DB14∕T 1789-2019 禽流感病毒H7亚型抗体竞争ELISA检测方法.docx

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1、ICS11.220B41DB14山西省地方标准DB14/T17892019禽流感病毒H7亚型抗体竞争ELISA检测方法2019-06-25发布2019-08-25实施山西省市场监督管理局发布DB14/T17892019目次前言.II1范围.12缩略语.13实验原理.14实验条件.15实验方法.16结果判定.27注意事项.3附录A（规范性附录）试剂配制方法.4IDB14/T17892019前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山西省农业农村厅提出并监督实施。本标准由山西省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山西省动物疫病预防控制中心、武汉科前生物股份有限公司、华中农

2、业大学。本标准主要起草人：雷宇平、王仲兵、郎小兵、金梅林、董晓辉、但汉并、卢月、胡明明、王治维、芦俊彦、樊慧锦、宁艳、雷冲、王锦、刘田勇。IIDB14/T17892019禽流感病毒H7亚型抗体竞争ELISA检测方法1范围本标准规定了应用竞争酶联免疫吸附法检测血清中禽流感病毒H7亚型抗体方法的缩略语、实验原理、实验条件、实验方法、结果判定和注意事项。本标准适用于禽流感病毒H7亚型抗体的检测。2缩略语下列缩略语适用于本文件。ELISA：酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay）OD：光密度值(opticaldensity)HRP：辣根过氧化物酶(horsera

3、dishperoxidase)3实验原理本标准采用竞争酶联免疫吸附法，该方法利用抗原抗体反应具有特异性的特点，将特异性的H7亚型禽流感病毒血凝抑制试验抗原吸附到固相载体的表面，将待检血清和特异性酶标单抗同时加入包被板孔。由待检血清中的抗体和酶标单抗竞争与包被抗原结合，待检血清中抗体越多，结合在包被抗原上的酶标单抗就越少，阳性血清反应呈色浅于阴性血清。4实验条件4.1实验室环境实验操作在1525下进行。未灭活的感染性材料的实验活动，应在级生物安全柜内进行。4.2仪器级生物安全柜、离心机、酶标仪、洗板机（或手洗）、微量移液器、冰箱、恒温箱。5实验方法5.1实验材料禽流感病毒H7亚型包被抗原、HRP

4、标记的禽流感病毒H7亚型HA蛋白的单克隆抗体（酶标记物）、底物液、终止液、样品稀释液、洗涤液、包被液、封闭液。试剂配制方法见附录A。5.2样品准备1DB14/T17892019取动物全血，待血液充分凝固后，4000r/min离心10min，收集血清。也可等凝固后自然析出血清。血清应清亮，无溶血。样品处理过程中应防止样品的污染，注意个人安全防护。5.3包被用包被液将包被抗原稀释至工作浓度2g/mL，加至抗原包被板中，每孔100L，放置28条件下，包被15h。5.4封闭弃去包被液，每孔加入封闭液200L，置371孵育2h；弃去封闭液，拍干，再置371干燥2h。5.5待检血清的稀释待检血清在血清稀释

5、板中做10倍稀释。5.6操作步骤5.6.1加样取抗原包被板，先用洗涤液洗涤抗原包被板1次，稀释好的待检血清、阴性对照和阳性对照各取50L，加至抗原包被板中，每板待检血清设1孔，阴、阳性对照各设2孔，同时加入酶标记物50L。轻轻振匀孔中样品，置371下温育45min。5.6.2洗涤弃去孔中液体，每孔加入洗涤液200L，重复洗涤5次，最后一次拍干。5.6.3加酶标抗体将辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体用封闭液1:1000稀释，每孔加100L，371放置30min。5.6.4洗涤弃去孔中液体，每孔加入洗涤液200L，重复洗涤5次，最后一次拍干。5.6.5加底物液每个反应孔加入底物液100L，置20

6、25下避光显色15min。5.6.6加终止液每孔加终止液50L，10min内在酶标仪上测定450nm波长处的OD值。6结果判定试验成立的条件：阴性对照的平均OD450nm值大于1.0，阳性对照的抑制率（PI值）大于50%。S=样品孔OD450nm值，N=阴性对照孔平均OD450nm值。PI值=(1-S/N)100%。2DB14/T17892019若被检样品的抑制率小于40%，该样品判为禽流感病毒H7亚型抗体阴性。若被检样品的抑制率大于或等于40%，该样品判为禽流感病毒H7亚型抗体阳性。7注意事项7.1人员防护实验过程中注意做好个人的安全防护工作。7.2样品处理血清应在级生物安全柜中析出。7.3

7、废弃物处理操作区应有专门的固体和液体废弃物收集容器。废弃物经高压灭菌后按相关规定处理。3DB14/T17892019AA附录A（规范性附录）试剂配制方法A.1包被液包被液为碳酸盐缓冲液（0.025mol/L，pH9.6）。将下列试剂按序加入1000mL规格的容器中，加800mL蒸馏水充分溶解，定容至1000mL。碳酸钠（Na2CO3）1.59g碳酸氢钠（NaHCO3）2.93g加蒸馏水至1000mLA.2洗涤液氯化钠（NaCl）8.0g氯化钾（KCl）0.2g十二水磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）2.9g磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2gTween-200.5mL加蒸馏水至1000mLA.3底物液商品化TMB显色液。A.4终止液98%浓硫酸（H2SO4）108.8mL加蒸馏水至1000mLA.5样品稀释液氯化钠（NaCl）8.0g氯化钾（KCl）0.2g十二水磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）2.9g磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2g加蒸馏水至1000mLA.6封闭液牛血清白蛋白（BSA）5.0g4DB14/T17892019氯化钠（NaCl）8.0g氯化钾（KCl）0.2g十二水磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）2.9g磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2g硫柳汞钠0.2g加蒸馏水至1000mL_5