3基因工程的基本条件-全.pptx

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1、生物工程专业核心课程生物工程专业核心课程生物工程专业核心课程生物工程专业核心课程基基 因因 工工 程程基因工程基因工程5 2 3 4 1 6 7 8 9 基因工程的基本概基因工程的基本概基因工程的基本概基因工程的基本概念念念念基因工程的基本原理基因工程的基本原理基因工程所需的基本条件基因工程所需的基本条件基因工程的操作过程基因工程的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程酵母基因工程酵母基因工程哺乳动物基因工程哺乳动物基因工程高等植物基因工程高等植物基因工程3 3 基因工程的基本条件基因工程的基本条件C C 用于基因转移的受体菌或细胞

2、用于基因转移的受体菌或细胞B B 用于用于基因克隆的载体基因克隆的载体A A 用于核酸操作的工具酶用于核酸操作的工具酶A 用于核酸操作的工具酶用于核酸操作的工具酶3 3 基因工程的基本条件基因工程的基本条件限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶核酸修饰酶核酸修饰酶核酸修饰酶核酸修饰酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的发现及其生物功能限制性核酸内切酶的发现及其生物功能限制性核酸内切酶的发现及其生物功能限制性核酸内切酶的发现及其生

3、物功能识别双链识别双链识别双链识别双链DNADNA分子中的特定序列，并切割分子中的特定序列，并切割分子中的特定序列，并切割分子中的特定序列，并切割DNADNA双链双链双链双链主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNADNA的入侵的入侵的入侵的入侵细菌的限制与修饰作用细菌的限制与修饰作用细菌的限制与修饰作用细菌的限制与修饰作用hsd hsd RR：编码限制性核酸内切酶编码限制性核酸内切酶编码限制性核酸内切酶编码限制性核酸内切酶hsd hsd MM：编码限制性甲基化酶编码限制性甲基化

4、酶编码限制性甲基化酶编码限制性甲基化酶hsd hsd S S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达编码限制性酶和甲基化酶的协同表达编码限制性酶和甲基化酶的协同表达编码限制性酶和甲基化酶的协同表达19681968年，年，年，年，SmithSmith等人首先从等人首先从等人首先从等人首先从流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d d株中分离出株中分离出株中分离出株中分离出 Hind IIHind II和和和和Hind IIIHind III 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的类型限制性核酸内切酶的类型限制性核酸内切酶的类型限制性核酸内切酶的类型

5、主要特性主要特性主要特性主要特性 I I 型型型型 II II 型型型型 III III 型型型型限制修饰限制修饰限制修饰限制修饰多功能多功能多功能多功能单功能单功能单功能单功能双功能双功能双功能双功能蛋白结构蛋白结构蛋白结构蛋白结构异源三聚体异源三聚体异源三聚体异源三聚体同源二聚体同源二聚体同源二聚体同源二聚体异源二聚体异源二聚体异源二聚体异源二聚体辅助因子辅助因子辅助因子辅助因子ATP MgATP Mg2+2+SAM SAMATP MgATP Mg2+2+SAM SAMMgMg2+2+识别序列识别序列识别序列识别序列TGANTGAN88TGCTTGCT旋转对称序列旋转对称序列旋转对称序列旋

6、转对称序列GAGCCGAGCCAACNAACN66GTGCGTGCCAGCACAGCAGG切割位点切割位点切割位点切割位点距识别序列距识别序列距识别序列距识别序列1 1kbkb处处处处识别序列内或附近识别序列内或附近识别序列内或附近识别序列内或附近距识别序列下游距识别序列下游距识别序列下游距识别序列下游随机性切割随机性切割随机性切割随机性切割特异性切割特异性切割特异性切割特异性切割24-2624-26bpbp处处处处限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名属名属名属名属名 种名种名种

7、名种名 株名株名株名株名H i n d IIIH i n d III H i nH i n d III d IIIHHaemophilus aemophilus ininfluenzaefluenzae d d 嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌d d株株株株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶II II 型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特

8、性型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链识别双链识别双链识别双链DNADNA分子中分子中分子中分子中4-84-8对碱基的特定序列对碱基的特定序列对碱基的特定序列对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型识别切割序列呈典型的旋转对称型识别切割序列呈典型的旋转对称型识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构回文结构回文结构回文结构5 5 G C T G C T G A A T T CG A A T T C G A G 3 G A G 33 3 C G

9、 A C G A C T T A A GC T T A A G C T C 5 C T C 5EcoR IEcoR I的识别序列的识别序列的识别序列的识别序列EcoR IEcoR I的切割位点的切割位点的切割位点的切割位点EcoRIEcoRI等产生的等产生的等产生的等产生的55粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端5 5 GG-C C-T T-GG-AA-AA-T T-T T-C C-GG-AA-G 3G 33 3 C C-GG-AA-C C-T T-T T-AA-AA-GG-C C-T T-C 5C 5EcoRI 37 EcoRI 37 5 5 GG-C C-T T-GG-OHOH PP-AA-A

10、A-T T-T T-C C-GG-AA-G 3G 33 3 C C-GG-AA-C C-T T-T T-AA-AA-PP OHOH-GG-C C-T T-C 5 C 5 退火退火退火退火 4-7 4-7 5 5 GG-C C-T T-GG AA-AA-T T-T T-C C-GG-AA-G 3G 33 3 C C-GG-AA-C C-T T-T T-AA-AA GG-C C-T T-C 5C 5OHOHPPOHOHPPPstIPstI等产生的等产生的等产生的等产生的33粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端5 5 GG-C C-T T-C C-T T-GG-C C-AA-GG-GG-AA-G 3G

11、33 3 C C-GG-AA-GG-AA-C C-GG-T T-C C-C C-T T-C 5C 5PstI 37 PstI 37 5 5 GG-C C-T T-C C-T T-GG-C C-AA-OHOH PP-GG-GG-AA-G 3G 33 3 C C-GG-AA-GG-PP OHOH-AA-C C-GG-T T-C C-C C-T T-C 5 C 5 退火退火退火退火 4-7 4-7 5 5 GG-C C-T T-C C-T T-GG-C C-AA GG-GG-AA-G 3G 33 3 C C-GG-AA-GG AA-C C-GG-T T-C C-C C-T T-C 5C 5OHOHP

12、POHOHPPPvuIIPvuII等产生的平头末端等产生的平头末端等产生的平头末端等产生的平头末端5 5 GG-C C-T T-C C-AA-GG-C C-T T-GG-GG-AA-G 3G 33 3 C C-GG-AA-GG-T T-C C-GG-AA-C C-C C-T T-C 5C 5PvuII 37 PvuII 37 5 5 GG-C C-T T-C C-AA-GG-OHOH PP-C C-T T-GG-GG-AA-G 3G 33 3 C C-GG-AA-GG-T T-C C-PP OHOH-GG-AA-C C-C C-T T-C 5 C 5 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸

13、内切酶限制性核酸内切酶II II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分大部分大部分大部分II II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：型核酸内切酶需要相似的反应条件：型核酸内切酶需要相似的反应条件：型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HClTris-HCl50 mM pH 7.550 mM pH 7.5MgClMgCl2210 mM10 mMNaClNaCl0-150 mM0-150 mMDTTDTT1 mM1 mM0-50 mM 0-50 mM 低盐酶低盐酶低盐酶低盐酶100 mM 100

14、mM 中盐酶中盐酶中盐酶中盐酶150 mM 150 mM 高盐酶高盐酶高盐酶高盐酶VolumeVolume20-100 20-100 m m m ml lT TT T37 37 1-1.5 1-1.5 hrhr1 1 U U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 1 小时，完全小时，完全小时，完全小时，完全水解水解水解水解 1 1 m m m mg g 标准标准标准标准DNADNA所需的酶量所需的酶量所需的酶量所需的酶量限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶

15、限制性核酸内切酶II II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作II II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：型核酸内切酶的多酶联合酶解：型核酸内切酶的多酶联合酶解：型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：5 5 GCTACATGCTACATGGATCCCGGGGGATCCCGGGTTCGCAT3TTCGCAT33

16、3 CGATGTACGATGTACCTAGGGCCCCCTAGGGCCCAAGCGTA5AAGCGTA5BamHI SmaIBamHI SmaI5 5 GCTACATGCTACATG GATCCCGGGG GATCCCGGGTTCGCAT3 TTCGCAT3 3 3 CGATGTACGATGTACCTAG GGCCCCCTAG GGCCCAAGCGTA5AAGCGTA55 5 GCTACATGCTACATGGATCCC GGGGGATCCC GGGTTCGCAT3TTCGCAT33 3 CGATGTACGATGTACCTAGGG CCCCCTAGGG CCCAAGCGTA5AAGCGTA5限制

17、性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶II II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作II II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：型核酸内切酶的多酶联合酶解：型核酸内切酶的多酶联合酶解：型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解使用较贵的酶的盐浓度，加大便

18、宜酶的用量，同时酶解使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切0.10.1倍体积的倍体积的倍体积的倍体积的 5 5 M NaAc pH 5.4M NaAc pH 5.42.52.5倍体积的冰冷乙醇倍体积的冰冷乙醇倍体积的冰冷乙醇倍体积的冰冷乙醇冰浴冰浴冰浴冰浴 5 5 分钟、高速冷冻离心分钟、高速

19、冷冻离心分钟、高速冷冻离心分钟、高速冷冻离心1010分钟、干燥分钟、干燥分钟、干燥分钟、干燥限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素DNADNA样品的纯度：样品的纯度：样品的纯度：样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTAEDTA、SDSSDS、NaClNaCl等等等等加大酶的用量，加大酶的用量，加大酶的用量，加大酶的用量，1 1 m m m mg DNA g DNA 用

20、用用用 10 10U U 酶酶酶酶加大反应总体积加大反应总体积加大反应总体积加大反应总体积延长反应时间延长反应时间延长反应时间延长反应时间限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素DNADNA样品的甲基化程度：样品的甲基化程度：样品的甲基化程度：样品的甲基化程度：大肠杆菌中的大肠杆菌中的大肠杆菌中的大肠杆菌中的damdam甲基化酶在甲基化酶在甲基化酶在甲基化酶在55GATC3GATC3序列中的腺序列中的腺序列中的腺序列中的腺嘌呤嘌呤嘌呤嘌呤NN66位位位

21、位 引入甲基，受其影响的酶有引入甲基，受其影响的酶有引入甲基，受其影响的酶有引入甲基，受其影响的酶有Bcl IBcl I、MboIMboI等，但等，但等，但等，但BamH IBamH I、Bgl IIBgl II、Sau3A ISau3A I不受影响不受影响不受影响不受影响 大肠杆菌中的大肠杆菌中的大肠杆菌中的大肠杆菌中的dcmdcm甲基化酶在甲基化酶在甲基化酶在甲基化酶在55CCAGG3CCAGG3或或或或55CCTGG3CCTGG3序列序列序列序列中的中的中的中的胞嘧啶胞嘧啶胞嘧啶胞嘧啶CC55位位位位上引入甲基，上引入甲基，上引入甲基，上引入甲基，受其影响的酶有受其影响的酶有受其影响的酶

22、有受其影响的酶有EcoR IIEcoR II等等等等哺乳动物中的甲基化酶在哺乳动物中的甲基化酶在哺乳动物中的甲基化酶在哺乳动物中的甲基化酶在55CG3CG3序列中的序列中的序列中的序列中的CC55位位位位上引入甲基上引入甲基上引入甲基上引入甲基限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素核酸内切酶的缓冲液性质：核酸内切酶的缓冲液性质：核酸内切酶的缓冲液性质：核酸内切酶的缓冲液性质：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强

23、度、极端高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pHpH值值值值等，等，等，等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的所谓的所谓的所谓的Star activityStar activity现象现象现象现象 EcoR IEcoR I在正常条件下识别并切割在正常条件下识别并切割在正常条件下识别并切割在正常条件下识别并切割55GAATTC3GAATTC3序列，但在甘序列，但在甘序列，但在甘序

24、列，但在甘油浓度超过油浓度超过油浓度超过油浓度超过5%5%（v/vv/v）时，也可切割时，也可切割时，也可切割时，也可切割55PuPuATPyPy3PuPuATPyPy3或者或者或者或者55AATT3AATT3DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶DNADNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质连接酶的基本性质连接酶的基本性质修复双链修复双链修复双链修复双链DNADNA上缺口处的磷酸二酯键上缺口处的磷酸二酯键上缺口处的磷酸二酯键上缺口处的磷酸二酯键DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶5 5 GG-C C-T T-C C-T T-GG-C C-AA GG-GG-AA-G 3G 33 3 C C-GG-

25、AA-GG AA-C C-GG-T T-C C-C C-T T-C 5C 5OHOHPPOHOHPP5 5 GG-C C-T T-C C-T T-GG-C C-AA-GG-GG-AA-G 3G 33 3 C C-GG-AA-GG-AA-C C-GG-T T-C C-C C-T T-C 5C 5nicknicknicknickDNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶DNADNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质连接酶的基本性质连接酶的基本性质修复与修复与修复与修复与RNARNA链结合的链结合的链结合的链结合的DNADNA链上缺口处的磷酸二酯键链上缺口处的磷酸二酯键链上缺口处的磷酸二酯键链上缺口处的磷酸

26、二酯键T4-DNAT4-DNA连接酶连接酶连接酶连接酶5 5 GG-C C-UU-C C-UU-GG-C C-C C-GG-GG-AA-GG 3 33 3 C C-GG-AA-GG AA-C C-GG-GG-C C-C C-T T-C 5C 5OHOHPPnicknick5 5 GG-C C-UU-C C-UU-GG-C C-C C-GG-GG-AA-GG 3 33 3 C C-GG-AA-GG-AA-C C-GG-GG-C C-C C-T T-C 5C 5DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶DNADNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质连接酶的基本性质连接酶的基本性质连接多个平头双链连接多个平

27、头双链连接多个平头双链连接多个平头双链DNADNA分子：分子：分子：分子：5 5 GG-C C-T T-C C-AA-GG-C C-T T-GG-GG-AA-GG 333 3 C C-GG-AA-GG-T T-C C-GG-AA-C C-C C-T T-C C 5 55 5 GG-C C-T T-C C-AA-GG-OHOH PP-C C-T T-GG-GG-AA-GG 333 3 C C-GG-AA-GG-T T-C C-PP OHOH-GG-AA-C C-C C-T T-C C 5 5 T4-DNAT4-DNA连接酶连接酶连接酶连接酶DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶DNADNA连接酶的

28、反应条件连接酶的反应条件连接酶的反应条件连接酶的反应条件Tris-HClTris-HCl50-100 mM pH 7.550-100 mM pH 7.5MgClMgCl2210 mM10 mMATPATP0.5-1 mM0.5-1 mMDTTDTT5 mM5 mMVolumeVolume10-20 10-20 m m m ml lT TT T4-15 4-15 4-16 4-16 hrhr1 1 U DNAU DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下连接酶的酶活性：在最佳反应条件下连接酶的酶活性：在最佳反应条件下连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 15 反应反应反应反应 1 1 小时，小时，小

29、时，小时，完全连接完全连接完全连接完全连接 1 1 m m m mg g l l l l-DNA-DNA（Hind IIIHind III片段）所需的酶片段）所需的酶片段）所需的酶片段）所需的酶量量量量DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶平头双链平头双链平头双链平头双链DNADNA片段的连接操作片段的连接操作片段的连接操作片段的连接操作从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连

30、接则属于分子间的连连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多接，因此后者反应速度要慢得多接，因此后者反应速度要慢得多接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括：提高平头末端连接效率的方法包括：提高平头末端连接效率的方法包括：提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（加大连接酶用量（加大连接酶用量（加大连接酶用量（1010倍大于粘性末端的连接）倍大于粘性末端的连接）倍大于粘性末端的连接）倍大于粘性末端的连接）加大平头末端底

31、物的浓度，增加分子间碰撞机会加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入加入加入加入10%10%PEG8000PEG8000，促进大分子之间的有效作用促进大分子之间的有效作用促进大分子之间的有效作用促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（加入单价阳离子（加入单价阳离子（加入单价阳离子（NaClNaCl），），），），最终浓度最终浓度最终浓度最终浓度150-200 150-200 mMmMDNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 I I（DNA

32、 pol I DNA pol I）5353的的的的DNADNA聚合酶活聚合酶活聚合酶活聚合酶活性性性性5353的核酸外切酶的核酸外切酶的核酸外切酶的核酸外切酶活性活性活性活性3535的核酸外切酶活的核酸外切酶活的核酸外切酶活的核酸外切酶活性性性性大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 I I的基本性质：的基本性质：的基本性质：的基本性质：3 3 GG-C C-T T-C C-AA-GG-C C-T T-GG-GG-AA-GG-A 5A 55 5 C C-GG-AA-GG-T T-OHOH5 5 ppp dN Mgppp dN Mg2+2+3 3 GG-C C-T

33、T-C C-AA-GG-C C-T T-GG-GG-AA-GG-A 5A 55 5 C C-GG-AA-GG-T T-C C-GG-AA-C C-C C-OHOHDNA pol IDNA pol IDNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 I I（DNA pol I DNA pol I）缺口前移标记法缺口前移标记法缺口前移标记法缺口前移标记法大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 I I 的基本用途：的基本用途：的基本用途：的基本用途：5 5 GG-C C-T T-C C-AA-GG-C C-T T-

34、GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 C C-GG-AA-GG-T T-C C-GG-AA-C C-C C-T T-C C-A A 5 5 MgMg2+2+5 5 dNTP dNTP 5 5 ppppp p dA dA（a a a a-3232P-dATPP-dATP）5 5 GG-C C-T T-C AC A-GG-C C-T T-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 C C-GG-AA-GG-T T-C C-GG-AA-C C-C C-T T-C C-A A 5 5 5 5 GG-C C-T T-C C-A-GA-G-C C-T T-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3

35、C C-GG-AA-GG-T T-C C-GG-AA-C C-C C-T T-C C-A A 5 5 Nick translationNick translation制备制备制备制备3232P P标记的探针标记的探针标记的探针标记的探针DNase IDNase IDNA pol IDNA pol IDNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（大片段（大片段（Klenow Klenow）KlenowKlenow酶的基本性质：酶的基本性质：酶的基本性质：酶的基本性质：大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚

36、合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I I I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得经枯草杆菌蛋白酶处理，获得经枯草杆菌蛋白酶处理，获得经枯草杆菌蛋白酶处理，获得NN端端端端三分之二的大肽段，即为三分之二的大肽段，即为三分之二的大肽段，即为三分之二的大肽段，即为KlenowKlenow酶酶酶酶KlenowKlenow酶仍拥有酶仍拥有酶仍拥有酶仍拥有5353的的的的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性聚合酶活性聚合酶活性和和和和3535的核的核的核的核核酸外切酶活性核酸外切酶活性核酸外切酶活性核酸外切酶活性，但失去了，但失去了，但失去了，但失去了5353的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性DN

37、ADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（大片段（大片段（Klenow Klenow）KlenowKlenow酶的基本用途：酶的基本用途：酶的基本用途：酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的5555粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端DNADNA片段的同位素末端标片段的同位素末端标片段的同位素末端标片段的同位素末端标记记记记cDNAcDNA第二链的合成第二链的合成第二链的合成第二链的合成双脱氧末端终止法测定双脱氧末端终止法测定双脱氧末端终止法测定双脱氧

38、末端终止法测定DNADNA序列序列序列序列DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（大片段（大片段（Klenow Klenow）KlenowKlenow酶的基本用途：酶的基本用途：酶的基本用途：酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的5555粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端5 5 GG-C C-T T-GG-OHOH PP-AA-AA-T T-T T-C C-GG-AA-G 3G 33 3 C C-GG-AA-C C-T T-T T-AA-AA-

39、PP OHOH-GG-C C-T T-C 5 C 5 KlenowKlenowdATP dTTPdATP dTTP5 5 GG-C C-T T-GG-AA-AA-T T-T T-OHOH PP-AA-AA-T T-T T-C C-GG-AA-G 3G 33 3 C C-GG-AA-C C-T T-T T-AA-AA-PP OH-OH-T T-T T-AA-AA-GG-C C-T T-C 5 C 5 DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 I I 大片段（大片段（大片段（大片段（Klenow Klenow）KlenowKlenow

40、酶的基本用途：酶的基本用途：酶的基本用途：酶的基本用途：DNADNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记5 5 GG-C C-T T-GG-OHOH PP-AA-AA-T T-T T-C C-GG-AA-G 3G 33 3 C C-GG-AA-C C-T T-T T-AA-AA-PP OHOH-GG-C C-T T-C 5 C 5 KlenowKlenowa aa a-3232P-ppP-ppppdA dTTPdA dTTP5 5 GG-C C-T T-GG-AA-AA-T T-T T-OHOH PP-AA-AA-T T-T T-C C-GG-AA-

41、G 3G 33 3 C C-GG-AA-C C-T T-T T-AA-AA-PP OH-OH-T T-T T-AA-AA-GG-C C-T T-C 5 C 5 DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA酶的基本特性：酶的基本特性：酶的基本特性：酶的基本特性：在无在无在无在无dNTPdNTP时，可以从任何时，可以从任何时，可以从任何时，可以从任何3-3-OHOH端外切端外切端外切端外切在只有一种在只有一种在只有一种在只有一种dNTPdNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止时，外切至互补核苷酸暴露时停止时，外切至互补核苷酸暴露时停止时

42、，外切至互补核苷酸暴露时停止在四种在四种在四种在四种dNTPdNTP均存在时，聚合活性占主导地位均存在时，聚合活性占主导地位均存在时，聚合活性占主导地位均存在时，聚合活性占主导地位5353的的的的DNADNA聚合酶活性和聚合酶活性和聚合酶活性和聚合酶活性和3535的核酸外切的核酸外切的核酸外切的核酸外切酶活性酶活性酶活性酶活性DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA聚合酶的基本用途：聚合酶的基本用途：聚合酶的基本用途：聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的切平由核酸内切酶产生的切平由核酸内切酶产生的切平由核酸内切酶产生的3

43、3 3 3 粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端5 5 GG-C C-T T-C C-T T-GG-C C-AA-OHOH PP-GG-GG-AA-G 3G 33 3 C C-GG-AA-GG-PP HOHO-AA-C C-GG-T T-C C-C C-T T-C 5 C 5 T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶5 5 GG-C C-T T-C C-OHOH PP-GG-GG-AA-G 3G 33 3 C C-GG-AA-GG-PP HOHO-C C-C C-T T-C 5C 5注意：该酶也能降解双链注意：该酶也能降解双链注意：该酶也能降解双链注意：该酶也能降解双链DNADNA，只是其

44、活性比单链降解活性低很多只是其活性比单链降解活性低很多只是其活性比单链降解活性低很多只是其活性比单链降解活性低很多DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶T4-DNAT4-DNA聚合酶的基本用途：聚合酶的基本用途：聚合酶的基本用途：聚合酶的基本用途：DNADNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记5 5 GG-C C-T T-C C-AA-GG-C C-T T-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 C C-GG-AA-GG-T T-C C-GG-AA-C C-C C-T T-C C-A A 5 5 M

45、gMg2+2+5 5 ppp dN ppp dN 5 5 pppppp dA dA（a aa a-3232P-dATPP-dATP）5 5 GG-C C-T T-C AC A-GG-C C-T T-GG-OHOH HO HO-T T-C C-GG-AA-C C-C C-T T-C C-A A 5 5 T4-DNA polT4-DNA polT4-DNA polT4-DNA pol5 5 GG-C C-T T-C C-AA-GG-C C-T T-GG-GG-AA-GG-T T 333 3 C C-GG-AA-GG-T T-C C-GG-AA-C C-C C-T T-C C-A A 5 5 DNA

46、DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶依赖于依赖于依赖于依赖于RNARNA的的的的DNADNA聚合酶（反转录酶）聚合酶（反转录酶）聚合酶（反转录酶）聚合酶（反转录酶）反转录酶的基本特性：反转录酶的基本特性：反转录酶的基本特性：反转录酶的基本特性：以以以以RNARNA为模板聚合为模板聚合为模板聚合为模板聚合cDNAcDNA链链链链3 3AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA55mRNAmRNA反转录酶反转录酶反转录酶反转录酶MgMg2+2+dNTP dNTP5 5TTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTT oligo(dT)oligo(dT)12-1812-183 3AAAAA

47、AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA55mRNAmRNA5 5TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT33cDNAcDNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶依赖于依赖于依赖于依赖于RNARNA的的的的DNADNA聚合酶（反转录酶）聚合酶（反转录酶）聚合酶（反转录酶）聚合酶（反转录酶）反转录酶的基本特性：反转录酶的基本特性：反转录酶的基本特性：反转录酶的基本特性：双向外切双向外切双向外切双向外切DNA-RNADNA-RNA杂合链中的杂合链中的杂合链中的杂合链中的RNARNA链链链链反转录酶反转录酶反转录酶反转录酶3 RNA3 RNA55 DNADNA33553 RNA

48、3 RNA55 DNADNA3355反转录酶反转录酶反转录酶反转录酶55 DNADNA33核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶单链核酸外切酶：核酸外切酶单链核酸外切酶：核酸外切酶单链核酸外切酶：核酸外切酶单链核酸外切酶：核酸外切酶VIIVII（ExoVIIExoVII）大肠杆菌的核酸外切酶大肠杆菌的核酸外切酶大肠杆菌的核酸外切酶大肠杆菌的核酸外切酶VIIVII不需要不需要不需要不需要MgMg2+2+ExoVIIExoVII3355335533553355核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶双链核酸外切酶：核酸外切酶双链核酸外切酶：核酸外切酶双链核酸外切酶：核酸外切酶双链核酸外切酶：核酸外切酶 IIIIII（ExoII

49、IExoIII）ExoVIIExoVII33553355MgMg2+2+33553355大肠杆菌的核酸外切酶大肠杆菌的核酸外切酶大肠杆菌的核酸外切酶大肠杆菌的核酸外切酶 III III 特异性地从特异性地从特异性地从特异性地从3 3 端外切端外切端外切端外切核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶双链核酸外切酶：双链核酸外切酶：双链核酸外切酶：双链核酸外切酶：l l l l 核酸外切酶核酸外切酶核酸外切酶核酸外切酶（l l l lExoExo）l l l lExoExo33553355MgMg2+2+l l l l核酸外切酶特异性地从核酸外切酶特异性地从核酸外切酶特异性地从核酸外切酶特异性地从5 5 端外切端

50、外切端外切端外切33553355核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶单链核酸内切酶：单链核酸内切酶：单链核酸内切酶：单链核酸内切酶：S1S1核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶S1S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（Aspergillus oryzaeAspergillus oryzae）ZnZn2+2+必需必需必需必需最适最适最适最适pHpH范围为范围为范围为范围为4.0-4.34.0-4.3需要需要需要需要NaCl 10-300 mMNaCl 10-300 mM降解单链降解单链降解单链降解单链DNADNA的速度