DB43∕T 959.2-2023 异种移植用无指定病原体（DesignatedPathogen Free, DPF）医用供体猪 第2部分：微生物、寄生虫学监测(湖南省).pdf

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1、异种移植用无指定病原体（DesignatedPathogen Free,DPF）医用供体猪第2部分：微生物、寄生虫学等级与监测DB43/T 952023 9.243湖南省地方标准发 布湖南省市场监督管理局2023-11发布-092024-02实施-09代替DB43/T 95.220149Medical grade DPF donor pig for xenotransplantationPart 2:mircrobiological parasitological standards and surveillanceICSCCS 70.080 B 44DB43/T 959.22023 I 目

2、次 前言 引言 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 微生物学等级 3 5 检测要求 3 6 检测程序 3 7 检测方法 3 8 检测规则 5 9 结果判定 6 10 判定结论 6 11 样本保存 6 附录 A（规范性）牛分枝杆菌 PCR 检测方法 7 附录 B（规范性）细胞内鸟型分枝杆菌 PCR 检测方法 8 附录 C（规范性）新型隐球菌 DNA 实时荧光定量 PCR 检测 9 附录 D（规范性）抗荚膜组织胞浆菌抗体 ELISA 检测方法 10 附录 E（规范性）猪兰氏类圆线虫病镜检法诊断 11 附录 F（规范性）布氏姜片吸虫镜检法诊断 12 附录 G（规范性）猪脑心

3、肌炎病毒间接 ELISA 检测 13 附录 H（规范性）人流感病毒多重 PCR 检测 14 附录 I（规范性）猪巨细胞病毒 FQ-PCR 检测 15 附录 J（规范性）疱疹病毒核酸检测 17 附录 K（规范性）猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADSCoV）RTPCR 检测 19 附录 L（规范性）猪呼吸道冠状病毒（PRCV）巢式 PCR 检测 20 附录 M（规范性）猪血凝性脑脊髓炎病毒检测 21 附录 N（规范性）猪内源性逆转录病毒 C（PERV-C）PCR 检测 24 附录 O（规范性）猪嗜淋巴细胞疱疹病毒 3 型 TaqMan 荧光定量 PCR 检测 25 附录 P（规范性）新型冠状病毒肺炎

4、防控方案（第七版）26 DB43/T 959.22023 II DB43/T 959.22023 III 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件是DB43/T 959异种移植用无指定病原体（Designated Pathogen Free,DPF）医用供体猪的第2部分。DB43/T 959已发布了以下部分：第1部分：遗传质量控制；第2部分：微生物、寄生虫学等级与监测；第3部分：配合饲料；第4部分：病理学诊断规范；第5部分：环境与设施。本文件替代DB43/T 959.22014异种移植用无指定病原体（Designat

5、ed Pathogen Free,DPF）医用供体猪 第2部分：微生物学等级与监测，与DB43/T 959.22014相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：a）将本文件“标题”由“异种移植用无指定病原体（Designated Pathogen Free,DPF）医用供体猪 第 2 部分：微生物学监测”更改为“异种移植用无指定病原体（Designated Pathogen Free,DPF）医用供体猪 第 2 部分：微生物、寄生虫学等级与监测”；b）增加了“引言”一章；c）增加猪圆环病毒1 型、猪冠状病毒、猪内源性逆转录病毒、猪淋巴性疱疹病毒、戊型肝炎病毒、新型冠状病毒的检测及检测方

6、法（见 7，2014 版的 7）；d）更改了“检测频率”（见 8.1，2014 版的 8.1）；e）更改了“表 2 抽样数量”（见 8.2.2，2014 版的 8.2.2）。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖南省科学技术厅提出并归口。本文件起草单位：中南大学湘雅三医院，湖南赛诺生物科技股份有限公司。本文件主要起草人：王维、罗敏华、李桑、蔡亮、胡鹏志、马小倩、徐畅、王佳、石兴勇。本文件及其所替代文件的历次版本发布情况为：2014年首次发布为DB43/T 959.22014；本次为第一次修订。DB43/T 959.22023 IV DB43/T 9

7、59.22023 V 引 言 异种移植用无指定病原体（Designated Pathogen Free,DPF）医用供体猪标准化能更好的促进异种细胞、组织和器官移植相关产业发展，有利于湖南省政府部门行政审批和监管工作的实施。为了保证异种移植用无指定病原体医用供体猪研发、生产和应用的稳定、高效进行，对其进行标准化管理已成为首要任务。在这方面，湖南省已建立了异种移植用无指定病原体医用供体猪基础性地方标准体系。在该体系中，DB43/T 959异种移植用无指定病原体（Designated Pathogen Free,DPF）医用供体猪是指导湖南省异种移植用无指定病原体医用供体猪培育的基础性和通用性的标

8、准。DB43/T 959旨在确立普遍适用于标准化异种移植用无指定病原体医用供体猪遗传质量控制、微生物检测、饲料、病理学检测、环境设施的准则，拟由五个部分构成。第1部分：遗传质量控制。目的在于维持异种移植用无指定病原体医用供体猪遗传质量稳定性。第2部分：微生物、寄生虫学等级与监测。目的在于保证异种移植用无指定病原体医用供体猪生物安全性。第3部分：配合饲料。目的在于保障异种移植用无指定病原体医用供体猪饲料的安全和营养。第4部分：病理学诊断规范。目的在于标准化异种移植用无指定病原体医用供体猪病理学检测内容和方法。第5部分：环境与设施。目的在于标准化异种移植用无指定病原体医用供体猪环境条件控制和设施建

9、设。异种移植用无指定病原体医用供体猪微生物、寄生虫学监测是决定异种移植成功与否的关键性因素之一。为了做好这项工作，湖南省在2014年发布了有关异种移植用无指定病原体医用供体猪微生物、寄生虫学监测的地方标准。DB43/T 959.2发布实施已九年，这期间国际异种移植领域取得了突破性成果，异种移植用无指定病原体医用供体猪微生物、寄生虫学监测受到越来越广泛的重视，与微生物、寄生虫监测有关的理论研究和实践都发生了变化。首先，世界卫生组织于2018年在湖南省长沙市召开了“第三届全球异种移植临床研究规范研讨会”，对异种移植用无指定病原体医用供体猪微生物、寄生虫检测项目和方法进行深入探讨。其次，在DB43/

10、T 959.2的广泛应用以及实践期间，非洲猪瘟病毒、新型冠状病毒等席卷中国，对异种移植用无指定病原体医用供体猪微生物、寄生虫学监测项目和内容产生了新的需求与建议。鉴于此，确有必要修订完善DB43/T 959.2，以不断监测国内外猪流行性疾病的新变化，确保高质量、高安全性异种移植用无指定病原体医用供体猪的稳定发展。对异种移植用无指定病原体医用供体猪微生物、寄生虫学监测进行标准化，首先需要排除已知和潜在的引起异种移植跨种系感染风险微生物；其次是应根据近几年猪流行性疾病调查，及时更新病原体检测内容与方法，以保证异种移植用无指定病原体医用供体猪稳定发展。本次对 DB43/T 959.2 的修订，重点考

11、虑了异种移植跨种系感染微生物和最新猪流行性疾病病原体检测，通过排除异种移植用无指定病原体医用供体猪微生物、寄生虫感染风险，保障异种移植用无指定病原体医用供体猪安全性，进一步提高异种移植的成功率，从而全面提升我国异种移植发展水平。DB43/T 959.22023 1 异种移植用无指定病原体（Designated Pathogen Free,DPF）医用供体猪 第 2 部分：微生物、寄生虫学等级与监测 1 范围 本文件规定了异种移植用无指定病原体（Designed Pathogen Free,DPF）医用供体猪微生物学等级分类、检测要求、检测程序、检测方法、检测规则、结果判定、判定结论、样本保存等

12、。本文件适用于异种移植用 DPF 医用供体猪微生物学等级监测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 14926.1 实验动物 沙门菌检验方法 GB/T 14926.4 实验动物 皮肤病原真菌检测方法 GB/T 14926.8 实验动物 支原体检测方法 GB/T 14926.27 实验动物 小鼠腺病毒检验方法 GB/T 14926.30 实验动物 兔轮状病毒检测方法 GB/T 14926.46 实验动物 钩端螺旋体检测方法

13、 GB/T 14926.47 实验动物 志贺菌检测方法 GB/T 14926.48 实验动物 结合分枝杆菌检测方法 GB/T 14926.56 实验动物 狂犬病病毒检测方法 GB/T 16551 猪瘟诊断技术 GB 17013 包虫病诊断标准及处理原则 GB/T 18090 猪繁殖与呼吸综合征诊断方法 GB/T 18448.1 实验动物 体外寄生虫检测方法 GB/T 18448.2 实验动物 弓形虫检测方法 GB/T 18448.6 实验动物 蠕虫检测方法 GB/T 18648 非洲猪瘟诊断技术 GB/T 18638 流行性乙型脑炎诊断技术 GB/T 18641 伪狂犬病诊断技术 GB/T 1

14、8646 动物布鲁氏菌病诊断技术 GB/T 18647 动物球虫病诊断技术 GB/T 18935 口蹄疫诊断技术 GB/T 19200 猪水泡病诊断技术 GB/T 19915.1 猪链球菌 2 型平板和试管凝集试验操作规程 DB43/T 959.22023 2 GB/T 19915.2 猪链球菌 2 型分离鉴定操作规程 GB/T 19915.3 猪链球菌 2 型 PCR 定型检测技术 GB/T 19915.7 猪链球菌 2 型荧光 PCR 检测方法 GB/T 21674 猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法 GB/T 22333 日本乙型脑炎病毒反转录聚合酶链反应试验方法 GB/T 22915 口蹄

15、疫病毒荧光 RT-PCR 检测方法 GB/T 22917 猪水泡病病毒荧光 RT-PCR 检测方法 GB/T 27517 鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合 RT-PCR 方法 GB/T 27536 猪流感病毒分离与鉴定方法 GB/T 21674 猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法 GB/T 34757 猪流行性腹泻 病毒 RT-PCR 检测方法 GB/T 35912 猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光 RT-PCR 检测方法 GB/T 36871 猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒多重 RT-PCR 检测方法 NY/T 537 猪传染性胸膜肺炎诊断技术 NY/T 541 兽医

16、诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T 545 猪痢疾诊断技术 NY/T 546 猪传染性萎缩性鼻炎诊断技术 NY/T 548 猪传染性胃肠炎诊断技术 NY/T 550 动物和动物产品沙门氏菌检测方法 NY/T 564 猪巴氏杆菌病诊断技术 NY/T 679 猪繁殖和呼吸综合症免疫酶试验方法 SN/T 0420 出口猪肉旋毛虫检验方法 磁力搅拌集样消化法 SN/T 1379.1 猪瘟单克隆抗体酶联免疫吸附试验 SN/T 1396 弓形虫病检疫技术规范 SN/T 1446.1 猪传染性胃肠炎阻断酶联免疫吸附试验 SN/T 1699 猪流行性腹泻检疫技术规范 SN/T 1919 猪细小病毒病检

17、疫技术规范 SN/T 2708 猪圆环病毒病检疫技术规范 SN/T 3499 新孢子虫病检疫技术规范 SN/T 4235 猪戊型肝炎检疫技术规范 SN/T 5124 猪 Delta 冠状病毒检疫技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。异种移植用 DPF 医用供体猪 medical grade DPF donor pig for xenotransplantation 经人工饲养与培育，遗传背景明确或者来源清楚，12 月龄体重宜不超过 50kg，不携带世界卫生组织（World Health Organization，WHO）指定供体动物应排除的潜在感染或条件致病和感染性人畜共患疾病

18、病原，必须利用生物安全屏障环境防止病原体感染，不得使用抗生素或疫苗，用于医用异种移植供体、科学研究、教学、生产和质量控制鉴定以及其他科学实验的小型猪。DB43/T 959.22023 3 4 微生物学等级 异种移植用 DPF 医用供体猪微生物学等级为医用供体无指定病原体级。5 检测要求 5.1 临床观察 外观检查无异常。5.2 微生物检测项目 异种移植用 DPF 医用供体猪病原微生物检测项目见表 1。6 检测程序 检测程序见图 1。图 1 异种移植用 DPF 医用供体猪检测程序 结合临床症状和实验室检查结果，需要进一步确证时，可取特定样本进行检测。7 检测方法 检测方法见表 1。DB43/T

19、959.22023 4 表 1 异种移植用 DPF 医用供体猪病原微生物检测项目及检测方法 类型 序号 检测项目 检测方法 细菌类Bacterium 1 布鲁氏菌 Brucella spp GB/T 18646 2 钩端螺旋体 Leptospira spp GB/T 14926.46 3 猪痢疾蛇样螺旋体 Serpulinahyodysenteriae NY/T 545 4 牛型分枝杆菌 Mycobacterium bovis 附录A 5 结核分枝杆菌 Mycobacterium tuberculosis GB/T 14926.48 6 细胞内鸟型结核分枝杆菌复合物 Mycobacterium

20、 avium-intracelluare complex 附录B 7 猪肺炎支原体 Mycoplasma hyopneumoniae GB/T 14926.8 8 沙门氏菌 Salmonella typhi GB/T 14926.1；NY/T 550 9 志贺氏菌 Shigella GB/T 14926.47 10 支气管败血波氏杆菌 Bordetella bronchiseptica NY/T 546 11 多杀巴氏杆菌 Pasteurella multocida NY/T 546；NY/T 564 12 猪胸膜肺炎放线杆菌 Actinobacillus pleuropneumoniae N

21、Y/T 537 13 猪链球菌 2 型 Streptococcus suis type 2 GB/T 19915.1-3；GB/T 19915.7 真菌类 Fungi 14 皮肤病原真菌 Pathogenic dermal fungi GB/T 14926.4 15 新型隐球菌 Cryptococcus neoformans 附录C 16 荚膜组织胞浆菌 Histoplasma capsulatum 附录D 寄生虫类 Parasites 17 体外寄生虫 Ectozoa GB/T 18448.1 18 猪蛔虫 Ascaris suum GB/T 18448.6 19 棘球绦虫 Echinoco

22、ccus sp.GB 17013 20 等孢球虫属 Isospora sp GB/T 18647 21 猪兰氏类圆线虫 Strongyloides ransomi 附录E 22 弓形虫 Toxoplasma gondii GB/T 18448.2；SN/T 1396 23 旋毛虫 Trichinella spiralis SN/T 0420 24 新孢子虫 Neospora SN/T 3499 25 布氏姜片吸虫 Fasciolopsis buski 附录F 病毒类 Viruses 26 猪腺病毒 Adenovirus(porcine)GB/T 14926.27 27 猪脑心肌炎病毒 Ence

23、phalomyocarditis virus 附录G 28 猪流感病毒 porcine Influenza virus GB/T 27536 29 人流感病毒 Human Influenza viruses 附录H 30 猪巨细胞病毒 Porcine cytomegalovirus 附录I 31 疱疹病毒 Porcine gama-herpesvirus 附录J 32 猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性毒株Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus GB/T 27517 DB43/T 959.22023 5 表 1 异种移植用 DPF 医用

24、供体猪病原微生物检测项目及检测方法（续）类型 序号 检测项目 检测方法 病毒类 Viruses 33 猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株 Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus GB/T 35912 34 猪细小病毒 Procine parvovirus SN/T 1919 35 轮状病毒 Rotavirus GB/T 14926.30 36 伪狂犬病病毒 Pseudorables virus GB/T 18641 37 狂犬病病毒 Rabies virus GB/T 14926.56 38 口蹄疫病毒 Foot and mouth d

25、isease virus GB/T 18935；GB/T 22915 39 猪瘟病毒 Classical swine fever virus GB/T 16551；SN/T 1379.1 40 日本乙型脑炎病毒 Japaneses encephalitis virus GB/T 18638；GB/T 22333 41 猪圆环病毒1型 Porcine circovirus type 1 GB/T 21674；SN/T 2708 42 猪圆环病毒2型 Porcine circovirus type 2 GB/T 21674；SN/T 2708 43 猪传染性胃肠炎病毒 Porcine transm

26、issible gastroenteritis virus GB/T 36871；NY/T 548；SN/T 1446.1 44 猪流行性腹泻病毒 Porcine epidemic diarrhea virus GB/T 36871；GB/T 34757；SN/T 1699 45 猪德尔塔冠状病毒 Porcine deltacoronavirus SN/T 5124 46 猪急性腹泻综合征冠状病毒 Swine acute diarrhea syndrome coronavirus 附录K 47 猪呼吸道冠状病毒 Porcine Respiratory Coronavirus 附录L 48 猪血

27、凝性脑脊髓炎病毒 Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus 附录M 49 猪水泡病病毒 Swine vesicular disease virus GB/T 19200；GB/T 22917 50 猪内源性逆转录病毒C Porcine endogenous retrovirus C(PERV-C)附录N 51 猪淋巴性疱疹病毒 Porcine lymphotropic herpesvirus(PLHV)附录O 52 戊型肝炎病毒 Hepatitis E virus(HEV)SN/T 4235-2015 53 新型冠状病毒 Severe A

28、cute Respiratory Syndrome Coronavirus 2（SARS-CoV-2）附录P 54 非洲猪瘟病毒 Diagnostic techniques for African swine fever GB/T 18648 8 检测规则 8.1 检测频率 每 3 个月至少检测一次。8.2 抽样 8.2.1 方式 选择 3 月龄以上的异种移植用 DPF 医用供体猪用于检测，随机抽样。DB43/T 959.22023 6 8.2.2 数量 根据异种移植用 DPF 医用供体猪群体大小，抽样数量见表 2。表 2 抽样数量 群体大小 抽样数量 50头 不少于3头 50-100头 不少

29、于5头 100-500头 不少于10头 500头 不少于25头 注：临床用猪需要进行100检测。8.2.3 方法 8.2.3.1 按病毒、细菌、真菌、寄生虫检测要求联合采样。8.2.3.2 采样方法按照 NY/T 541 以及医学采样程序进行。8.3 样本标识要求 样本要求有明显标识，写明检品名称、品系、等级、数量、编号、栏舍及检测项目等内容，安全送达实验室。9 结果判定 9.1 合格判定 按各个微生物检测项目结果判定方法判定检测结果，抗体检测项目，血清抗体阴性为合格；抗原和核酸检测项目，未见阳性为合格。如果 PCR 出现阳性需进行测序验证，相似度达 90以上判定为阳性。10 判定结论 所有项

30、目的检测结果均合格，判为符合 DPF 等级标准。否则，判为不符合 DPF 等级标准。11 样本保存 11.1 样本资料、样本来源、动物编号、样本种类及编号，按医学病理资料档案管理规范保存。保存时间为 1 年。11.2 检测样本应一式两份，其中一份应该保存于液氮罐中，保存器具应该标志清晰，符合病理标本保存规范。DB43/T 959.22023 7 附 录 A（规范性）牛分枝杆菌 PCR 检测方法 A.1 原理 以牛分枝杆菌 16SrRNA 基因和 IS6110 基因为靶序列，建立双重 PCR 方法。A.2 样品采集 A.2.1 样品类型 健康样本 A.2.2 样品采集用无菌剪刀剪取病料组织约 0

31、.5-1g，置无菌 1.5mL EP 管中；加入 400L 的组织消化液和蛋白酶 K（终浓度为 l mg/mL）；55，水浴 8h，其间间隔半小时颠倒 EP 管几次，以使病料组织与消化液充分反应；8000rpm，离心 5min，取上清液置另一无菌 1.5mL EP 管中；加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：l）液体，反复颠倒几次；l2000rpm，离心 10 min，取上层液体于一无菌 1.5mL EP 管中；重复抽提 1 次；加入等体积的异丙醇，充分混匀后，置-20 30min；12000rpm，离心 10min，弃上清；沉淀用 70乙醇清洗，并置 37，至乙醇挥发完全；加入 30L

32、TE，并加入 RNA 酶，37，放置 40min；将所得液体作为模板，并置-20保存。A.3 操作步骤 A.3.1 引物的设计 参照 Mycobacterium bovis AF2122/97 gi:31742509基因序列设计出 16SrRNA 基因和 IS6110 基因引物。引物序列如下：16SrRNA P1:5-CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG-3 16SrRNA P2:5-GCCCGTATCGCCCGCACGCT-3 扩增片段大小约为 584bp。IS6110P1:5-GGCTTGCCGGGTTTGA-3 IS6110P2:5-TTTGTCACCGACGCCTACGCT-

33、3 扩增片段大小约为 309bp。A.3.2 PCR 反应 根据引物设计时，oligo6.0 软件提供的建议Tm 值，PCR 反应体系为：原理模板2L（1.75pg-1.75g），10PCR buffer 2.5L，dNTPs 2L，IS6110 引物各 0.5L（5pM），16SrRNA 引物各 1.5L（15pM），蒸馏水 14L，Taq 酶 0.5L（2.5U）；体系总体积为 25L。PCR 扩增的反应条件：95预变性 10min，95变性 30s，59.5退火 30s，72延伸 45s，30 个循环，最后延伸 7min，4保存。A.3.3 PCR 扩增产物的鉴定 0.8的琼脂糖，电压

34、120V，电泳 12-15min，在凝胶成像系统中检测。A.4 结果判定按照设定的双重PCR反应体系和扩增条件，如果出现大小309bp的IS6110基因和约584bp的 16SrRNA 基因的目的片段说明 PCR 结果阳性。DB43/T 959.22023 8 附 录 B（规范性）细胞内鸟型分枝杆菌 PCR 检测方法 B.1 以鸟型分枝杆菌特异性插入序列 IS1245，设计一对特异性引物，用于检测和鉴定皮肤组织中鸟型分枝杆菌。B.2 样品采集 B.2.1 样品类型 猪皮肤组织 B.2.2 样品采集 无菌条件下取上述组织 1g 左右，置入 1.5mL 洁净 EP 管。B.3 操作步骤 B.3.1

35、 组织处理 将皮肤组织去脂、剪碎，用组织研磨器研磨后补加适量蒸馏水，制成组织匀浆 2mL，低速离心后取上清液，2 倍连续稀释后装于微量离心管中。B.3.2 PCR 扩增和检测 扩增插入序列 IS1245：引物 1 为 5-GCCGCCGAA ACGATCTAC-3 引物 2 为 5-AGGTGGCGTCGAGGAAGAC-3 50L PCR 反应体系含 10PCR 缓冲液 5L，25mmol/L MgCl2 5L，dNTPs 200mol/L，引物各1mol/L，模板 DNA10L，TaqDNA 聚合酶 1U。循环条件：94预变性 5min，其后按 94 30s，6530s，72 45s，扩增

36、产物于 1.5琼脂糖凝胶电泳，花青素染色，用紫外检测仪观察结果并摄影。B.4 结果判定。出现 427bp 扩增带为阳性，未见 427bp 扩增带为阴性。DB43/T 959.22023 9 附 录 C（规范性）新型隐球菌 DNA 实时荧光定量 PCR 检测 C.1 以新型隐球菌的 ITS 基因序列中一段高度保守序列为目的序列，设计出特异引物和探针，应用实时荧光定量 PCR 技术进行检测。C.2 样品采集 C.2.1 样品类型 猪肺部分泌物 C.2.2 样品采集 对送检的猪解剖后用棉拭子取下肺部的分泌物，用 PBS 洗脱棉拭子，洗下的液体经冻融三次，离心取上清，加入双抗保存备用。C.3 操作步骤

37、 C.3.1 引物的设计 根据新型隐球菌的基因序列设计引物为：FP:5-TTACCTGTTGGACTTGGATTTGG-3 RP:5-CATAGGCCCAGCGAAACTTATT-3 C.3.2 DNA 的提取 取气管分泌物上清加入 SDS 和蛋白酶 K，50水浴 1h，每 15 分钟摇一次。用酚及酚氯仿抽提，乙醇沉淀，用 20ul 无菌双蒸水溶解备用。在反应体系中加入 5ul 模板，总量为 50uL。C.3.3 目的基因的扩增 以 50L PCR 反应体系进行反应：10PCR Buffer（含 15mmol/L MgCl2）5L，dNTP mixture（10mol/L）1L，Taq DNA

38、 聚合酶（5U/L）0.4L、DNA 模板 2L，上下游引物各 3L，加 dd H2O 至 50L，于扩增仪扩增，循环条件：94 5min，94 30s、58 1min 共 40 个循环。C.4 结果判定 取 5LPCR 产物于 1.5琼脂糖（含 10 GoldView）中，5V/cm 电压电泳 60-75min，紫外透视仪上检测，荧光条带在 124bp 处即为阳性。DB43/T 959.22023 10 附 录 D（规范性）抗荚膜组织胞浆菌抗体 ELISA 检测方法 D.1 用中国药品生物制品检定所研制的荚膜组织胞浆菌蛋白提取物（purified protein from Histoplas

39、ma capsulatum，P-HTPM）为抗原，建立检测猪血清中抗真菌荚膜组织胞浆菌抗体的酶联免疫吸附试验。D.2 样品采集 D.2.1 样品类型 猪血清 D.2.2 样品采集 无菌条件下用一次性注射器取耳静脉血 3mL-5mL，置于试管中，分离血清，待检。D.3 操作步骤 D.3.1 用 1g/孔的抗原包被酶标板，50L/孔，37孵育 2h。D.3.2 弃去孔中液体，加入洗涤液（含 0.05 Tween-20 的 0.01mol/L pH7.4 PBS、PBST），300L/孔，洗涤 3 次，每次 3min。D.3.3 扣干。D.3.4 加入封闭液（含 5犊牛血清的 PBST），100L/

40、孔，37封闭 30min。D.3.5 弃去封闭液，加入待检血清（稀释度为 1:1000），100/孔，37作用 30min。D.3.6 洗涤 3 次（方法同前）。D.3.7 扣干。D.3.8 加入 1:10000 的酶标抗体（二抗）100L/孔，37作用 45min。D.3.9 洗涤 3 次。D.3.10 扣干。D.3.11 加入底物 TMB 显色液，100L/孔，室温避光显色 10-15min。D.3.12 每孔加入 50L 2mol/L H2SO4终止反应。D.3.13 测定吸光度值，按照下列公式计算 P/N 值：P/N 值=阳性对照孔 OD 均值/阴性对照孔 OD 均值。D.4 结果判定

41、 当被检样品的 A 值0.135 时，判定为阳性；当样品的 A 值在 0.059-0.135 之间时，判定为可疑；当样品的 A 值0.059 时，判定为阴性。DB43/T 959.22023 11 附 录 E（规范性）猪兰氏类圆线虫病镜检法诊断 E.1 消化道蠕虫粪学检查 E.2 样品采集 E.2.1 样品类型 猪粪便 E.2.2 样品采集 从猪舍地面及猪直肠分别采集猪的粪样。E.3 操作步骤 E.3.1 饱和食盐水漂浮法检查 取粪样 10g 溶于饱和食盐水中，用玻璃棒搅拌均匀后用 40 目的金属筛反复过滤，除去大的粪渣，将滤液置于大试管中，让液面突出于试管口，静止 30min 后蘸取液面制压

42、片，在 40 倍显微镜下检查。E.3.2 尼龙筛淘洗法检查 取粪样 25 g 置于大烧杯中，用常水溶解并用玻璃棒充分搅拌均匀后，经金属筛反复过滤，除去大的粪渣，将滤液置入 260 目的尼龙筛内，用清水反复淘洗，直至淘洗液澄清透明位置，吸取尼龙筛内沉积物制压片，在 10 倍和 40 倍显微镜下检查。E.4 结果判定 E.4.1 饱和食盐水漂浮法 经饱和食盐水飘浮法对猪的粪便进行检查，从直肠采取的粪样中查到虫卵，椭圆形，无色透明，卵壳薄，大小为（42-53）m（24-32）m，内有幼虫。鉴定为兰氏类圆线虫卵。E.4.2 经尼龙筛淘洗法 对猪的粪便进行检查，从地面采集的粪样中查到虫体，虫体细小，呈乳

43、白色，毛发状，镜下透明，食道短，呈柱状，有两个食道球，虫体大小为（3.1-4.6）mm（0.055-0.080）mm。鉴定为兰氏类圆线虫的杆型幼虫。DB43/T 959.22023 12 附 录 F（规范性）布氏姜片吸虫镜检法诊断 F.1 消化道蠕虫粪学检查 F.2 样品采集 F.2.1 样品类型 猪新鲜粪便 F.2.2 样品采集 从猪舍地面及猪直肠分别采集猪的粪样。F.3 操作步骤 F.3.1 直接涂片法 先取 2-3 滴蒸馏水（或 50的甘油水）于载玻片上，再用火柴棒取新鲜的粪便混合均匀，去除污秽后，用低倍镜检查。F.3.2 沉淀法 取 5-10 g 的粪便于烧杯中加 20 mL 水，用筛

44、过滤后，装入离心器然后倒上清液，再进行离心，反复数次，取沉淀渣滴于玻片上，用低倍镜检查。F.4 结果判定 采用以上两种方法对猪的粪便进行检查，从地面采集的粪样中查到虫体或虫卵，虫体肥厚、背腹扁平、前端狭窄、后端钝圆，形似鲜姜之切片；虫卵长椭圆形、淡黄色、卵壳薄均匀、前端卵盖扁小不易看出，长宽比约为 130-145m85-97m，鉴定为布氏姜片吸虫阳性。DB43/T 959.22023 13 附 录 G（规范性）猪脑心肌炎病毒间接 ELISA 检测 G.1 由于 2C 蛋白为猪脑心肌炎病毒的非结构蛋白，参与病毒的复制，因此在病毒复制时才会产生该蛋白并刺激机体产生抗体，通过重组 2C 蛋白为包被抗

45、原建立检测猪脑心肌炎病毒抗体间接 ELISA 方法。G.2 样品采集 G.2.1 样品类型 猪血清 G.2.2 样品采集 无菌条件下用一次性注射器取耳静脉血 3mL-5mL，置于试管中，分离血清，待检。G.3 操作步骤 G.3.1 将重组蛋白 2C 用包被液（0.05mol/L、pH9.6 的碳酸盐缓冲液）稀释为适当浓度按 100L/孔包被酶标板，37孵育 1h 后 4过夜。G.3.2 弃去孔中液体，加入洗涤液（含 0.05 Tween-20 的 0.01mol/L pH7.4 PBS、PBST），300L/孔，洗涤 3 次，每次 3min。G.3.3 扣干。G.3.4 加入封闭液（含 5犊牛

46、血清的 PBST），100L/孔，37封闭 1h。G.3.5 弃去封闭液，加入待检血清（一抗），100L/孔，37作用 45min。G.3.6 洗涤 3 次（方法同前）。G.3.7 扣干。G.3.8 加入适当稀释的酶标抗体（二抗）100L/孔，37作用 45min。G.3.9 洗涤 3 次。G.3.10 扣干。G.3.11 加入底物 TMB 显色液，100L/孔，室温避光显色 10-15min。G.3.12 每孔加入 50L 2mol/L H2SO4终止反应。G.3.13 测定 OD450 nm 光吸收值，按照下列公式计算 P/N 值：P/N 值=阳性对照孔 OD 均值/阴性对照孔OD 均值。

47、G.4 结果判定 当被检样品的 OD 值0.27 时，判定为阳性；当样品的 OD 值0.27 时，判定为阴性。DB43/T 959.22023 14 附 录 H（规范性）人流感病毒多重 PCR 检测 H.1 根据流感病毒 HA 基因和 M 基因设计引物，进行 RT-PCR 方法检测。H.2 样品采集 H.2.1 样品类型 鼻咽拭子 H.2.2 样品采集标本采集后，冷冻 12 h 内运送至实验室，24 h 内进行流感病毒分离培养和快速检测试验。H.3 操作步骤 H.3.1 多重 PCR 引物设计分别设计扩增引物扩增 HA 全基因片段：H1F-5-agcaaaagcaggggaaaata-3 H1

48、R-5-aacaagggtgtttttcctca-3 H3F-5-agcaaaagcaggggataattc-3 H3R-5-ctcaaatgcaaatgttgcacc-3 BF-5-gggacatgaacaacaaagatgc-3 BR-5-tgtcagctattatggagctg-3 H1、H3 和乙型扩增产物分别 431bp、210bp 和 390bp。H.3.2 病毒 RNA 提取 提取病毒 RNA 作为 RT-PCR 模板，用于反转录试验或置-20保存备用。H.3.3 病毒逆转录 用试剂盒进行病毒 RNA 逆转录。H.3.4 多重 PCR 反应体系 25L，各反应物浓度 10Buff

49、er 2.5L、MgCl2（25mM）2L、dNTP 2L、Taq（5U/L）0.4L、H 对引物（10mM）各 1.25L、逆转录生成的 cDNA 4L、加水到 25L。反应程序：94 3min，94 30s、511min、681min 共 35 个循环，6810min。H.3.5 PCR 产物的鉴定 取 PCR 产物 5L，加入上样孔后进行 1琼脂糖凝胶电泳。H.4 结果判定 出现 431bp、210bp 或 390bp 条带，判定为阳性。DB43/T 959.22023 15 附 录 I（规范性）猪巨细胞病毒 FQ-PCR 检测 I.1 原理 TaqMan 探针法是高度特异的定量 PCR

50、 技术，是利用 Taq 酶的 35外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，因此从荧光信号的强弱就可以判断模板数量。I.2 样品采集 I.2.1 样品类型 病变组织 I.2.2 样品采集 无菌条件下取上述组织 1 g 左右，置入 1.5 mL 洁净 EP 管。I.3 操作步骤 I.3.1 总 RNA 提取 1.5 mL 样品离心管中，加入 1mLTrizol 试剂，静置 5min 或马上-70保存，12000rpm离心 15min，分相为三层，取上清液至新 1.5 mL 管，加入 200ul 氯仿，振荡混匀 30s，室温静置 3-5min分层，12000rpm 离心