ATGTTTCTAAGGCTGACGGTATTATATACCCTCAAGGCCGTACATATTCTAACATAACTATCACTTATCAAGGTCTTTTTCCCTATCAGGGAGACCATGGTGATATGTATGTTTACTCTGCAGGACATGCTACAGGCACAACTCCACAAAAGTTGTTTGTAGCTAACTATTCTCAGGACGTCAAACAGTTCGCTAATGGGTTTGTCGTCCGTATAGGAGCAGCTGCCAATTCCACTGGCACTGTTATTATTAGCCCATCTACCAGCGCTACTATACGAAAAATTTACCCTGCTTTTATGC

17、TGGGTTCTTCAGTTGGTAATTTCTCAGATGGTAAAATGGGCCGCTTCTTCAATCATACTCTAGTCCTTTTGCCCGATGGATGTGGCACTTTACTTAGAGCTTTTTATTGTATTCTAGAGCCTCGCTCTGGAAATCATTGTCCTGCTGGCAATTCCTATACTTCTTTTGCCACTTATCACACTCCTGCAACAGATTGTTCTGATGGCAATTACAATCGTAATGCCAGTCTGAACTCTTTTAAGGAGTATTTTAATTTACGTAACTGCACCTTTATGTACACTTATAACATTACCGAAGATG

18、AGATTTTAGAGTGGTTTGGCATTACACAAACTGCTCAAGGTGTTCACCTCTTCTCATCTCGGTATGTTGATTTGTACGGCGGCAATATGTTTCAATTTGCCACCTTGCCTGTTTATGATACTATTAAGTATTACTCTATCATTCCTCACAGTATTCGTTCTATCCAAAGTGATAGAAAAGCTTGGGCTGCCTTCTACGTATATAAACTTCAACCGTTAACTTTCCTGTTGGATTTTTCTGTTGATGGTTATATACGCAGAGCTATAGACTGTGGTTTTAATGATTTGTCACAACTCCACT

19、GCTCATATGAATCCTTCGATGTTGAATCTGGAGTTTATTCAGTTTCGTCTTTCGAAGCAAAACCTTCTGGCTCAGTTGTGGAACAGGCTGAAGGTGTTGAATGTGATTTTTCACCTCTTCTGTCTGGCACACCTCCTCAGGTTTATAATTTCAAGCGTTTGGTTTTTACCAATTGCAATTATAATCTTACCAAATTGCTTTCACTTTTTTCTGTGAATGATTTTACTTGTAGTCAAATATCTCCAGCAGCAATTGCTAGCAACTGTTATTCTTCACTGATTTTGGATTACTTTTCATACC

20、CACTTAGTATGAAATCCGATCTCAGTGTTAGTTCTGCTGGTCCAATATCCCAGTTTAATTATAAACAGTCCTTTTCTAATCCCACATGTTTGATTTTAGCGACTGTTCCTCATAACCTTACTACTATTACTAAGCCTCTTAAGTACAGCTATATTAACAAGTGCTCTCGTCTTCTTTCTGATGATCGTACTGAAGTACCTCAGTTAGTGAACGCTAATCAATACTCACCCTGTGTATCCATTGTCCCATCCACTGTGTGGGAAGACGGTGATTATTATAGGAAACAACTATCTCCACTTG

21、AAGGTGGTGGCTGGCTTGTTGCTAGTGGCTCAACTGTTGCCATGACTGAGCAATTACAGATGGGCTTTGGTATTACAGTTCAATATGGTACAGACACCAATAGTGTTTGCCCCAAGCTTGAATTTGCTAATGACACAAAAATTGCCTCTCAATTAGGCAATTGCGTGGAATATTCCCTCTATGGTGTTTCGGGCCGTGGTGTTTTTCAGAATTGCACAGCTGTAGGTGTTCGACAGCAGCGCTTTGTTTATGATGCATACCAGAATTTAGTTGGCTATTATTCTGATGATGGCAACTACT

22、ACTGTTTGCGTGCTTGTGTTAGTGTTCCTGTTTCTGTCATCTATGATAAAGAAACTAAAACCCACGCTACTCTATTTGGTAGTGTTGCATGTGAACACATTTCTTCTACCATGTCTCAATACTCCCGTTCTACGCGATCAATGCTTAAACGGCGAGATTCTACATATGGCCCCCTTCAGACACCTGTTGGTTGTGTCCTAGGACTTGTTAATTCCTCTTTGTTCGTAGAGGACTGCAAGTTGCCTCTCGGTCAATCTCTCTGTGCTCTTCCTGACACACCTAGTACTCTCACACCTCGCA

23、GTGTGCGCTCTGTTCCAGGTGAAATGCGCTTGGCATCCATTGCTTTTAATCATCCCATTCAGGTTGATCAACTTAATAGTAGTTATTTTAAATTAAGTATACCCACTAATTTTTCCTTTGGTGTGACTCAGGAGTACATTCAGACAACCATTCAGAAAGTTACTGTTGATTGTAAACAGTACGTTTGCAATGGTTTCCAGAAGTGTGAGCAATTACTGCGCGAGTATGGCCAGTTTTGTTCCA6学兔兔标准下载T/CVDA42022AAATAAACCAGGCTCTCCATGGTGCCAATTTACGCCAG

24、GATGATTCTGTACGTAATTTGTTTGCGAGCGTGAAAAGCTCTCAATCATCTCCTATCATACCAGGTTTTGGAGGTGACTTTAATTTGACACTTCTAGAACCTGTTTCTATATCTACTGGCAGTCGTAGTGCACGTAGTGCTATTGAGGATTTGCTATTTGACAAAGTCACTATAGCTGATCCTGGTTATATGCAAGGTTACGATGATTGTATGCAGCAAGGTCCAGCATCAGCTCGTGATCTTATTTGTGCTCAATATGTGGCTGGTTATAAAGTATTACCTCCTCTTATGGATGTTAAT

25、ATGGAAGCCGCGTATACTTCATCTTTGCTTGGCAGCATAGCAGGTGTTGGCTGGACTGCTGGCTTATCCTCCTTTGCTGCTATTCCATTTGCACAGAGTATCTTTTATAGGTTAAACGGTGTTGGCATTACTCAACAGGTTCTTTCAGAGAACCAAAAGCTTATTGCCAATAAGTTTAATCAGGCTCTGGGAGCTATGCAAACAGGCTTCACTACAACTAATGAAGCTTTTCGGAAGGTTCAGGATGCTGTGAACAACAATGCACAGGCTCTATCCAAATTAGCTAGCGAGCTATCTAAT

26、ACTTTTGGTGCTATTTCCGCCTCTATTGGAGACATCATACAACGTCTTGATGTTCTCGAACAGGACGCCCAAATAGACAGACTTATTAATGGCCGTTTGACAACACTAAATGCTTTTGTTGCACAGCAGCTTGTTCGTTCCGAATCAGCTGCTCTTTCCGCTCAATTGGCTAAAGATAAAGTCAATGAGTGTGTCAAGGCACAATCCAAGCGTTCTGGATTTTGTGGTCAAGGCACACATATAGTGTCCTTTGTTGTAAATGCCCCTAATGGCCTTTACTTCATGCATGTTGGTTATTAC

27、CCTAGCAACCACATTGAGGTTGTTTCTGCTTATGGTCTTTGCGATGCAGCTAACCCTACTAATTGTATAGCCCCTGTTAATGGCTACTTTATTAAAACTAATAACACTAGGATTGTTGATGAGTGGTCATATACTGGCTCGTCCTTCTATGCACCTGAGCCCATCACCTCCCTTAATACTAAGTATGTTGCACCACATGTGACATACCAAAACATTTCTACTAACCTCCCTCCTCCTCTTCTCGGCAATTCCACCGGGATTGACTTCCAAGATGAGTTGGATGAGTTTTTCAAAAATGTT

28、AGCACCAGTATACCTAATTTTGGTTCTCTAACACAGATTAATACTACATTACTCGATCTTACCTACGAGATGTTGTCTCTTCAACAAGTTGTTAAAGCCCTTAATGAGTCTTACATAGACCTTAAAGAGCTTGGCAATTATACTTATTACAACAAATGGCCGTGGTACATTTGGCTTGGTTTCATTGCTGGGCTTGTTGCCTTAGCTCTATGCGTCTTCTTCATACTGTGCTGCACTGGTTGTGGCACAAACTGTATGGGAAAACTTAAGTGTAATCGTTGTTGTGATAGATACGAGGAA

29、TACGACCTCGAGCCGCATAAGGTTCATGTTCACTAATGA7学兔兔标准下载T/CVDA42022附录C（资料性附录）表达绿色荧光蛋白的重组水泡性口炎病毒构建（VSVG-MERSs-eGFP）C.1材料和试剂PrimeStarDNA聚合酶购自TaKaRa公司；T4DNA连接酶及其它限制性内切酶均购自NEB公司；DL15000DNAmarker和DL5000DNAmarker购自南京诺维赞生物科技（Vazyme）有限公司；质粒小量和中量提取试剂盒购自Qiagen公司；回收试剂盒购自OMEGA公司；胎牛血清（FBS）购自Excell公司；DMEM细胞培养基购自GIBCO公司；磷酸

30、钙转染试剂盒均购自Invitrogen公司；病毒RNA抽提试剂盒购自Qiagen生物公司；鼠源反转录酶（M-MLV）试剂盒购自Invitrogen公司。C.2方法C.2.1重组病毒（VSVG-MERSs-eGFP）的质粒构建化学合成MERS-CoVS基因，根据特异引物进行PCR扩增。PCR产物经胶回收后克隆到pBlueScripIIKS(+)载体上，并经过基因测序后将其命名为pBS-MERSs。质粒pBS-MERS-S经限制性酶NheI处理后，与VSV基因组转录质粒pCI-Rz-VSV-eGFP-FL-R连接，构建表达MERS-CoVS基因的重组VSV全长cDNA质粒，命名为pCI-Rz-VS

31、VG-eGFP-MERSs。经限制性内切酶MluI处理，切除EGFP基因，获得表达MERS-CoVS基因重组VSV全长cDNA质粒，命名为pCI-Rz-VSVG-MERSs。C.2.2重组病毒（VSVG-MERSs-eGFP）的拯救将以5%FBS的DMEM培养的BHK-21接种于六孔板中，培养过夜，当细胞生长密度达到80%左右时，以MOI=0.01的剂量将表达T7聚合酶的重组痘病毒vTF7-3感染细胞1h之后将全长质粒及辅助质粒pBS-N、pBS-P、pBS-L以4：2：1：1的比例混合利用磷酸钙转染试剂转染BHK-21细胞。转染72h后，收获细胞上清液在VeroE6细胞中连续传代直到观察到明

32、显的细胞病变，收获重组病毒，保存于-70冰箱，命名为VSVG-MERSs-eGFP。C.2.3重组病毒（VSVG-MERSs-eGFP）的鉴定将重组病毒VSVG-MERSs-eGFP按MOI=0.01分别感染VeroE6细胞，同时设空白VeroE6细胞作为阴性对照。感染36h后收集细胞，经细胞裂解液裂解处理后进行SDS-PAGE电泳，并将蛋白转印至硝酸纤维膜NC膜，5%脱脂乳封闭过夜。转印的样品分别用鼠抗MERS-CoVS蛋白血清（150）以及鼠抗VSV血清（1:100）为一抗，AlexaFluor680标记的驴抗小鼠IgG（1：6000）为二抗，孵育结束后彻底漂洗NC膜，然后利用红外扫描仪进行westernblot分析。C.2.4重组病毒（VSVG-MERSs-eGFP）的扩增与毒价测定初代重组病毒VSVG-MERSs-eGFP按1%的量接种已长成单层的VeroE6细胞，37，5%CO2培养箱培23天，荧光显微镜下观察，待大部分细胞呈GFP荧光阳性时收获细胞培养上清病毒液，分装后冻存于-70。同时取1支进行毒价测定：将病毒液用含5%FBS的DMEM液进行10倍梯度稀释，向已长成单层的VeroE6细胞的六孔板中每孔加100L，375%CO2培养箱培养，培养48h后观察绿色荧光蛋白表达。按Karber方法计算病毒液的毒价（TCID50/50L）。_1