【生物】基因工程的基本操作程序第3课时课件 2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3.pptx

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1、基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序选择性必修3第2节：基因工程的基本操作程序-4探究探究实践践 DNA片段的片段的扩增及增及电泳泳鉴定定基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序目的要求1.了解PCR和电泳鉴定的基本原理2.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。PCR仪器电泳结果PCRPCR产物电泳基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序实验实验PCRPCR仪仪电泳装置电泳装置基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序实验原理1.DNA片段扩增原理 利用PCR在体外进行DNA片段扩增PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。53353

2、55353553553553533高温变性延伸复性低温中温1次循环PCR仪能够自动调控温度，一次PCR一般要经历30次循环。基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2.电泳鉴定电泳泳在电场作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程称为电泳。琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳泳PCR产物(DNA)一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。电源+电泳槽缓冲液琼脂糖凝胶加样孔实验原理基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2.电泳鉴定影响影响DNA迁移速率的因素迁移速率的因素a.凝胶的浓度b.DNA分子大小和构象在碱性缓冲溶液中，DNA分子带负电，电泳时DNA从负极向正极迁移。电源+电泳槽琼脂糖凝胶

3、加样孔缓冲液基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2.电泳鉴定电泳泳结果的果的显示示凝胶中DNA分子通过染色，在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。在同一浓度的凝胶中，较小的DNA片段迁移速度比大片段快。大DNA片段小DNA片段Markerbp：碱基对基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序材料用具1.PCR过程使用的材料用具扩增缓冲液（Mg2+）4种脱氧核苷酸的等量混合液2种引物无菌水TaqDNA聚合酶模板DNA离心机PCR仪微量离心管微量移液器一次性吸液枪头用具试剂基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序微量移

4、液器一次性吸液枪头推动杆调节旋钮卸枪头按钮体积刻度吸液杆枪头（注意：注意：吸取一种试剂更换一次枪头吸取一种试剂更换一次枪头）基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序微量离心管离心机基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2.琼脂糖凝胶电泳过程使用的材料用具琼脂糖核酸染料电泳缓冲液凝胶载样缓冲液电泳装置(电泳仪、电泳槽等)微量移液器一次性吸液枪头用具试剂基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序电泳仪电泳槽制好的琼脂糖凝胶基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序制胶模具梳子梳子基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序自主阅读书本自主阅读书本P P8585，掌握，掌握探究实验探究

5、实验的的步骤步骤。1.DNA1.DNA片段扩增的具体过程？片段扩增的具体过程？2.PCR2.PCR扩增产物电泳鉴定的具体过程？扩增产物电泳鉴定的具体过程？基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一一.DNA.DNA片段扩增的具体过程片段扩增的具体过程1.1.移液移液用微量移液器按照用微量移液器按照PCRPCR反应体系配方或反应体系配方或PCRPCR试剂盒的说明书，在试剂盒的说明书，在微量离微量离心管心管中依次加入各组分。中依次加入各组分。2.2.离心离心待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约里，离心

6、约10s10s，使反应液集中在离心管的底部。，使反应液集中在离心管的底部。3.3.反应反应参照下表的参数，设置好参照下表的参数，设置好PCRPCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入管放入PCRPCR仪中进行反应。仪中进行反应。循环程序循环程序变性变性复性复性延伸延伸预变性预变性94,5min/30次次94,30s55,30s72,1min最后一次最后一次94,1min55,30s72,1min预变性预变性：使使DNADNA充分变性，以利于充分变性，以利于引物更好地和模板结合引物更好地和模板结合。延伸时间：延伸时间：可根据目的片段长度适当调整可根据目的

7、片段长度适当调整方法步骤基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序4.配制琼脂糖溶液琼脂糖电泳缓冲液加热至融化稍冷却根据待分离DNA片段的大小，确定琼脂糖溶液浓度的大小。一般配制质量分数为0.8%1.2%的琼脂糖溶液。制成琼脂糖溶液加入核酸染料二二.PCR.PCR扩增产物电泳鉴定的具体过程扩增产物电泳鉴定的具体过程基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序5.制备琼脂糖凝胶将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。梳子基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序6.将凝胶放入电泳槽内待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。梳子凝胶电泳槽凝胶凝胶加样

8、孔一极朝向电泳槽负极基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序7.加入电泳缓冲液将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序8.加样扩增得到的PCR产物凝胶载样缓冲液混合液注入凝胶加样孔微量移液器留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物内含指示剂显示电泳的过程基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序9.电泳接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为15V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序10.电泳结果检测取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。标准参照物PCR扩增产

9、物基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序注意事项注意事项1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。DNADNA片段的扩增及电泳鉴定片段的扩增及电泳鉴定基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序结果分析1.你是否成功扩增出DNA片段?判断的依据是什么?可以通过紫外灯下直接观察DN

10、A条带的分布及粗细来评价扩增结果。该片段大小约为该片段大小约为750bp750bp。基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序结果分析2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带?如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。未出现条带的可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当Taq酶失活Mg+浓度过低引物出现质量问题变性时温度过低，变性时间短如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物特异性不强，或形成引物二聚体复性温度过低模板DNA出现污染基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序总结总结基因工程的基本操作程序基

11、因工程的基本操作程序完成作业：完成作业：步步高大本做到步步高大本做到5050页页基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一一.概念检测概念检测1.1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afpafp整合到土壤农杆菌的整合到土壤农杆菌的TiTi质粒上，质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。确。（1 1）afpafp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。（）（2 2）构建含有）构建含有afpafp基因的基因的TiTi质粒需要限制酶、

12、质粒需要限制酶、DNADNA连接酶和核酸酶。（连接酶和核酸酶。（）（3 3）只要检测出番茄细胞中含有）只要检测出番茄细胞中含有afpafp基因，就代表抗冻番茄培育成功。（基因，就代表抗冻番茄培育成功。（）基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2.2.利用利用PCRPCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关关PCRPCR的叙述错误的是的叙述错误的是 （）A.PCRA.PCR用的用的DNADNA聚合酶是一种耐高温酶聚合酶是一种耐高温酶B.B.变性过程中双链变性过程中双链DNADNA的解开不需要解旋酶的解开不需要解旋酶C.C

13、.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则D.D.延伸过程中需要延伸过程中需要DNADNA聚合酶、聚合酶、ATPATP和和 4 4种核糖核苷酸种核糖核苷酸D D基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 P83P83【练习与应用】二、拓展应用【练习与应用】二、拓展应用2.2.八氢番茄红素合酶八氢番茄红素合酶(其基因用其基因用psypsy表示表示)和胡萝卜素脱饱和酶和胡萝卜素脱饱和酶(其基因用其基因用crtlcrtl表示表示)参参与与-胡萝卜素的合成。胡萝卜素的合成。pmipmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特为磷酸甘露

14、醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将殊培养基上生长。科学家将psypsy和和crtlcrtl基因转入水稻，使水稻胚乳中富含基因转入水稻，使水稻胚乳中富含-胡萝卜素，胡萝卜素，由此生产出的大米称为由此生产出的大米称为“黄金大米黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。请根据以上信息回答下列问题。（1 1）科学家在培育）科学家在培育“黄金大米黄金大米”时，将时，将ctrctr和和psypsy基因导入含基因导入含pmipmi基因的质粒中，基因的质粒中，构建了质粒构建了质粒pSYN12424pSYN12424。该项研究的目的基因是。该项研究的目的基因是_，标记基因，标记基因是是_，质粒，质粒pSYN12424pSYN12424的作用是的作用是_。（2 2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？什么？ctrctr基因和基因和psypsy基因基因pmipmi基因基因将目的基因送入水稻细胞将目的基因送入水稻细胞不能。不能。若若目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，则则可能可能被被切断。切断。