(17)--第六章 微生物的生长及控制.ppt
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1、1教学目的教学目的:n微生物生长的测定及微生物的生长规律;微生物生长的测定及微生物的生长规律;n影响微生物生长的主要因素;影响微生物生长的主要因素;教学教学方法和手段:方法和手段:n主要通过多媒体课件的讲授和具体举例分析主要通过多媒体课件的讲授和具体举例分析来实现教学目的,通过提问、讨论等教学辅来实现教学目的,通过提问、讨论等教学辅助手段促进学生的积极思考,激发学生的潜助手段促进学生的积极思考,激发学生的潜能。能。2生长:生物个体物质有规律地、不可逆增加,导致生长:生物个体物质有规律地、不可逆增加,导致生长:生物个体物质有规律地、不可逆增加,导致生长:生物个体物质有规律地、不可逆增加,导致个体
2、体积扩大的生物学过程。个体体积扩大的生物学过程。个体体积扩大的生物学过程。个体体积扩大的生物学过程。繁殖:生物个体生长到一定阶段,通过特定方式产繁殖:生物个体生长到一定阶段,通过特定方式产繁殖:生物个体生长到一定阶段,通过特定方式产繁殖:生物个体生长到一定阶段,通过特定方式产生新的生命个体,即引起生命个体数量增加的生生新的生命个体,即引起生命个体数量增加的生生新的生命个体,即引起生命个体数量增加的生生新的生命个体,即引起生命个体数量增加的生物学过程。物学过程。物学过程。物学过程。第六章第六章 微生物的生长及其控制微生物的生长及其控制34n n微生物生长:微生物生长:在一定时间和条件下细胞数在一
3、定时间和条件下细胞数量的增加(微生物群体生长),在微生物量的增加(微生物群体生长),在微生物学中提到的学中提到的“生长生长”,一般均指群体生长,一般均指群体生长,这一点与研究大生物时有所不同。这一点与研究大生物时有所不同。n n微生物生长:单位时间里微生物数量或生微生物生长:单位时间里微生物数量或生物量的变化。物量的变化。5第一节微生物的生长和测定方法1 1、测生长量:、测生长量:、测生长量:、测生长量:(1 1)直接法:测体积、称干重等方法直接法:测体积、称干重等方法直接法:测体积、称干重等方法直接法:测体积、称干重等方法(2 2)间接法:间接法:间接法:间接法:A A比浊法:可用分光光度法
4、对无色的微生物悬浮液进行比浊法:可用分光光度法对无色的微生物悬浮液进行比浊法:可用分光光度法对无色的微生物悬浮液进行比浊法:可用分光光度法对无色的微生物悬浮液进行测定或用带有侧臂的三角烧瓶作原位测定。测定或用带有侧臂的三角烧瓶作原位测定。测定或用带有侧臂的三角烧瓶作原位测定。测定或用带有侧臂的三角烧瓶作原位测定。67B生理指标法:生理指标法:如测含氮量:一般细菌的含氮量为其干重的如测含氮量:一般细菌的含氮量为其干重的12.5%,酵母菌为,酵母菌为7.5%,霉菌为,霉菌为6.5%,含氮,含氮量乘以量乘以6.25即为粗蛋白含量。即为粗蛋白含量。测含碳量以及测磷、测含碳量以及测磷、DNA、RNA、A
5、TP、DAP(二氨基庚二酸)、几丁质或(二氨基庚二酸)、几丁质或N乙酰乙酰胞壁酸等含量的;胞壁酸等含量的;产酸、产气、耗氧、粘度和产热等指标,有产酸、产气、耗氧、粘度和产热等指标,有时也应用于生长量的测定。时也应用于生长量的测定。82、计繁殖数:细菌细菌细菌细菌酵母菌酵母菌酵母菌酵母菌放线菌和霉菌孢子数放线菌和霉菌孢子数放线菌和霉菌孢子数放线菌和霉菌孢子数(1 1)直接法:指用计)直接法:指用计)直接法:指用计)直接法:指用计数板(例如血球计数板)数板(例如血球计数板)数板(例如血球计数板)数板(例如血球计数板)在光学显微镜下直接观在光学显微镜下直接观在光学显微镜下直接观在光学显微镜下直接观察
6、细胞并进行计数的方察细胞并进行计数的方察细胞并进行计数的方察细胞并进行计数的方法。法。法。法。9A 平板菌落计数法(2)间接法)间接法(菌落计数法)(菌落计数法):10n n采用培养平板计数法要求:采用培养平板计数法要求:n n每一活微生物单细胞在培养平板上培养每一活微生物单细胞在培养平板上培养后,形成一个单菌落,在科研中一般用后,形成一个单菌落,在科研中一般用菌落形成单位(菌落形成单位(colony forming units,CFU)来表示,而不是直接表示为细胞)来表示,而不是直接表示为细胞数。数。n n技术要求高,烦琐。技术要求高,烦琐。11C 厌氧菌的菌落计数法:厌氧菌的菌落计数法:一
7、般采用亨盖特滚管培养法进行(第四节)。一般采用亨盖特滚管培养法进行(第四节)。半固体深层琼脂法半固体深层琼脂法 12第二节:微生物的生长规律 一、一、细菌的同步生长和二次生长细菌的同步生长和二次生长同步培养:同步培养:使群体中的细胞处于比较一致使群体中的细胞处于比较一致的,生长发育均处于同一阶段上,即大多的,生长发育均处于同一阶段上,即大多数细胞能同时进行生长或分裂的培养方法。数细胞能同时进行生长或分裂的培养方法。同步生长:同步生长:以同步培养方法使细胞群体中以同步培养方法使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态。各个体处于分裂步调一致的生长状态。13n n通过同步培养方法获得的细胞被称为
8、通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物。同步细胞或同步培养物。n n由于细胞的个体差异,同步生长往往由于细胞的个体差异,同步生长往往只能维持只能维持2-3个世代,随后又逐渐转变个世代,随后又逐渐转变为随机生长。为随机生长。14二、单细胞微生物的典型生长曲线纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中,纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中,定时测定菌体数量,以活菌数对数为纵坐标,以时定时测定菌体数量,以活菌数对数为纵坐标,以时间为横坐标绘图所得到的曲线,称为生长曲线。间为横坐标绘图所得到的曲线,称为生长曲线。整个典型生长曲线可分为四个时期:延滞期、指数整个典型生长曲线可分为四个
9、时期:延滞期、指数期、稳定期和衰亡期。期、稳定期和衰亡期。15161、延滞期延滞期表现:不立即繁殖,菌数几乎不变,细胞表现:不立即繁殖,菌数几乎不变,细胞形态变大。形态变大。特点:生长速率常数为特点:生长速率常数为0,分裂迟缓,合成,分裂迟缓,合成代谢活跃,体积增长快,细胞内代谢活跃,体积增长快,细胞内RNA含量含量增高,对外界不良环境敏感,合成各种新增高,对外界不良环境敏感,合成各种新的酶系和中间代谢产物。的酶系和中间代谢产物。影响延滞期长短的因素:影响延滞期长短的因素:菌种菌种接种龄接种龄 接种量接种量培养基成分培养基成分17(1)(1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短;通过遗传
10、学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短;(2)(2)利用对数生长期的细胞作为种子;利用对数生长期的细胞作为种子;(3)(3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大;尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大;(4)(4)适当扩大接种量适当扩大接种量在生产实践中缩短迟缓期的常用手段:在生产实践中缩短迟缓期的常用手段:182、指数期:在生长曲线中,细胞、指数期:在生长曲线中,细胞数以几何级数增长的时期。数以几何级数增长的时期。表现:代谢活性最强,几何级数增加,代表现:代谢活性最强,几何级数增加,代时最短,生长速率最大。时最短,生长速率最大。特点:细菌数目增加与原生质总量增加,特点:细菌数目增加
11、与原生质总量增加,与菌液浊度增加呈正相关性。与菌液浊度增加呈正相关性。代时:单个细胞完成一次分裂所需时间,代时:单个细胞完成一次分裂所需时间,亦即增加一代所需时间。亦即增加一代所需时间。倍增时间:原生质增加一倍所需的时间倍增时间:原生质增加一倍所需的时间倍增时间:原生质增加一倍所需的时间倍增时间:原生质增加一倍所需的时间19影响微生物增代时间(代时)的因素:影响微生物增代时间(代时)的因素:1)菌种,不同的微生物及微生物的不同菌株)菌种,不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同;代时不同;2)营养成分,在营养丰富的培养基中生长代)营养成分,在营养丰富的培养基中生长代时短;时短;3)营养物浓度,在
12、一定范围内,生长速率与)营养物浓度,在一定范围内,生长速率与营养物浓度呈正比;凡是处于较低浓度范营养物浓度呈正比;凡是处于较低浓度范围内,可影响生长速率的营养物成分,就围内,可影响生长速率的营养物成分,就称为生长限制因子。称为生长限制因子。4)温度,在一定范围,生长速率与培养温度)温度,在一定范围,生长速率与培养温度呈正相关。呈正相关。20大肠杆菌在不同温度下的代时大肠杆菌在不同温度下的代时温度(温度(温度(温度()代时代时代时代时(minmin)温度(温度(温度(温度()代时代时代时代时(minmin)101015152020252530308608601201209090404029293
13、5354040454547.547.5222217.517.520207777213、稳定期表现:新增殖细胞数与老细胞的死亡数几乎相等,表现:新增殖细胞数与老细胞的死亡数几乎相等,活菌数动态平衡。活菌数动态平衡。特点:生长速率又趋于特点:生长速率又趋于0,细胞总数最高。合成各,细胞总数最高。合成各类次生代谢物。类次生代谢物。原因:养分减少;营养物比例失调,有毒代谢物产原因:养分减少;营养物比例失调,有毒代谢物产生,培养环境条件中生,培养环境条件中pH和氧化还原电位等对细和氧化还原电位等对细菌生长不利。菌生长不利。22应用意义:应用意义:1 1)发酵生产形成的重要时期(抗生素、氨基酸等),生产上
14、应)发酵生产形成的重要时期(抗生素、氨基酸等),生产上应尽量延长此期,提高产量,措施如下:尽量延长此期,提高产量,措施如下:补充营养物质(补料)补充营养物质(补料)调调pH pH 调整温度调整温度 2)稳定期细胞数目及产物积累达到最高。)稳定期细胞数目及产物积累达到最高。234、衰亡期表现:出现表现:出现“负生长负生长”,有些细胞开始自溶。,有些细胞开始自溶。衰亡期特点:细菌代谢活性降低,细菌衰老并出衰亡期特点:细菌代谢活性降低,细菌衰老并出衰亡期特点:细菌代谢活性降低,细菌衰老并出衰亡期特点:细菌代谢活性降低,细菌衰老并出现自溶,产生或释放出一些产物,如氨基酸、转现自溶,产生或释放出一些产物
15、,如氨基酸、转现自溶,产生或释放出一些产物,如氨基酸、转现自溶,产生或释放出一些产物,如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。化酶、外肽酶或抗生素等。化酶、外肽酶或抗生素等。化酶、外肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态,有时产生畸形,细胞大小悬殊,细胞呈现多种形态,有时产生畸形,细胞大小悬殊,细胞呈现多种形态,有时产生畸形,细胞大小悬殊,细胞呈现多种形态,有时产生畸形,细胞大小悬殊,有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。24三、微生物的连续培养 连续培养(连续培养(连续培养(连续培
16、养(continuous culturecontinuous culture):指在微生物的整个培养):指在微生物的整个培养):指在微生物的整个培养):指在微生物的整个培养期间,通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率期间,通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率期间,通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率期间,通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。生长并能持续生长下去的一种培养方法。生长并能持续生长下去的一种培养方法。生长并能持续生长下去的一种培养方法。又称开放培养,是相对单批培养、封闭培养而言的。又称开放培养,是相对单批培养、封闭培养而言的。
17、又称开放培养,是相对单批培养、封闭培养而言的。又称开放培养,是相对单批培养、封闭培养而言的。单批培养(单批培养(单批培养(单批培养(batch culturebatch culture)或)或)或)或 封闭培养(封闭培养(封闭培养(封闭培养(closed cultureclosed culture):):):):指将微生物置于一定容积的培养基中,经过培养生长,指将微生物置于一定容积的培养基中,经过培养生长,指将微生物置于一定容积的培养基中,经过培养生长,指将微生物置于一定容积的培养基中,经过培养生长,最后一次收获。典型生长曲线。最后一次收获。典型生长曲线。最后一次收获。典型生长曲线。最后一次收
18、获。典型生长曲线。25单批培养(封闭培养):培养基一次加入,单批培养(封闭培养):培养基一次加入,不予补充,不再更换。不予补充,不再更换。连续培养:在培养过程中不断的补充营养物连续培养:在培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物才能实现微质和以同样的速率移出培养物才能实现微生物连续培养。生物连续培养。26连续培养器的类型连续培养器的类型271、恒浊器:是一种根据培养器内微生物的生、恒浊器:是一种根据培养器内微生物的生长密度,并借光电控制系统来控制培养液长密度,并借光电控制系统来控制培养液流速,以取得菌体密度高、生长速度恒定流速,以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器
19、。的微生物细胞的连续培养器。28恒浊连续培养恒浊连续培养测定所培养微生物的光密度值测定所培养微生物的光密度值自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速使培养物维持在某一恒定浊度使培养物维持在某一恒定浊度当培养室中的浊度超过预期数值时,流速加快,使浊度降低;当培养室中的浊度超过预期数值时,流速加快,使浊度降低;当培养室中的浊度低于预期数值时,流速减慢,使浊度升高;当培养室中的浊度低于预期数值时,流速减慢,使浊度升高;恒浊培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的恒浊培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的如果所用培养基中有过量的必需
20、营养物,就可以使菌体维如果所用培养基中有过量的必需营养物,就可以使菌体维持最高的生长速率。持最高的生长速率。29一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业使用范围:用于生产大量菌使用范围:用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物,如乳酸、的某些代谢产物,如乳酸、乙醇等。乙醇等。302、恒化器、恒化器:是一种设法使培养液的流速保持是一种设法使培养液的流速保持不变,并使微生物始终在低于其最高生长不变,并使微生物始终在低于其最高生长速率的条件下进行生长繁殖的连续培养装速率的条件下进行生长繁殖的连续培
21、养装 置。置。31恒化连续培养:n n使培养液流速保持不变,并使微生物始终在低于使培养液流速保持不变,并使微生物始终在低于使培养液流速保持不变,并使微生物始终在低于使培养液流速保持不变,并使微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖。其最高生长速率下进行生长繁殖。其最高生长速率下进行生长繁殖。其最高生长速率下进行生长繁殖。3233连续发酵与单批发酵相比的优点:连续发酵与单批发酵相比的优点:缩短发酵周期。缩短发酵周期。提高设备利用率。提高设备利用率。便于自动控制。便于自动控制。降低动力消耗及体力劳动强度。降低动力消耗及体力劳动强度。产品质量较稳定。产品质量较稳定。缺点缺点:营养物利用率低。营养
22、物利用率低。染菌率高。染菌率高。菌种易菌种易退化。退化。34四、微生物的高密度培养n n微生物的高密度培养:微生物在液体培养微生物的高密度培养:微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的倍以上时的生长状态或培养技术。生长状态或培养技术。n n现代高密度培养技术主要是在用基因工程现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌生产多肽类药物的实践中逐步发展起来菌生产多肽类药物的实践中逐步发展起来的。的。n n实践价值实践价值35n n选取最佳培养基成分和各成分含量选取最佳培养基成分和各成分含量n n补料补料n n提高溶解氧的浓度提高溶解氧的浓度n n防止有害代谢产物
23、的生成防止有害代谢产物的生成n n保持合适保持合适PH具体方法具体方法36第三节:影响微生物生长的主要因素 影响微生物生长的外界因素除营养条件外,还影响微生物生长的外界因素除营养条件外,还影响微生物生长的外界因素除营养条件外,还影响微生物生长的外界因素除营养条件外,还有许多物理条件。如有许多物理条件。如有许多物理条件。如有许多物理条件。如温度、温度、温度、温度、pHpH、OO2 2 、水分、水分、水分、水分、渗透压渗透压渗透压渗透压等。等。等。等。37一、温度生长温度三基点:最低生长温度,最适生生长温度三基点:最低生长温度,最适生长温度,最高生长温度。长温度,最高生长温度。宽温微生物宽温微生物
24、窄温微生物窄温微生物41菌菌 名名生长温度生长温度发酵温度发酵温度累积产物温度累积产物温度 ()()()Streptococcus thermophilus374737S.lactis3440产细胞:产细胞:2530产乳酸:产乳酸:30Streptomyces griseus3728_Corenybacterium pekinense32 3335_Clostridium acetobutylicum3733_Penicilium chrysogenum302520以青霉素的生产为例:培养以青霉素的生产为例:培养165小时采用分段控制温度的方法,小时采用分段控制温度的方法,其青霉素产量比始终在
25、其青霉素产量比始终在30 培养提高了培养提高了14.7%。分段控制方式:分段控制方式:05小时,小时,30;540小时,小时,25;40125小时,小时,20;125165小时,小时,25。不同生理生化过程的最适温度不同生理生化过程的最适温度微生物不同生理活动要求不同温度,所以,微生物不同生理活动要求不同温度,所以,最适生长温度最适生长温度 发酵速度快、积累代谢产物多。发酵速度快、积累代谢产物多。42从微生物整体来看从微生物整体来看:生长的温度范围一般在生长的温度范围一般在-10 100 极端下限为极端下限为-30,极端上限为,极端上限为105300 但对于特定的某一种微生物:但对于特定的某一
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