DB34_T 3543-2019 菊花种质资源常温离体保存技术规程.docx

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1、ICS65.020.20B05DB34安徽省地方标准DB34/T35432019菊花种质资源常温离体保存技术规程TechnicalRegulationsforInvitroConservationundernormaltemperatureOfChrysanthemummorifoliumGermplasm文稿版次选择2019-12-25发布2020-01-25实施安徽省市场监督管理局发布DB34/T35432019前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由阜阳师范大学提出。本标准由安徽省林业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：阜阳师范大学、阜阳市颍菊生态农业发展有限公司

2、、亳州市沪谯药业有限公司、太和县淼林现代农业发展有限公司、安徽农之源生态农业有限公司、安徽大汇生态科技发展有限公司、阜阳市花卉管理办公室。本标准起草人：兰伟、陈玉龙、马冲、高贯彪、候林威、刘晓艳、张静博、郭长达、张源、谢欣雨、胡中盛、郑萍、尚冰冰、李振、张程飞、王其丰。IDB34/T35432019菊花种质资源常温离体保存技术规程1范围本标准规定了菊花（ChrysanthemummorifoliumRamat.）种质资源常温离体保存的种质材料、主要培养场所、培养基的配制、离体材料选取及消毒、常温离体保存、遗传稳定性检测。本标准适用于菊花种质资源的常温离体保存。2规范性引用文件下列文件对于本文件

3、的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T19557.19植物品种特异性、一致性和稳定性测试指南菊花NY/T1491花卉植物病毒检测规程3种质材料3.1来源必须保证遗传纯正，来源清楚。3.2无病毒按照NY/T1491规定的方法进行病毒检测，确保材料不携带菊花B病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、菊花矮化类病毒（CSVd）、菊花褪绿斑驳类病毒（CChMVd）等。3.3无变异未发生变异。3.4登记3.4.1名称：种质名、品系名、地方名。3.4.2引种情况：来源地、引种人、原保存单位及编号、

4、引种时间。3.4.3种质编号：统一编号、引种号、采集号、保存号。3.4.4保存情况：保存材料、保存者、保存数量、继代时间、继代次数、操作人。4主要培养场所4.1准备室用于玻璃、塑料器皿及其他实验用具的清洗、干燥和保存；药品的称量、溶解、配制，培养基的配制、分装、包扎和灭菌；外植体材料的预处理、培养材料的观察分析等。1DB34/T354320194.2接种室要求干爽安静，清洁明亮，墙壁光滑平整，地面平坦无缝隙。放置超净工作台，无菌条件下进行外植体的消毒、接种和瓶苗的转接等。4.3培养室用于瓶苗的无菌培养、观察和中长期离体保存。5培养基的配制5.1培养基类型的选择选择MS培养基为基本培养基，参见附

5、录A。5.2母液与激素的配制5.2.1大量元素母液的配制按10倍液配制，放置于棕色瓶中，保存于4冰箱中备用。5.2.2微量元素母液的配制按100倍液配制，放置于棕色瓶中，保存于4冰箱中备用。5.2.3有机母液的配制按50倍液配制，放置于棕色瓶中，保存于4冰箱中备用。5.2.4铁盐的配制将硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠分别溶于蒸馏水中，加热不断搅拌，使完全溶解，冷却后，将两者溶液充分混合，定容至所需体积。按100倍液配制，放置于棕色瓶中，保存于4冰箱中备用。5.2.56-BA的配制HCl溶解，再用蒸馏水定容至100ml，浓度为0.5molL。称取50mg6-BA，用少量1molL5.2.6NAA的配

6、制-1-1NaOH溶解，再用蒸馏水定容至100ml，浓度为0.1molL。称取10mgNAA，用少量1molL-1-15.3.1腋芽诱导培养基:1/2MS（大量元素减半，其它成分不变）+30gL蔗糖+6.5gL琼脂。5.3.2增殖培养基：MS+BA0.5mgL+NAA0.1mgL+30gL蔗糖+6.5gL琼脂。5.3培养基配方-1-1-1-1-1-15.4培养基pH值培养基pH值为5.8。6离体材料选取及消毒2在增殖培养基中添加1500mgL2000mgL的矮壮素（CCC）或6mg.L9mg.L多效唑保存温度为（252），光照强度2000Lx3000Lx，光照时间12hd。将离体保存的瓶苗转接

7、到MS+BA0.5mgL+NAA0.1mgL+30gL蔗糖+6.5gL培养基上培DB34/T354320196.1选取和清洗选取符合3.1、3.2和3.3要求，并按照3.4编号登记的嫩枝，去掉叶片和部分叶柄，流水冲洗干净。6.2接种工具消毒接种前，将剪刀、镊子等接种工具在高压灭菌锅中灭菌，取出后浸入75的乙醇中；接种时，再进行燃烧灭菌，放凉备用。燃烧时，应注意浸入乙醇的一端倾斜向下，不可倒置。6.3离体材料消毒无菌滤纸吸干嫩枝表面水分，浸入70乙醇中表面消毒30s，再浸入0.1升汞溶液消毒5min10min，无菌水冲洗4次5次。7常温离体保存7.1外植体的剪切用剪刀剪取表面消毒的嫩枝中上部两个

8、节茎段。7.2无菌再生体系建立将剪切的外植体按生长极性方向，接种于腋芽诱导培养基上。培养20d后，将其腋芽转接到增殖培养基上。7.3离体保存-1-1-1-1（PP333）。选用培养30d的瓶苗两个节茎段接种保存。7.4保存条件-17.5保存数量每份种质保存10瓶以上，每瓶3个4个保存材料。7.6继代时间每10个12个月继代1次。7.7恢复生长-1-1-1-1养。8遗传稳定性检测再生植株遗传稳定性应符合GB/T19557.19的规定。3成分含量大量元素硝酸钾KNO31900硝酸铵NH4NO31650硫酸镁MgSO47H2O370磷酸二氢钾KH2PO4170氯化钙CaCl22H2O440微量元素硫酸锰MnSO44H2O22.3硫酸锌ZnSO47H2O8.6硼酸H3BO36.2碘化钾KI0.83钼酸钠Na2MoO42H2O0.25硫酸铜CuSO45H2O0.025氯化钴CoCl26H2O0.025铁盐乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA37.25硫酸亚铁FeSO47H2O27.85有机甘氨酸2.0盐酸硫胺素0.1盐酸吡哆醇0.5烟酸0.5肌醇100DB34/T35432019AA附录A（资料性附录）MS培养基成分表表A.1MS培养基成分表单位：mgL-1_4