牛场牛病毒性腹泻病毒BVDV基因分型与防制(T-NAIA 0262—2023).pdf

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1、 ICSICS 65.020.30ICS 65.020.30CCS A 031CCS A 031团团 体体 标标 准准 T/NAIA 0262-2023牛场牛病毒性腹泻病毒（BVDV）基因分型与防制Technical regulations for genotyping and prevention of bovine viral diarrhea virus(BVDV)in cattle farms(征求意见稿)2023-12-18 发布2023-12-31 实施 宁夏化学分析测试协会宁夏化学分析测试协会 发发 布布 发布T/NAIAT/NAIA 0262-2023 前 言 本文件按照 GB

2、/T 1.1-2020 标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。本文件起草单位：宁夏农林科学院动物科学研究所、宁夏大学、宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心、西宁市动物疫病预防控制中心、青海省畜牧兽医科学院、中国农业科学院兰州兽医研究所。本文件主要起草人：王建东、高闪电、于有利、郭亚男、梁小军、王晓亮、许立华、李知新、宣小龙、施安、康晓冬、高海慧、张久盘、孟茹、李志、付永、郭慧琛、邵军军、刘伟、常惠芸、周广青。T/NAIA 0262-2023 牛场牛病毒性腹泻病毒（BVDV）基因分型与防制 1 范围 本文件规定了牛场牛病毒性腹泻

3、病毒（BVDV）RT-PCR 基因分型与防制的术语和定义、诊断、预防和净化。本文件适用于牛场中奶牛、肉牛等牛科动物的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）RT-PCR 基因分型与防制。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 农业部农医发201725号 病死及病害动物无害化处理技术规范 3 术语和定义

4、下列术语和定义适用于本文件。3.1 牛病毒性腹泻病 Bovine Viral Diarrhea Virus 牛病毒性腹泻病/黏膜病是由牛病毒性腹泻病毒引发牛的一种传染病，临床上以发热、腹泻、呼吸道症状、出血综合征、黏膜糜烂、白细胞减少、怀孕母牛流产、产畸型胎为主要特征。3.2 RT-PCR基因分型 RT-PCR genotyping 即利用分子生物学方法，对其基因进行分型的技术。4 流行病学 各种年龄的牛都易感染、以幼龄牛易感性最高。传染来源主要是病畜。病牛的分泌物、排泄物、血液和脾脏等都含有病毒，以直接接触或间接接触方式传播。牛病毒性腹泻病毒可以穿过胎盘感染，特别是怀孕早期。牛病毒性腹泻黏膜

5、病毒血清抗体阴性的母牛一旦感染，常常通过胎盘使胎儿产T/NAIA 0262-2023 生免疫抑制，引起持续性病毒血症，如果小牛正常产出，病毒血症能持续地带入成年期，这种牛体内始终带毒，是牛群中最危险的传染源。5 RT-PCR基因分型 5.1 样品采集 用无菌注射器直接采集血液或者抗凝血至灭菌离心管，或使用兽用采血针、真空无菌采血管、真空无菌抗凝管采血管，采集全血或抗凝全血，编号备用。5.2 样品处理 5.2.1 血清处理 使用无抗凝剂采血器，采血后采血管倾斜于2537静置30 min45 min，待血液完全凝固，转速8000 rpm离心10 min或4000 rpm离心30 min，用移液枪把

6、血清移入储存管备用。5.2.2 全血处理 使用抗凝枸橼酸葡萄糖（ACD）为抗凝剂。利用灭菌离心管收集血液时，加入1/6体积的ACD抗凝剂，充分混匀；利用商品化EDTA抗凝采血管收集血液时，直接收集血液并混匀即可。5.2.3 RNA提取 在样本制备区，根据待检样品数量取n个无RNAse离心管，编号。每管中加入600 L Trizol，分别加入100 L待检血清或抗凝血，充分混匀后加入200 L氯仿，充分颠倒混匀；于4、12000 g离心15 min，小心吸取上清至一新的无RNAse离心管中，加入0.5 mL异丙醇，轻轻混匀，4、12000 g离心10 min；弃上清，加入1mL DEPC水配制的

7、冰冷75%乙醇充分洗涤沉淀；4、12000 g离心5 min，弃上清，12000 g离心10 s，吸去残存的液体，室温风干3 min，加入适量（2025 L）DEPC水溶解，直接用于检测或-80保存。5.3 基因分型 5.3.1 套式RT-PCR 参考文献中的引物，套式PCR引物序列，PCR反应体系及PCR反应程序见表1-3。表1 巢氏PCR引物序列 引物名称 引物序列（5-3）扩增片段（bp）PanBVDVpcrF CTCTGCTGTACATGGCACATG PanBVDVpcrR TTCTCACTNGCRTCCATCAT 1005 BVDV-1 npcrF TTTCAAGCTGCTCHGA

8、YAC 505 BVDV-2 npcrF ATCCTGACCAATGCTAGGTCC 833 BVDV-3 npcrF TCCTGTGGCAACCGGTAGGT 211 T/NAIA 0262-2023 表2 PCR反应体系 体系成分 用量（L）2 X Step Buffer 12.5 1 X Step Enzyme Mix 1 上游引物 1 下游引物 1 DEPC水 7.5 RNA模版 2 合计 25 表3 PCR反应程序 反应温度 反应时间 循环次数 第一轮巢氏PCR 50 30 min 1 94 2 min 1 94 30 s 55 30 s 72 1 min 35 72 10 min

9、1 4 1 第二轮巢氏PCR 98C 10 s 55C 30 s 72C 1 min 30 72 10 min 1 4 1 5.3.2 荧光定量 RT-PCR 参考文献中的引物，在一反应管中同时检测BVDV-1和BVDV-2，在另一反应管中对BVDV-3单独进行检测。T/NAIA 0262-2023 5.3.2.1 BVDV-1 和 BVDV-2 分型 检测BVDV-1和BVDV-2的引物为PestiF：5-CTAGCCATGCCCTTAGTAG-3，PestiR：5-CGTCGAACCAGTGACGACT-3。探针为BVDV-1P：FAM-TAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGAT

10、GGCT-BHQ，BVDV-2P：TxR-TAGCGGTAGCAGTGAGTTCGTTGGATGGCC-BHQ。根据表4反应体系和表5反应程序进行RT-PCR扩增，扩增结束后根据扩增曲线判定样品中BVDV RNA的存在与否以及BVDV基因型（FAM通道的扩增曲线表示BVDV-1阳性，TxR（ROX）通道扩增曲线表示BVDV-2阳性）。表4 BVDV-1型和BVDV-2型RT-PCR 反应体系 体系成分 用量（L）2 X One Step RT-PCR Buffer 12.5 Ex Taq 0.5 反转录酶 0.5 PestiF/BVDV-1P 0.5 PestiR/BVDV-2P 0.5 RO

11、X Reference Dye or Dye 0.5 DEPC水 8.5 RNA 1 合计 25 表5 BVDV-1型和BVDV-2型RT-PCR 反应程序 反应温度 反应时间 循环次数 42 5 min 1 95 10 s 1 95 5 s 60 30 s 40 5.3.2.2 BVDV-3 分型 检测BVDV-3的引物为 T34F：5-GACTAGTGGCAGTGAGC-3 T220R：5-GAGGCATTCCTTGATGCGTC-3 T/NAIA 0262-2023 BVDV-3P:5-FAM-ACTCGGGGCTTCGGTGATCCAGGG-BHQ-3。根据表6反应体系和表5反应程序进

12、行RT-PCR扩增，在扩增结束后根据扩增曲线判定样品中BVDV-3 RNA存在与否（FAM通道扩增曲线表示BVDV-3阳性）。表6 BVDV-3型RT-PCR反应体系 体系成分 用量（L）2 X One Step RT-PCR Buffer 12.5 Ex Taq 0.5 反转录酶 0.5 T34F（10 M）0.5 T220R（10 M）0.5 BVDV-3P（10 M）0.25 ROX Reference Dye or Dye 0.5 DEPC水 8.5 RNA 1 合计 25 5.3.2.3 BVDV系统发育分析 基于BVDV N基因进行系统发育分析，显示从宁夏地区奶牛场分离鉴定的BVD

13、V亚型主要包括BVDV-1a（YC2、QTX1）、BVDV-1d（QTX5）、BVDV-1m（YC3、QTX4、QTX6、QTX7、QTX9）、BVDV-1q（QTX8）以及BVDV-2型，系统发育树见附录C.1。5.4 BVDV防治方法 5.4.1 加强环境卫生管理 要定期清洁圈舍与周围环境，选用无毒无害的消毒剂进行消毒，以防消毒剂在牛体内残留，这与国家中华人民共和国兽药典 规定相符合。另外，饮水要满足饮用水标准，没有污染的清洁水，对牛舍内垃圾粪便清理要及时。对患病牛牛舍做好彻底消毒，病死动物与流产胎儿要及时处理，以防疾病蔓延。5.4.2 做好动物免疫接种 免疫接种利于预防牛病毒性腹泻病毒感

14、染。牛610个月大时，从初乳中获得的母源抗体水平变弱，此时接种减毒与灭活疫苗利于有效预防牛患病毒性腹泻病毒。5.4.3 做好净化 T/NAIA 0262-2023 由于前期标准制定者已明确我区目前流行BVDV-1a、BVDV-1d、BVDV-1m、BVDV-1q以及BVDV-2型，并且BVDV-1a、BVDV-1m和BVDV-2毒株在宁夏地区是首次分离鉴定的，要每年定期检测，做到第一次抗原阳性，时间间隔60天后复测为阳性的牛要进行淘汰。5.4.4 重视饲养管理 对牛群加强饲养管理，为牛提供充足且均衡的营养物质，全面提高牛只免疫力，降低牛病毒性疾病发病率。5.4.5 合理选用治疗方法 当前，BV

15、DV感染还没有特效治疗方法。生产过程中常以对症治疗方法控制病情，其中收敛剂与补液疗法能够缩短病程，对患病牛有很好的恢复效果。牛患病后，及时选用抗生素预防继发性细菌感染，造成大面积死亡。T/NAIA 0262-2023 附附 录录 A A（资料性）溶液配制 以下所用试剂均为分析纯。A.1 抗凝枸橼酸葡萄糖（ACD）为抗凝剂 称取柠檬酸0.48 g、柠檬酸钠1.32 g、葡萄糖1.47 g溶于100 mL去离子水中，121高压灭菌30 min，冷却后分装备用。A.2 DEPC 水 在通风橱中，将 DEPC 加入去离子水（符合 GB/T 6682）中至终浓度为 0.1%，充分作用 12 h。121高

16、压灭菌 30 min，冷却后分装备用。A.3 50TAE 贮存液 Tris 碱 242.0 g 冰醋酸 57.1 mL EDTA（0.5 mol/L，pH 8.0）100.0 mL 加蒸馏水定容至 1000 mL，在 1.034105 Pa 压强下蒸汽灭菌 20 min，使用时用蒸馏水稀释成1TAE。A.4 1.0%琼脂糖凝胶 琼脂糖 1 g，加 1TAE 定容至 100 mL，在微波炉中加热融化、混匀，冷却至 55，加入适合浓度的核酸染料，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳，凝固后移去样品梳，当天使用。T/NAIA 0262-2023 附附 录录 B B（资料性）BVDV 分型 RT-PCR 结果电泳示意图及荧光定量 RT-PCR 扩增曲线示意图 BVDV 分型 RT-PCR 结果电泳图见图 B.1，BVDV 分型荧光定量 RT-PCR 扩增曲线示意图见 B.2。图B.1 BVDV套式RT-PCR结果 图 B.2 BVDV 分型荧光定量 RT-PCR 扩增曲线示意图 A.FAM 通道扩增曲线（BVDV-1）；B.Txd（ROX）通道扩增曲线（BVDV-2）；C.FAM 通道扩增曲线（BVDV-3）T/NAIA 0262-2023 附附 录录 C C（资料性）BVDV 系统发育分析进化树 图 C.1 BVDV N 基因系统发育进化树