实验五 酶联免疫吸附测定BSA抗体效价.pdf

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1、实验五酶联免疫吸附测定BSA抗体效价1.目的要求学习酶联免疫吸附测定的基本原理。(2)掌握酶联免疫吸附测定技术，抗体的效价测定及 酶联免疫测定仪的使用。精品PPT|借鉴参考12.基本原理免疫酶技术：酶标Ab/Ag,酶结合物的酶在免疫反应后，作用于底物后显色，根据颜色的有无和深浅，定量测定 Ab/Ago免疫反应：一次或数次具Ag,Ab特异的免疫学反应酶促反应：只进行一次显示出生物放大作用，灵敏度ng,pg精品PPT|借鉴参考260年代初期，Averameas&Ram等建立了免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)利用特殊的交联剂研制出辣根过氧化物酶-人血清白 蛋白及酸性

2、磷酸酯酶-抗体，统称为酶标记物或酶结 合物，用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定精品PPT|借鉴参考3酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay简称为Elisa)-是在免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技 术。本法兼有灵敏度高和特异性强两方面的优点。精品PPT|借鉴参考41974年 Voller等用聚苯乙烯微量反应板作为免疫吸附剂吸附抗体(抗 原)，再与相应的酶标记物结合操作更方便，易重复灵敏度可高达ng(10-9g)至pga0T2g),精品PPT|借鉴参考5(Enzyme-Linked

3、 Immunosorbent Assay)精品PPT|借鉴参考6免疫标记技术精品PPT|借鉴参考7（1 荧光素、放射性同位素、酶、|标记抗体或抗原|铁蛋白、胶体金及化学（或生物）1-；-1 发光剂 镜检观察或进行自 动化测定荧光显微镜，射线测量仪，酶标 检测仪，电子显微镜和发光免疫 测定仪等直接在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上,对抗原抗体反应进行定 性和定位研究应用各种液相和固相免疫 分析方法，对体液中的半 抗原、抗原或抗体进行定 性和定量测定精品PPT|借鉴参考8酶标技术酶-性能稳定、经济易得、底物无色、产物显色,便于检测常用的酶:碱性磷酸酯酶、辣根过氧化物酶(horserad pero

4、xidase简称HRP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖甘酶等。精品PPT|借鉴参考9戊二醛法，过碘酸氧化法 将酶与Ab交联在一起C TMB+H2O2Ag-Ab-抗Ab-HRP 仁产物（黄色，OD4 5 0）+H2。精品PPT|借鉴参考10载体表面 抗原结合酶促底物 显色反应E.E EHFSf-E抗原抗体酶酶标抗体00 nc 0 物 底显色产物图一 直接型Elisa精品PPT|借鉴参考11加抗体加睥标抗抗体加底物加抗原LJ瑞南碑就圈抗原吸附 形成抗原-抗体抗体与海标抗抗体 睥促底物于我体表面复合物结合旻色反应图二 间接型Elisa精品PPT|借鉴参考12加抗原加待弄抗体加薛标抗抗体加底物加特再抗体图三

5、双抗体夹心型ELISA精品PPT|借鉴参考13相忱体结今(愧阳性图四固相抗体竞争型ELISA 未知抗原量=A(1)-A(2)精品PPT|借鉴参考14每次反应后都要反复洗涤？1.保证反应的定量反应2.防止重叠反应，引起非特异现象。精品PPT|借鉴参考15 Blocking ReagentantibodyNon-developed Secondary一Developed SecondaryStep/:Coat plate with antigenStep 2:Step 3:Block non-Add sampleSpecificBinding sitesStep 4:Add conjugated

6、SecondaryStep 5:Add Substrate精品PPT|借鉴参考16HIV(human immunodeficiency virus)detectionPartially purified,inactivated HIV antigensantigens pre-coated onto an ELISA plate 部分纯化，灭活病毒抗原 抗原涂到酶标板Patient serum which contains antibodies.If the patient is HIV+,then this serum will contain antibodies to Hiy and t

7、hose antibodies will bind to the HIV antigens on the plate.病人血清中含有抗体。如果病人是艾滋病毒+,那么这个血清含有 艾滋病毒抗体，这些抗体可以绑定到病毒抗原板Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme.This is the second antibody,and it binds to human antibodies.抗人免疫球蛋白耦合酶。这是继抗体，并结合人类抗体substrate which changes color when cleaved by the enzyme a

8、ttached to the second antibody.基板而改变颜色，当裂解酶附二抗体精品PPT|借鉴参考1741OOpositivenegative精品PPT|借鉴参考18NegativePatient BPositiveControlNegative ControlPatient APatient BPatient CAssayControl1.6 890.1530.0550.4121.9990.123精品PPT|借鉴参考19Protein protein interaction-一ELISA1.Direct elisa different epitopeCoat with pre

9、y proteinIncubate with bait proteinPimary Ab anti bait protein-直接酶联免疫吸附试验不同表位 外套与猎物蛋白 孵化与诱饵蛋白原发性抗体抗诱饵蛋白2：精品PPT|借鉴参考202.Competitive elisa same epitopeCoat with bait prIncubate with primary antibody anti bait pr and various concentration prey protein（竞争同一表位。外套与诱饵蛋白培养初级抗体抗诱饵蛋白及不同浓度的猎物蛋白）精品PPT|借鉴参考21精品P

10、PT|借鉴参考224.操作方法4.1包被特异性抗原：固体抗原(如蛋白质)用包被液稀释至100|J g/ml,每凹孔加100JJ L,加盖置4过夜(37 2h),次日倾去凹孔内液体，用滴管取洗涤液在每孔中加34滴，静置3min后倾去，重复3次，将反 应板扣放在滤纸上，以除净液体。4.2 封闭：每孔中加入200 400|j L封闭液，加盖或用封口膜封板，置 37。恒温箱6 0min,倾去孔内液体，按上法洗涤3次。精品PPT|借鉴参考234.3 加待测血清（内含抗体）、阴性血清（无抗体）及稀释液（PBS/Tween）:待测血清按倍比法用稀释液稀释（1：100、1：200等），阴性血清也稀释 成1:1

11、00,取不同稀释度的待测血清，阴性血清及稀释液（PBS/Tween）各100|J L加至相应的凹孔中，加盖或封板，置37恒温箱lh,使抗体 与固相抗原进行特异性结合，反复洗涤3次。精品PPT|借鉴参考2412345678PBS/Tween1:100阴性血清1:1,000、1:5,0001:10,000阳性血清1:20,0001:50,0001:100,000 J精品PPT|借鉴参考254.4 加酶标抗体:按说明书要求用稀释液稀释HRP-抗体（抗抗体），每 孔加lOOp L,封板后置37温育lh,按上法至少洗涤5次，最后 用蒸偏水洗涤2次，扣在滤纸上吸干水分。4.5 显色：每孔加入OPD应用液1

12、00uL、反应板置室温暗处530min。当显示橙色时应及时终止反应。4.6 终止反应:每孔加入50H L 2mol/L H2so甘 稳定35min即可比 色测定。精品PPT|借鉴参考264.7 检测：用酶联免疫测定仪，以PBS/Tween孔为对照、测波长为 490nm时各孔光吸收(A)。1.计算阳性血清与阴性血清A值之比(Positive/negative,P/N),当P/NN2.1时为阳性，P/N2.1而三1.5为可疑，P/NG.5为阴 性。用目测法则以较阴性对照深色的最高稀释度作为抗体效价。2.用“十”“一”表示，超过规定吸收值(0.2-0.4)的标本均 属阳性。精品PPT|借鉴参考27注

13、意事项(1)聚苯乙烯微量反应板应选择高质量、非特异性吸附小的产品。包 被物应具有较高的纯度，其浓度一般在1100|J g之间，在偏碱条件下易吸 附于反应板的凹孔中，4放置过夜较理想，若暂时不用，可加入终浓度为 0.02%NaN3,4贮存，也可倾去包被液，干燥后置硅胶干燥器中，室温存 放3个月以上不影响测定效果。(2)反应各步均应充分洗涤，以除去残留物，减少非特异性吸附。为使 结果重复应固定洗涤次数及放置时间，切忌相互污染。(3)为使显色反应便于比较，显色后置室温暗处的时间应一致，终止反 应35min后应立即比色。必要时可设阳性对照，以固定显色及终止时间。(4)待测抗体或抗原与酶标抗体应具有相同

14、的免疫特异性，否则无法结 合。精品PPT|借鉴参考28百动酶标仪(Elx800UV)使用程序1 开机,进彳亍System self-test.2 按“DEFINE”键，进入“SEL ECT ASSAY NUMBER”，用“NUMERIC”或“OPTION”键输入测试号(注：assay 01为quick read,最大测试号为55)；按“ENTER”键修改 测试的“NAME”；再按“ENTER”键进入下列菜单：按“METHOD”键选择测试的波长类型(Single或Dual)、波长大小(340、405、4 5 0.490或6 3 0nm)、微孔板类型(强孔、48孔或24孔)。按“MAP”键选择阅读

15、方式(Auto或式nual)、阅读方向(Down或Across)、重复方向(Down或Across)、阅读起始位置(输入编号)、空白Map(Air、Full、Const Column P_Down P-Across)。精品PPT|借鉴参考293按“READ”键，酶标板推进入仪器，开始读数并 计数，打印机输出数据。4按“MAIN MENU”键回到主菜单，关闭电源。精品PPT|借鉴参考30酶标板的清洗：采用EL x5 0TM型微孔板洗板机，注射泵驱动的液体输送，条状单排清洗或全板清洗精品PPT|借鉴参考31Western Blotting or immunoblotting a specific

16、primary antibody1979,Towbin1975,Southern,Southern blotting1977,Alwine,Northern blotting1979,Towbin,Western Blotting1982,Reihart,Eastern blotting，双向蛋白质印记精品PPT|借鉴参考32ELECTROTRANSFER(b)ANTIBODY DETECTION%DEVELOPMENT/如/Add/4r/substrate/精品PPT|借鉴参考33转移图11.1 蛋白质印迹通常所需的四个步骤精品PPT|借鉴参考34精品PPT|借鉴参考Transfer pro

17、teins-Add radiolabeled specific antibody.Wash to remove unbound antibody.-Overlay photographic film.Expose and develop.-K Protein band detected by specific antibodySDS-polyacrylamide gelPolymer sheetAutoradiogramWestern blotting:Antibodies can be used to detect specific proteins精品PPT|借鉴参考36Alternate

18、 detection method-Secondary antibodies精品PPT|借鉴参考37Memebrane:吸附生命大分子的固体材料NC,nitrocellulose 硝酸纤维素月莫0.4 5 um结合率：80 ug Pr/cm2便宜，可简单快速封闭非特异性抗体的结合NDM,nylon-densed membrane 尼龙膜结合率：480 ug Pr/cm2DBM,diazobenzyloxymethyl 重氮半氧甲基膜精品PPT|借鉴参考38图 11.4(A)垂直槽式电泳印迹；水平耨册懿蕤39湿法转移蛋白质：将gel和membrane夹在blotter paper中，浸在转移装置

19、的buffer中，通电4 5 min 或over night可完成。Transfer Buffer(500 ml,pH 8.3)glycine 1.450 g(39 mM)Tris base 2.900 g(48 mM)SDS 0.185 g(0.037%)精品PPT|借鉴参考40Using the Semi-Dry Transfer Unit1.Remove the stacking gel from the gel.去除堆积凝胶的凝胶。2.Cut pieces of blotter paper to the size of the gel.note:the blotter paper(an

20、d the membrane)not be larger than the gel.Larger pieces may make contact around the gel,and allow the current an alternate route,thereby making transfer inefficient.裁片的记事簿纸张的大小的凝胶。注：本记事簿纸(和膜)不大于凝胶。大块的可能使接触周围的凝胶，并允许目前的替 代路线，从而使传输效率。3.Wearing gloves rinsed of powder,cut a piece of membrane to the size

21、 of the gel.Mark the lower righthand corner to allow for orientation.Pre-wet the membrane in transfer buffer for 2 to 5 minutes.戴手套清洗粉，剪下一块膜大小的凝胶。标记右下角以便方向。湿膜转移缓冲液为2到5 分钟。精品PPT|借鉴参考414.sandwichblotter paper-membrane-gel-blotter papermake sure no air bubbles are trappedThe membrane must therefore be

22、positioned correctly the first time.Do not try to adjust.三明治吸墨纸纸-膜凝胶-记事簿纸确保没有气泡被困膜因此必须正确定位第一时间。不要试图调整。精品PPT|借鉴参考425.Hold the cover level and slide it gently down onto the stack.持有的封面和滑动它轻轻地放到堆栈6.weigh down the lid in order to ensure even contact with the stack.权衡下来的盖子，以确保即使接触堆栈。7.Connect the unit to

23、 a suitable power supply.Turn the power supply to zero before turning on.Turn on the power supply and set to approximately 0.8 mA/cm2 of gel.Larger gels must be limited to 0.8 mA/cm2 to avoid excessive heatbuild up.o连接到一个合适的电源供应装置。打开电源供应零之前打开。打开电源并设定约0.8毫安/厘米2凝胶。较大的凝胶必须被限制在0.8毫安/厘米2避免过度生热。精品PPT|借鉴参考

24、438 mm x 7 mm mini-gels at 100 mA,Molecular WeightTransfer Period80,00045 minutes精品PPT|借鉴参考44精品PPT 收集整理来源网络实用可编辑Problem：蛋白质转移效率低？（转移后对凝胶或膜染色进行观察）1.transfer buffer中力口入20%甲醇或加入终浓度为0.1%SDS,可增加膜结合蛋白质的能力；2.使用小孔径的硝酸纤维素膜3.转移后的膜在含0.2%戊二醛的TBS中浸泡45min。精品PPT|借鉴参考46丽春红s,染色后可继续进行免疫检测 灵敏度低膜总蛋白质染色J 氨基黑印度墨水生物素增强胶体金

25、1-2泳道进行膜总蛋白质染色检测转移效率精品PPT|借鉴参考47免疫检测灵敏度 辣根过氧化物酶：1020pg碱性磷酸酶：1050pg免疫金：125pg1251:50100pg放射自显影术：将含放射性同位素置X感光胶片上 感光，随后经显影，定影，即可呈现出斑点或谱带精品PPT|借鉴参考483PFig.6.1 A.General color detection system.1.2.3.Antigen-specific primary antibody binds to protein of Interest EnzymG-conjugatGd secondary antibody or bind

26、ing protein binds to primary antibodyEnzyme(E)converts added substrate(S)to colored product(P),which precipitates onto the ma斗郦$行案考4923Ag.6.1 B.ImmunStar chem iluminescent detection kit.1.Akalins phosphatase(APi-ccnjiated secondary antibody binds to priTiary antibody2.ChaniluninoscGnt substrate reac

27、ts v)ith AP to omit Ight3.Film or hcS|zhc r screen is50Fig.6.1 C,Amplified AP Immun-Blot kit.1.Biotinylated secondary antibody binds to primary antibody2.CQTiplex of streptavidin and biotinylated AP binds to biotin of secondary antibody3.Multiple AP molecules are now available to convert substrate(S)to coloredProduct(P),which precipitate nppT|借鉴参考51