9基因工程抗体和抗体工程.pptx
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1、第五节第五节第五节第五节 抗体工程抗体工程抗体工程抗体工程 抗体研究进展抗体研究进展抗体研究进展抗体研究进展3 3 3 3个阶段:个阶段:个阶段:个阶段:1890189018901890年白喉抗毒素,多克隆抗体;年白喉抗毒素,多克隆抗体;年白喉抗毒素,多克隆抗体;年白喉抗毒素,多克隆抗体;1975197519751975年杂交瘤技术单克隆抗体;年杂交瘤技术单克隆抗体;年杂交瘤技术单克隆抗体;年杂交瘤技术单克隆抗体;1994199419941994年基因工程抗体;年基因工程抗体;年基因工程抗体;年基因工程抗体;C genes code for the constant regions of im
2、munoglobulin protein chains.V gene is sequence coding for the major part of the variable(N-terminal)region of an immunoglobulin chain.Immunoglobulin genes are assembled from their parts in lymphocytes Figure 24.4 Heavy and light chains combine to generate an immunoglobulin with several discrete doma
3、ins.Immunoglobulin genes are assembled from their parts in lymphocytesFigure 24.4 Heavy and light chains combine to generate an immunoglobulin with several discrete domains.Immunoglobulin genes are assembled from their parts in lymphocytesTable 24.1 Each immunoglobulin family consists of a cluster o
4、f V genes linked to its C gene(s).Immunoglobulin genes are assembled from their parts in lymphocytes FamilyV GenesC GenesManMouseManMouseLambda64Kappa100098Figure 24.5 The lambda C gene segment is preceded by a J segment,so that V-J recombination generates a functional lambda light-chain gene.Immuno
5、globulin genes are assembled from their parts in lymphocytesFigure 24.6 The kappa C gene segment is preceded by multiple J segments in the germ line.V-J joining may recognize any one of the J segments,which is then spliced to the C gene segment during RNA processing.Immunoglobulin genes are assemble
6、d from their parts in lymphocytesFigure 24.7 Heavy genes are assembled by sequential joining reactions.First a D segment is joined to a J segment;then a V gene segment is joined to the D segment.Immunoglobulin genes are assembled from their parts in lymphocytesFigure 24.8 The lambda family consists
7、of V gene segments linked to a small number of J-C gene segments.The diversity of germline information Figure 24.9 The human and mouse kappa families consist of V gene segments linked to 5 J segments connected to a single C gene segment.The diversity of germline information Figure 24.10 A single gen
8、e cluster in man contains all the information for heavy-chain gene assembly.The diversity of germline information Figure 24.12 Consensus sequences are present in inverted orientation at each pair of recombining sites.One member of each pair has a spacing of 12 bp between its components;the other has
9、 23 bp spacing.Recombination between V and C gene segments generates deletions and rearrangements Figure 24.13 Breakage and reunion at consensus sequences generates immunoglobulin genes.Recombination between V and C gene segments generates deletions and rearrangementsFigure 15.8 Reciprocal recombina
10、tion between direct repeats excises the material between them;each product of recombination has one copy of the direct repeat.Recombination between V and C gene segments generates deletions and rearrangementsFigure 15.9 Reciprocal recombination between inverted repeats inverts the region between the
11、m.一、噬菌体抗体库技术的一、噬菌体抗体库技术的一、噬菌体抗体库技术的一、噬菌体抗体库技术的基本方法基本方法基本方法基本方法获取目的基因获取目的基因获取目的基因获取目的基因抗体库技术的载体抗体库技术的载体抗体库技术的载体抗体库技术的载体淘筛淘筛淘筛淘筛表达与鉴定表达与鉴定表达与鉴定表达与鉴定 它是在PCR技术和Phage Display的基础上实现的。其过程是把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的DNA,与噬菌体外壳蛋白的基因相连,在辅助噬菌体的帮助下,噬菌粒包装成丝状噬菌体,抗体分子通过与P 或P相连,在噬菌体表面的一端或分散分布,然后可直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。噬菌体抗体库技
12、术 19901990年年Mc CaffertyMc Cafferty等成功地建立了噬菌体表面展示系等成功地建立了噬菌体表面展示系统,通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于统,通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fdfd噬菌体基因噬菌体基因3 3的下游,使的下游,使ScFvScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面,利以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面,利用亲和层析,两轮富集达用亲和层析,两轮富集达10106 6倍。该技术的成功给抗体基倍。该技术的成功给抗体基因的筛选工作带来了革命性的变革。因的筛选工作带来了革命性的变革。噬菌体表面展示系统(phage surface display systemphage
13、surface display system)噬菌体表面展示文库技术的要点噬菌体表面展示文库技术的要点:外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N N端端将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因 g3 g3或或g8 g8 的先导系列的紧靠下游的先导系列的紧靠下游随机克隆入相应载体形成组合文库随机克隆入相应载体形成组合文库从免疫或未被免疫的从免疫或未被免疫的B B细胞中细胞中PCRPCR扩增抗体全套基因片段扩增抗体全套基因片段用固相化抗原经用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接
14、、数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。体噬菌体库。使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内,形成游离的抗体使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内,形成游离的抗体片段,经过纯化即可获得目的抗体。片段,经过纯化即可获得目的抗体。筛选到的噬菌体再将基因筛选到的噬菌体再将基因g3g3或或g8g8切除后,转入大肠杆菌,切除后,转入大肠杆菌,该项技术的优点:将将抗体的基因型和表型紧密联系抗体的基因型和表型紧密联系起来起来;可绕过杂交瘤技术,不需要复杂的基因工程技术可绕过杂交瘤技术,不需要复杂的基因工程技术;抗体基因筛选的范围广
15、抗体基因筛选的范围广;技术稳定、可靠、生产周期短技术稳定、可靠、生产周期短;可规模化生产可规模化生产;适用范围广,既可用于抗体制备,也适用于其它蛋白如适用范围广,既可用于抗体制备,也适用于其它蛋白如激素、酶、药物、随机多肽等的生产。激素、酶、药物、随机多肽等的生产。噬菌体抗体库技术的发展具有很大优越性。它简单易行,筛选容量大,效率高,绕过了细胞融合及免疫等步骤,而且在表型一基因型的统一和识别一增殖过程上模拟了B细胞的成熟过程,从而在实际应用上具有很大意义。二、噬菌体抗体库技术的二、噬菌体抗体库技术的特点特点 模拟天然全套抗体库模拟天然全套抗体库模拟天然全套抗体库模拟天然全套抗体库 避开了人工免
16、疫和杂交瘤技术避开了人工免疫和杂交瘤技术避开了人工免疫和杂交瘤技术避开了人工免疫和杂交瘤技术 可获得高亲和力的人源化抗体可获得高亲和力的人源化抗体可获得高亲和力的人源化抗体可获得高亲和力的人源化抗体单克隆抗体 噬菌体抗体 杂交瘤技术 展示技术宿主细胞宿主细胞:杂交瘤杂交瘤 细菌细菌筛选范围筛选范围:10:103 3 10 107 7 10109 9时间时间:几个月几个月 几周几周操作操作:繁杂繁杂 相对简单相对简单免疫免疫:必须必须 可避免可避免人源抗体人源抗体:+费用费用:高高 低低生产量生产量:有限有限 无限无限基因获取基因获取:再克隆再克隆 直接直接应用前景应用前景:有限有限 不可估不可
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- 关 键 词:
- 基因工程 抗体 工程
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