蛋白质构效关系和新型溶栓药物的设计与研制.pdf

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1、分子医学教育部重点实验室 基因 制转录H反转录z信息RNA7蛋白质（表型）遗传信息决定蛋白质分子的结构和功能 一级结构高级结构 线晶体多维核磁共振-计算机模拟分析I;1.蛋白质分子结构的模型化：蛋白质分子结构的计 算机化2.蛋白质分子结构的 优化一 3.蛋白质分子结构构象分析4.蛋白质分子结构搜索 5.蛋白质分子结构间相互作用(Molecular Docking)-作用-作用 非键相互作用-水作用,蛋白质结构转换为计算机语言一计算机作结构分析和处理（单、一的方式进行表达）分子结构利用图论知识数学图 原子(CH N):结点 不同原子用不同颜色表结点化学键：图中的边(单键、键、键不同键用不同颜色)

2、蛋白质分子结构的查询：如搜索、分子力学计算二。分子动力学计算编码方式不 足以表达蛋 白质分子空 间结构量子化学计算原子信息:-类型_坐标键信息：一-类型-连原子-糖链 离子其他特殊结构信息）计算机工作站软件-连接表（PDB数据库）（蛋白质分子三维结构图）1、分子力学方法(Molecular Mechanics,MM)一计算分子 构型和能量-原子设为大不同-键设为长度弹簧蛋白质分子 成为间谐振 动力学模型Hook定计 算原子势能.Etot Estr+Eben d+Etors+Evdw+Eelec+F Etot分子能量 Etors面角转能量Estr键伸缩能量 Evdw 能量 Ebend键角转能量E

3、elec 能量c 1、J、/IVfnla以分子力学为基础设定势能函数和力场按经典牛顿力争运动方程积分3P一 搜索蛋白质分子系艮的运动和构型空间二尊一 I一二（基设定：空间的 系统体的 或构型空间的积分）常用积分算法：-erlet积分Beeman 算法-Leap-For 算法分子动模拟多肽、蛋白质或低聚糖、寡糖的分子空间构型计算晶体（相）或溶液中（液相）蛋白质分子空间构型分子动/AH 用势能函数的梯度AiF表示Fi 随机产星初速度 以原子的初始坐标为起点计算t时刻时原子位置运动速度?L给定时间内多次迭代新构象 J.分子的优势构象 必须对每个待模建分子赋予一定力场。分子能量和分子结构之间关系就是分

4、子力场函数（势函数）。丁分子的能量看作分子内各原子的空间坐标的函数,即分子的能量随分子构型的变化而变化。分子力场函数由经验公式计算。设定下列3个,计算分子-3.1.非相对论的量子力学（定 方程）3.2.核运动和子运动分考3.3.原子 合后表示分子蛋白质分子中特殊结构（、糖、）有合力场参数选用量子力学计算法进行优化-反应过渡态-化态-特殊子量子力学方法计算量和代价很大fl、键伸缩能(bond)2、键角(bond angle)3、面角 能(dihedral angel)4、非键相互作用(nonbonded interaction)5、能量.1、各不同原子在不同成键 下的物理:,参数，键长、键角和面

5、角。.二一2、这些参数来自实验或量子化学计算。B 1、成键作用 2、非成键作用非键相互作用类型1.键作用中性基作用 肽键作用2.作用吸引排斥3.水作用稳定化能(kJ mol1)8-128-1242-214-84低精密度构象搜索对搜索到的构象，用能量函数打分、分离、筛选对高分构象作结构优化、能量评价判定分子对接模拟图1、实时图形对接2、自动对接1、以对接的蛋白质分子晶体结构为基础2、计算结合部位各表面性质（、键、水键分）3、计算对接表面性质 4、按互补匹配原则，对接到结合部位计算机工作站分子模拟软件一分子对接容易模拟1、蛋白质表面结构计算和模拟一（MS 法）2、分子蛋白质分子表面结构匹配一（、.

6、）3、匹配取向和优化参考实摩 1、激酶分子单体三维结构模拟考写2、2分子 激酶分子与 纤溶酶对接计算机分子结构和分子对接模拟 晶体结构分析（相结构）核磁共振（液相结构）分子动力学计算：生物传感器 LC/MS.体示t-PA t-PA人体内专一水解纤溶酶原形成纤溶酶,激活纤溶系统。纤溶功能在清除血管内纤维蛋白，保 持血液循环起重要作用。PAI-1t-PA-4 t-PA:PAIPlasminoge-n Fibrina2-APa Plasmin-Plasmin:I Anti-plasminTh rombinFibrinogen-FibrinFibrinDegradation Products指形区WL

7、三角区1&芍 (D R%1 -nh2信号肽y 三角区2=%,T 9 丹(g)3)e、-一(XSG8 (cDiOO COOH8 ()3184产%DiOO COOH我轻链m(R)图10-1 t-PA前体分子结构模型注：*各种蛋白酶的水解位点；。二硫键；AM 糖链；活性中心tPAt:.TPA分子的5191位氨基酸 与人表生长因子的同源性很高E区在体识的结构A与体结合，血液中除tPAA缺失E区的tPA,血液内延长2区k-x 再孰、&0)、三角区1 nu -指形区&e一 伊、4 一/(X 3%,G)图10-1 t-PA前体分子结构模型注：*各种蛋白酶的水解位点；。二硫键；AM 糖链；活性中心Ki和K2个

8、三角区（），氨基酸 基92 173,180 261成。K和K2都与纤溶酶原分子、凝血酶原分子的三角区 有同源性。K2区是t-PA分子与纤维蛋白分子结合部位，比F 为重 要。K2特异的单抗与t-PA结合后，t-PA失去了与纤维蛋白结 合的能力；含 的K2的t-PA酶解片段，对纤维蛋白的 和力。指形区三角区1&八)0%6至前肽1-nh2信号肽?二角区2 =%,T 9 丹(g)3)8电、-GGG(xs8=、e75Ga轻链(cD(OO COOH图10-1 t-PA前体分子结构模型注：*各种蛋白酶的水解位点；。二硫键；AM 糖链；活性中心 由276627位氨基酸 成，与 蛋白酶 氨酸蛋白酶有很高的同源性

9、 含有t-PA的活性中心，即His?、Asp旬、Ser478 工 J/JL 6r/O 轻链有激活纤溶酶原的活力轻链特异的单抗特异 与tPA的轻链结合，并抑制其活 性轻链cDNA表达产物，也有t-PA活性，t-PA水解纤溶酶 原由轻链决定 tPA的活性 PAI抑制A用DFP处理后的t-PA分子不能再和PAI结合 PAI和t-PA的结合位点：K296-R299%短 4-6min 剂量大50-100mg 血管再栓塞(5-25)价降低t-PA的血浆清除速率;增强纤维蛋白特异性;降低血浆抑制剂PA增加t-PA分子稳定性 定点突变 缺失突变 合蛋白t-PA缺失突变的产物缺失突变指影区，生长因子 区和K1三

10、角区含野生型t-PA(三角区，轻链结构域15060 随机比 r-PA与rt-PA溶栓 A(1B 30内死亡率30内 中大血R-PA 7.43rt-PA 7.22NS1.6 71.3NS0.720.2NS(1)血浆延长2-20,溶栓效率高3-5(2)r-PA 用大表达，价，用方，易7)内血0.10.NS,产 经竞争力强。(3)不反应与rt-PA比 统计学PrimKnngle 2COOHSerine protease part2.Ti野生型t-PA点突变产物(1)K1结构域替换一个氨基酸，形成一个新的糖基化位点。(2)根结构域替换一个氨基酸，去除一个原有的糖基化位点。(3)轻链结构域中替换个氨基酸

11、。PA-的抑制作用。TNK-tPArt-PA血浆*/2(min)173-4纤维蛋白特异性+体外溶栓速度+体内溶栓速度+PA-1抗性+再塞+PrimKringle regions125Senne protease pan250Growth factor domainPACOOH而-。%Finger_：domain296-299 AAAATJ450TNK-t死亡率（）非内大血（）内血（）|TNK-tPA 6.2 4.7(n=8641)rt-PA(n=8488)6.25.93 Lan野生型t-PA缺失突变体，去除了指形区，表 生长因子 区，并修饰了 Ki三角区内的糖基化位点。由中表达生产。NPArt

12、-PAt1/2(min)373-4冠脉再通率（）5746血不反应+NPA可一次性脉用药4.A纤维蛋白单抗Fab片段单链UK（速与血栓结合）（溶栓作用）血浆t2显著延长，溶栓效率比rt-PA和Scu-PA高AFA-UKScu-PArt-PA血浆力/2(min)凝血时间6 1.3正常5.0延长4.3延长针对不同的需要可以选择不同的单抗-选用抗纤维蛋白单抗体选用抗血单 抗体体P b/a、P-140 的-针对含凝血酶的新血栓，则可选用抗凝血酶单抗作为导向体Mol12 34wt-Sak 20 16 4 75%RGD-Sak 20 2 18 10%ABtiyityo o o o 8 6 4 2()uo=B

13、6a)564 w-B-aBuffer Wt-Sak RGO-SakS B一匚 u l n-8 s二U4ABE U Z 6 B 8 U B qo s q vSak(nM)5 0 5 0 5 2 2 110 EUln0Qc8oUBqosq4,-Q wt-Sak-Q-RGOSak0 2 4 6 8 101214Time(min)ISak versus t-PA:similar fibrinolytic potentialsuperior fibrin-specificity.much cheaper($200:$2000)Sak versus SK:more efficiencymore fibrin-specificityTwo functions:Antiplatelet AggregationThrombosysisReduced retenosisReduced Immunogenicity:more affective and safe