DB32_T 4234-2022 水产品中副溶血性弧菌检测 实时荧光重组酶介导链替换核酸扩增法.docx

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1、ICS67.120.30CCSB50DB32江苏省地方标准DB32/T42342022水产品中副溶血性弧菌检测实时荧光重组酶介导链替换核酸扩增法DetectionmethodforVibrioparahaemolyticusinaquaticbyreal-timefluorescencerecombinase-aidamplification2022-03-18发布2022-04-18实施江苏省市场监督管理局发布DB32/T42342022前言本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由南京农业大学提出并归口。本文件起草单位：南京农业大

2、学、江苏省淡水水产研究所、上海海关动植物与食品检测中心、南京市产品质量监督检验研究院、广东省科学院微生物研究所、杭州傲敏生物科技有限公司。本文件主要起草人：薛峰、朱晓华、申进玲、蒋原、张驰、薛亮、汤芳、戴建君、吴清平、梁莹、任建鸾、赵凯颖、张正荣。IDB32/T42342022水产品中副溶血性弧菌检测实时荧光重组酶介导链替换核酸扩增法1范围本文件规定了水产品中副溶血性弧菌检测实时荧光重组酶介导链替换核酸扩增（recombinase-aidAmplification，RAA）法的试剂材料、仪器设备、检测程序、操作步骤、结果判定和报告、检出限及防止污染措施。本文件适用于水产品中副溶血性弧菌检测。本

3、文件适用于水产品副溶血性弧菌的快检初筛。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.7食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1重组酶介导链替换核酸扩增recombinase-aidAmplification,RAA一种利用重组酶、单链结合蛋白

4、和DNA聚合酶代替了传统PCR的热循环解链过程，在恒温下（一般为3742），进行核酸扩增的技术。4原理RAA法利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶代替了传统PCR的热循环解链过程。根据副溶血性弧菌的特异性基因序列，结合荧光探针检测法对水产养殖及水体中副溶血性弧菌进行判定。经实时荧光RAA扩增后，根据样品在30min内是否出现扩增曲线，可判定样品结果。5试剂材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。试剂材料有：1致病菌种类引物探针名称序列（5-3）目的基因副溶血性弧菌上游引物tlh-FTTAGATTTGGCGAACGAG

5、AACGCAGACATTACGtlh下游引物tlh-RAGATGTTGCCTGTATCAGACAAGCTGTCACCGAexo探针tlh-PTTACGTTCTTCGCCGCTGACAATCGCTTCFAM-dTTHFABHQ-dTACAACCACACGAT-SpacerC3DB32/T42342022a)探针和引物根据副溶血性弧菌的特异性基因序列设计探针和引物。表1副溶血性弧菌探针和引物b)试剂11）RAA反应缓冲液：20%PEG，280mmol/L醋酸镁（MgAc2）。也可采用等效的商品试剂盒。2）冻干酶制剂：mmol/LdNTP、90ng/L单链结合蛋白、120ng/LrecA重组酶、30

6、ng/LBsuDNA聚合酶、30ng/LExoIII、100mmol/LTricine、20%PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/L肌酸激酶，保存于200L反应管中。也可采用等效的商品试剂盒。3）阳性对照：副溶血性弧菌标准菌株ATCC17802，或含目的片段的DNA；阴性对照：非副溶血性弧菌标准菌株，或不含目的片段的DNA；空白对照：无菌水。6仪器和设备包括以下几种：a)荧光检测仪：带有恒温（391）扩增功能的荧光检测仪。b)微量移液器：0.1L2.5L，1L10L，2L20L，10L100L，20L200L，100L1000L，并配备与移液器匹配的吸头。c)高速台式离心机：离心力1

7、2000g。d)恒温水浴锅或金属浴：1001。e)天平：感量0.01g。7检测程序副溶血性弧菌实时荧光RAA检测程序见图。2DB32/T42342022图1副溶血性弧菌实时荧光RAA检测程序8操作步骤8.1样品处理和增菌水产品参照GB4789.7执行。8.2细菌模板DNA的制备8.2.1试剂盒法使用商品化DNA提取试剂盒，吸取适量获得的增菌液，按其说明提取制备模板DNA。8.2.2煮沸法8.2.2.1吸取10.1获得的增菌液1mL菌液加入1.5mL离心管中，10000g离心1min，弃上清。8.2.2.2加入1mL无菌水，充分悬浮沉淀，10000g离心1min，弃上清；8.2.2.3加入100

8、L无菌水混匀后沸水浴（或95金属浴）10min，置冰上冷却；8.2.2.410000g离心1min，上清液即为模板DNA。8.3实时荧光RAA扩增8.3.1实时荧光RAA反应体系副溶血性弧菌RAA检测，50L反应体系见表2。3组分名称体积（L）20%PEG12.5Ltlh-F(10mol/L)2.1Ltlh-R(10mol/L)2.1Ltlh-P(10mol/L)0.6LDNA模板（20ng/L）4.0LddH2O26.2LMgAc2（280mmol/L）2.5L总量50L注：（1）DNA模板量可根据不同样品，具体情况进行调整。（2）将除MgAc2和模板DNA以外的所有成分涡旋混匀，分装混合液

9、至含有冻干酶制剂的200L反应管中，轻柔手弹使冻干粉充分重溶均匀，短暂离心，打开反应单元，向每个反应单元的管盖上加入2.5LMgAc2，然后向各反应单元加入适量模板DNA（100ng），充分混匀并离心。（3）可使用等效的商品化荧光RAA试剂盒按照其说明书进行检测。DB32/T42342022表2副溶血性弧菌荧光RAA反应体系8.4反应条件将反应管置于荧光检测仪中，39恒温，30min。在反应过程中实时监测荧光信号。8.5实验对照检测过程中分别设阴性对照、空白对照和阳性对照。空白对照以无菌水替代模板DNA；阴性对照以非副溶血性弧菌标准菌株DNA作为模板DNA；阳性对照以副溶血性弧菌标准菌株ATC

10、C17802DNA作为模板DNA。9结果判定和报告9.1质控标准空白对照在30min内无扩增曲线；阴性对照在30min内无扩增曲线；阳性对照在10min内出现典型的扩增曲线。以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。9.2结果判定样品在30min内无扩增曲线，可判定样品结果为阴性，可直接报告未检出副溶血性弧菌；样品在30min内出现扩增曲线，则样品结果为副溶血性弧菌初筛阳性。对于初筛阳性结果，应参见GB4789.7进行确证后报告结果。4DB32/T4234202210检出限本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为102CFU/mL。11生物安全措施按照GB19489规定执行。12防污染措施防止污染措施应按照GB/T27403的规定执行。_5