【生物课件】基因工程的基本操作程序 2023-2024学年高二生物同步备课精选课件（人教版2019选择性必修3）.pptx

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1、教学目标：教学目标：1、阐明基因工程的原理和基本操作程序。2、针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。3、尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。教学重点：教学重点：1、基因工程基本操作程序的四个步骤。2、DNA片段的扩增及电泳鉴定。教学难点教学难点：1、利用PCR获得和扩增目的基因。2、DNA片段的扩增和电泳鉴定。高中生物学选择性必修3第第3 3章章 基因工程基因工程第第2 2节节 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序DNA片段基因1 基因2 基因3放大终止子非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 启动子补充：

2、基因的结构补充：基因的结构转录起点转录起点转录终点转录终点原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子不编码蛋白质。不编码蛋白质。：编码蛋白质：编码蛋白质 ,连续不间断连续不间断编码区编码区非编码区非编码区原核细胞的原核细胞的基因结构基因结构调控遗传信息表达调控遗传信息表达,上游有启动子，下游有上游有启动子，下游有终止子终止子真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点

3、内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 真核细胞的真核细胞的基因结构基因结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用有调控作用,上游有启动子，下游有终止子上游有启动子，下游有终止子非编码序列：非编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子培育转基因抗虫棉的简要过程培育转基因抗虫棉的简要过程苏云金杆菌苏云金杆菌普通棉花普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞棉花细胞抗虫棉抗虫棉抗虫基因抗虫基因（Bt抗虫蛋白基因）重组重组DNADNA分子分

4、子1.1.目的基因的目的基因的筛选与获取筛选与获取2.2.基因表达载体基因表达载体的构建的构建（核心）（核心）3.3.将目的基因将目的基因导入受体细胞导入受体细胞4.4.目的基因的目的基因的检测与鉴定检测与鉴定具体的步骤？具体的步骤？(含抗虫基因）（含有并表达抗虫基因）第一步：目的基因的筛选与获取第一步：目的基因的筛选与获取（一）目的基因（一）目的基因 在基因工程的设计和操作中，用于在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状改变受体细胞性状的或的或获得预获得预期表达产物期表达产物的基因。的基因。目的基因目的基因主要是指主要是指编码蛋白编码蛋白质的基因质的基因抗逆性基因抗逆性基因生产药物基因

5、生产药物基因毒物降解基因毒物降解基因工业用酶基因工业用酶基因苏云金杆菌（苏云金杆菌（BtBt）制成的生物杀虫制成的生物杀虫剂剂广泛用于防治棉花虫害广泛用于防治棉花虫害对对BtBt基因的基因的表达产物表达产物-Bt-Bt抗虫蛋白有较为深抗虫蛋白有较为深入的了解：入的了解：苏云金杆菌通过产生苏云金杆苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白，破坏鳞翅目昆虫的消化菌伴孢晶体蛋白，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫系统来杀死棉铃虫苏云金杆菌的杀虫作用与苏云金杆菌的杀虫作用与BtBt基因基因有关有关掌握了掌握了BtBt基因的基因的序列信息序列信息BtBt基因是培育转基因抗虫基因是培育转基因抗虫棉较为合适

6、的目的基因棉较为合适的目的基因如何筛选目的基因？如何筛选目的基因？BtBt基因的筛选过程：基因的筛选过程：（二）筛选合适的目的基因（二）筛选合适的目的基因1.1.较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。2.2.技术手段：技术手段：第一步：目的基因的筛选与获取第一步：目的基因的筛选与获取测序技术序列数据库(如GenBank)序列比对工具(如BLAST)测定核酸和蛋测定核酸和蛋白质序列白质序列以碱基顺序或氨基酸残以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分基顺序为基本内容的分子生物信息数据库子生物信息数据库把感兴趣的序列跟

7、已经存在的序列把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。基因和蛋白质的功能。1 1、人工合成、人工合成我国首批转基因抗虫棉的培育使用我国首批转基因抗虫棉的培育使用第一步：目的基因的筛选与获取第一步：目的基因的筛选与获取（三）目的基因的获取（三）目的基因的获取序列已知，基因比较小序列已知，基因比较小 DNADNA合成仪合成仪常用方法常用方法聚合酶链式反应聚合酶链式反应 根据根据DNADNA半保留复制半保留复制的原理，在的原理，在体外体外提供参与提供参与DNADNA复制的

8、各种组复制的各种组分与反应条件，对分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制目的基因的核苷酸序列进行大量复制。2 2、利用利用PCRPCR获取和扩增目的基因获取和扩增目的基因第一步：目的基因的筛选与获取第一步：目的基因的筛选与获取(1)PCR:(1)PCR:体内体内DNADNA复制的过程复制的过程体内体内DNA复制参与的组分复制参与的组分在在DNA复制中的作用复制中的作用PCR中参与的组分中参与的组分打开打开DNA双链双链提供提供DNA复制的模板复制的模板合成子链的原料合成子链的原料催化合成催化合成DNA子链子链使使DNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的3端端开始连接脱氧核苷酸开始连

9、接脱氧核苷酸解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物(通常为小的单链RNA)体内体内DNADNA复制的过程复制的过程PCRPCR的过程的过程体内体内DNA复制参与的组分复制参与的组分在在DNA复制中的作用复制中的作用PCR中参与的组分中参与的组分打开打开DNA双链双链提供提供DNA复制的模板复制的模板合成子链的原料合成子链的原料催化合成催化合成DNA子链子链使使DNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的3端端开始连接脱氧核苷酸开始连接脱氧核苷酸解旋酶解旋酶DNADNA母链母链4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNA聚合酶聚合酶引物引物(通常为小的单链通常为小的单链RNARNA)无需解旋

10、酶，用高温代替无需解旋酶，用高温代替DNADNA母链母链4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶引物引物(通常为小的单链通常为小的单链DDNANA)反应还需要其它条件，如缓冲液（添加反应还需要其它条件，如缓冲液（添加MgMg2+2+等）等）PCRPCR的过程的过程第一步：目的基因的筛选与获取第一步：目的基因的筛选与获取(2)PCR(2)PCR反应的条件：反应的条件：模板：模板：原料：原料：引物：引物：酶：酶：缓冲液（含缓冲液（含MgMg2+2+）：）：不同温度不同温度第一步：目的基因的筛选与获取第一步：目的基因的筛选与获取(3)(3)引物：引物：一小段能与一小段能

11、与DNADNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCRPCR的的引物长度通常为引物长度通常为20-3020-30个核苷酸。个核苷酸。为什么要有引物？为什么要有引物？引物为引物为DNADNA聚合酶提供了游离的聚合酶提供了游离的33端，使端，使DNADNA聚合酶从聚合酶从33端延伸子链。端延伸子链。(DNA(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能聚合酶不具有从头合成子链的功能)作用：作用：如何设计引物？如何设计引物？设计引物设计引物已知：已知：Cry1Ab基因全序列基因全序列 702bp5 5 1 aaatgtgccc atcattccca tc

12、atttctcc ttggacattg atgttggatg tacagactta1 aaatgtgccc atcattccca tcatttctcc ttggacattg atgttggatg tacagactta 61 aatgaggact taggtgtatg ggcgatattc aagattaaga cgcaagatgg ccatgcaaga 61 aatgaggact taggtgtatg ggcgatattc aagattaaga cgcaagatgg ccatgcaaga 121 ctaggaaatc tagagtttct cgaagagaaa ccattagtag gggaa

13、gcact agctcgtgtg 121 ctaggaaatc tagagtttct cgaagagaaa ccattagtag gggaagcact agctcgtgtg 181 aaaagagcgg agaaaaaatg gagagacaaa cgtgaaaaat tggaattgga aacaaatatt 181 aaaagagcgg agaaaaaatg gagagacaaa cgtgaaaaat tggaattgga aacaaatatt 241 gtttataaag aggcaaaaga atctgtagat gctttatttg taaactctca atatgataga 241

14、 gtttataaag aggcaaaaga atctgtagat gctttatttg taaactctca atatgataga 301 ttacaagcgg ataccaacat cgcgatgatt catgcggcag ataaacgcgt tcatagcatt 301 ttacaagcgg ataccaacat cgcgatgatt catgcggcag ataaacgcgt tcatagcatt 361 cgagaagcat atcttccaga gttatctata attccgggtg taaatgcggg cattttcgaa 361 cgagaagcat atcttcca

15、ga gttatctata attccgggtg taaatgcggg cattttcgaa 421 gaattagagg gacgtattta cacagcctac tctctatatg gtgcgagaaa tgtcattaaa 421 gaattagagg gacgtattta cacagcctac tctctatatg gtgcgagaaa tgtcattaaa 481 aatggcgatt tcgataatgg cttattatgc tggaacgtga aagggcatgt agatgtagaa 481 aatggcgatt tcgataatgg cttattatgc tggaac

16、gtga aagggcatgt agatgtagaa 541 gaacaaaaca atcaccgttc agttctggtt atcccagaat gggaagcaga agtgtcacaa 541 gaacaaaaca atcaccgttc agttctggtt atcccagaat gggaagcaga agtgtcacaa 601 gaagttcgtg tctgtccagg acgtggctat atccttcgtg ttacagcgta caaagaggga 601 gaagttcgtg tctgtccagg acgtggctat atccttcgtg ttacagcgta caaa

17、gaggga 661 tatggagagg gcttcgtaac gatccatgag atcgaagaca at 661 tatggagagg gcttcgtaac gatccatgag atcgaagaca at 3 3设计引物设计引物1.1.设计几种引物？原因？设计几种引物？原因？2.2.设计引物的依据？设计引物的依据？3.3.引物的选择？引物的选择？4.4.请同学们设计引物的核苷酸序列请同学们设计引物的核苷酸序列5335A AB BC CDD 已知：已知：Cry1Ab基因全序列基因全序列 702bp 5 51 aaatgtgccc atcattccca tcatttctcc ttgga

18、cattg atgttggatg tacagactta1 aaatgtgccc atcattccca tcatttctcc ttggacattg atgttggatg tacagactta 61 aatgaggact taggtgtatg ggcgatattc aagattaaga cgcaagatgg ccatgcaaga 61 aatgaggact taggtgtatg ggcgatattc aagattaaga cgcaagatgg ccatgcaaga 121 ctaggaaatc tagagtttct cgaagagaaa ccattagtag gggaagcact agctcgtg

19、tg 121 ctaggaaatc tagagtttct cgaagagaaa ccattagtag gggaagcact agctcgtgtg 181 aaaagagcgg agaaaaaatg gagagacaaa cgtgaaaaat tggaattgga aacaaatatt 181 aaaagagcgg agaaaaaatg gagagacaaa cgtgaaaaat tggaattgga aacaaatatt 241 gtttataaag aggcaaaaga atctgtagat gctttatttg taaactctca atatgataga 241 gtttataaag ag

20、gcaaaaga atctgtagat gctttatttg taaactctca atatgataga 301 ttacaagcgg ataccaacat cgcgatgatt catgcggcag ataaacgcgt tcatagcatt 301 ttacaagcgg ataccaacat cgcgatgatt catgcggcag ataaacgcgt tcatagcatt 361 cgagaagcat atcttccaga gttatctata attccgggtg taaatgcggg cattttcgaa 361 cgagaagcat atcttccaga gttatctata

21、attccgggtg taaatgcggg cattttcgaa 421 gaattagagg gacgtattta cacagcctac tctctatatg gtgcgagaaa tgtcattaaa 421 gaattagagg gacgtattta cacagcctac tctctatatg gtgcgagaaa tgtcattaaa 481 aatggcgatt tcgataatgg cttattatgc tggaacgtga aagggcatgt agatgtagaa 481 aatggcgatt tcgataatgg cttattatgc tggaacgtga aagggcatg

22、t agatgtagaa 541 gaacaaaaca atcaccgttc agttctggtt atcccagaat gggaagcaga agtgtcacaa 541 gaacaaaaca atcaccgttc agttctggtt atcccagaat gggaagcaga agtgtcacaa 601 gaagttcgtg tctgtccagg acgtggctat atccttcgtg ttacagcgta caaagaggga 601 gaagttcgtg tctgtccagg acgtggctat atccttcgtg ttacagcgta caaagaggga 661 tat

23、ggagagg gcttcgtaac gatccatgag atcgaagaca at 661 tatggagagg gcttcgtaac gatccatgag atcgaagaca at 3 3任务三任务三设计引物设计引物5.5.某同学设计的两组引物（只标记了部分碱基序列）如下，请评价引物设计某同学设计的两组引物（只标记了部分碱基序列）如下，请评价引物设计是否合理？若不合理，请分析说明理由。是否合理？若不合理，请分析说明理由。第第1 1组引物组引物引物引物引物引物C A G G C TC A G G C TA G C C T GA G C C T G第第2 2组引物组引物引物引物引物引物A

24、A C T G C A G T TA A C T G C A G T TC G A C T G A T T AC G A C T G A T T A53533355第一步：目的基因的筛选与获取第一步：目的基因的筛选与获取 设计引物：设计引物：依据：依据：目的基因两端特异性较高的核苷酸序列目的基因两端特异性较高的核苷酸序列种类：种类：2 2种；确保种；确保DNADNA的两条链同时被扩增的两条链同时被扩增要求：要求：长度不宜过短；引物之间和引物内部不发生碱基互补配对等长度不宜过短；引物之间和引物内部不发生碱基互补配对等扩增次数扩增次数1次2次3次n次DNADNA分子数分子数同时含引物同时含引物A

25、A、B B的的DNADNA分子数分子数共消耗的共消耗的引物数量引物数量完整的目的基因完整的目的基因PCRPCR扩增扩增DNADNA规律规律扩增次数扩增次数1次2次3次n次DNADNA分子数分子数同时含引物同时含引物A A、B B的的DNADNA分子数分子数共消耗的共消耗的引物数量引物数量完整的目的基因完整的目的基因2 22 20 04 46 68 814142 26 62 2n n2 2n+1n+1-2-22 2n n-2-2PCRPCR扩增扩增DNADNA规律规律0 00 02 22 2n n-2n-2n第一步：目的基因的筛选与获取第一步：目的基因的筛选与获取(5)PCR(5)PCR扩增产物

26、的鉴定扩增产物的鉴定 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 在电场作用下，带电分子会向着与在电场作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳就是电泳 影响影响DNADNA迁移速率的因素：迁移速率的因素：凝胶的浓度、凝胶的浓度、DNADNA分子的大小和构象等。分子的大小和构象等。原理：原理：检测：检测：凝胶中的凝胶中的DNADNA分子通过染色，在分子通过染色，在300nm300nm的紫外灯下被检测出来。的紫外灯下被检测出来。第一步：目的基因的筛选与获取第一步：目的基因的筛选与获取(5)PCR(5)PCR扩增产物的鉴定扩增产物的鉴定 琼脂糖凝胶电泳琼

27、脂糖凝胶电泳 当电泳结束时，比较当电泳结束时，比较DNADNA样品样品所在的位置和一系列已知大小的所在的位置和一系列已知大小的DNADNA片段的位置片段的位置(标准标准)，这些已，这些已知大小的片段称为知大小的片段称为DNADNA分子量标分子量标准样。准样。用用PCRPCR可以扩增可以扩增mRNAmRNA吗吗？mRNAmRNA不可以直接扩增，需要将它不可以直接扩增，需要将它逆转录逆转录成成cDNAcDNA再进行扩增。再进行扩增。核酸酶核酸酶HH：降解降解RNA-DNARNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNARNA链链 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片段

28、片段，导入到，导入到受体受体菌菌的群体中的群体中储存储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为因，称为基因文库基因文库。（2 2）基因文库的种类：）基因文库的种类：基因基因组组文库：文库：部分部分基因文库：基因文库：含有一种生物含有一种生物所有所有基因的文库基因的文库只含有一种生物只含有一种生物部分部分基因的文库基因的文库（如：（如：cDNAcDNA文库）文库）第一步：目的基因的筛选与获取第一步：目的基因的筛选与获取3 3、从基因文库中获取、从基因文库中获取（1 1）基因文库：）基因文库：提取某种生物的全部DNA许多一定大小的DNA片段导入受体菌中储存

29、用适当的限制酶切将DNA片段与载体连接基因组文库基因组文库基因组文库的构建模式图的构建模式图第一步：目的基因的筛选与获取第一步：目的基因的筛选与获取某种生物的mRNA单链互补DNA双链DNA片段 反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNA 聚合酶cDNA文库成熟成熟mRNAmRNA与载体连接导入受体菌中储存部分基因文库部分基因文库的构建模式图的构建模式图第一步：目的基因的筛选与获取第一步：目的基因的筛选与获取思考：能不能直接将目的基因导入受体细胞，为什么？思考：能不能直接将目的基因导入受体细胞，为什么？如果不能，如何避免该结果的发生呢？如果不能，如何避免该结果的发生呢？游离的游离的DNADNA片段进入

30、受体细胞，一般会直接被分解，且游离片段进入受体细胞，一般会直接被分解，且游离的的DNADNA片段不能稳定遗传。片段不能稳定遗传。构建基因表达载体构建基因表达载体（核心核心工作）1.1.目的：目的：2.2.组成：组成：使目的基因在受体细胞中使目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在，且，且可以遗传可以遗传给下一代；给下一代；使目的基因能够使目的基因能够在受体细胞中在受体细胞中表达和发挥作用表达和发挥作用。第二步：基因表达载体的构建（第二步：基因表达载体的构建（核心核心）质粒标记基因复制原点启动子终止子限制酶切位点质粒标记基因复制原点启动子终止子限制酶切位点诱导型启动子诱导物作用激活激活或抑制抑制目的

31、基因表达第二步：基因表达载体的构建（第二步：基因表达载体的构建（核心核心）黏性末端黏性末端（平末端）的切口（平末端）的切口质粒（载体）质粒（载体）DNADNA分子（含目的基因）分子（含目的基因）相同相同黏性末端黏性末端（平末端）的切口（平末端）的切口DNA DNA 连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同种限制酶同种限制酶（或产生相同末端的限制酶）（或产生相同末端的限制酶）3 3.过程：过程：第二步：基因表达载体的构建（第二步：基因表达载体的构建（核心核心）根根据据目目的的基基因因两两端端的的限限制制酶酶切切割割位位点点、质质粒粒上上的的限限制制酶酶切切割割位位点点以

32、以及及是是否否破坏目的基因和标记基因等来确定限制酶的种类。破坏目的基因和标记基因等来确定限制酶的种类。拓展：限制酶的选择方法拓展：限制酶的选择方法 将生物的所有将生物的所有DNADNA直接导入受体细胞不是更简便吗？直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样如果这么做，效果会怎样？这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体细胞受体细胞 由于不同转基因产品所需要的目的基因不同，受体细胞又有植物、动物、微生由于不同转基因产品所需要的目的基因不同，受体细胞又有植物、动物、微生物之分，因此物之分，因此基因表达载体的构建方法不

33、是千篇一律的基因表达载体的构建方法不是千篇一律的,将目的基因导入受体细将目的基因导入受体细胞的方法也不是完全相同的。胞的方法也不是完全相同的。第三步：将目的基因导入受体细胞第三步：将目的基因导入受体细胞转化：转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定维持稳定和和表达表达的过程。的过程。基因表达载体基因表达载体受体细胞受体细胞导入导入动物动物植物植物微生物微生物第三步：将目的基因导入受体细胞第三步：将目的基因导入受体细胞（一）将目的基因导入植物细胞（一）将目的基因导入植物细胞1 1、花粉管通道法、花粉管通道法我国独创，将我国独创，将BtBt基因

34、导入棉花细胞。基因导入棉花细胞。用微量注射器将含有目的基因的用微量注射器将含有目的基因的DNADNA溶液直溶液直接注入子房中接注入子房中 在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNADNA溶液滴加到花柱切面上，使目的基因借助溶液滴加到花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。花粉管通道进入胚囊。子房注射：子房注射：花柱滴加：花柱滴加：萌发的萌发的花粉管花粉管花柱花柱子房子房胚囊胚囊柱头柱头卵细胞卵细胞2 2、农杆菌转化法、农杆菌转化法双子叶植物和裸子植物双子叶植物和裸子植物TiTi质粒质粒T-DNAT-DNA农杆菌农杆菌第三步：将目的基因导入受体细胞第

35、三步：将目的基因导入受体细胞（1 1）主要适用于：主要适用于：（2 2）特点：）特点：农杆菌农杆菌TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA（可转移的（可转移的DNADNA）转移到被侵染的细胞，并将其整合）转移到被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的染色体到该细胞的染色体DNADNA上。上。转化方法的突破，用农杆菌侵染转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。得了成功。TiTi质粒质粒目的基因目的基因构建表构建表达载体达载体含目的基因的重含目的基因的重组组TiTi质粒质粒转入转入农杆菌农杆菌含重组含重组TiTi质粒的农杆菌质粒的农杆菌植物细

36、胞植物细胞导入植导入植物细胞物细胞表现出新性状表现出新性状的植物的植物将目的基因插入染将目的基因插入染色体色体DNADNA中中第三步：将目的基因导入受体细胞第三步：将目的基因导入受体细胞（3 3）过程：）过程：1 1、常用方法、常用方法：2 2、受体细胞、受体细胞:显微注射法显微注射法受精卵受精卵体积大，易操作。体积大，易操作。易表现出全能性易表现出全能性。3 3、过程：过程：构建基因表达载体构建基因表达载体并并提纯提纯利用利用显微注射显微注射将基因表达载体将基因表达载体注入动物的注入动物的受精卵受精卵中中早期胚胎培养早期胚胎培养胚胎移植胚胎移植获得获得具有新性状的动物具有新性状的动物第三步：

37、将目的基因导入受体细胞第三步：将目的基因导入受体细胞（二）将目的基因导入动物细胞（二）将目的基因导入动物细胞CaCa2+2+处理处理使细胞处于一种能够吸收周围环境中的使细胞处于一种能够吸收周围环境中的DNADNA分子的生理状态（感受态）分子的生理状态（感受态）CaCa2+2+处理细胞处理细胞重组基因表达载体导入细胞重组基因表达载体导入细胞Ca2+吸收原核细胞原核细胞（常选择大肠杆菌）（常选择大肠杆菌）第三步：将目的基因导入受体细胞第三步：将目的基因导入受体细胞（三）将目的基因导入微生物细胞（三）将目的基因导入微生物细胞1 1、常用菌、常用菌：2 2、转化方法、转化方法:3 3、过程：、过程：将

38、基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？不一定！不一定！第四步：目的基因的检测与鉴定第四步：目的基因的检测与鉴定 在抗虫棉的培育过程中，目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和在抗虫棉的培育过程中，目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道BtBt基因基因mRNAmRNABtBt抗虫蛋白抗虫蛋白抗虫棉抗虫棉PCRPCR等技术检测等技术检测抗原抗原 抗体杂交技术抗

39、体杂交技术分子分子水平水平抗虫鉴定抗虫鉴定（个体水平个体水平）第四步：目的基因的检测与鉴定第四步：目的基因的检测与鉴定（一）分子水平的检测（一）分子水平的检测1 1、检测目的基因是否导入、检测目的基因是否导入PCRPCR技术检测技术检测提取棉花提取棉花细胞细胞DNADNA用与用与BtBt基因相关的基因相关的引物进行引物进行PCRPCR扩增扩增对扩增产物对扩增产物进行检测进行检测DNADNA半保留复制半保留复制 根据目的基因特点，设计特定引物根据目的基因特点，设计特定引物 是否扩增出目的基因（电泳检测）是否扩增出目的基因（电泳检测）方法二：方法二：DNADNA分子交杂技术分子交杂技术变性变性 提

40、取目的基因的提取目的基因的DNADNA片段用放射性同位素标记，作为基因探针；片段用放射性同位素标记，作为基因探针；使探针与转基因生物基因组杂交，若出现使探针与转基因生物基因组杂交，若出现杂交带，杂交带，则导入成功。则导入成功。原理：碱基互补配对原则第四步：目的基因的检测与鉴定第四步：目的基因的检测与鉴定第四步：目的基因的检测与鉴定第四步：目的基因的检测与鉴定2 2、检测目的基因是否转录、检测目的基因是否转录PCRPCR技术检测技术检测 提取受体细胞提取受体细胞mRNAmRNA提取棉花细胞提取棉花细胞mRNAmRNA逆转录逆转录产生产生DNADNA对扩增产物进对扩增产物进行检测行检测用与用与Bt

41、Bt基因相关的基因相关的引物进行引物进行PCRPCR扩增扩增逆转录逆转录 cDNAcDNAPCRPCR扩增扩增制作基因探针；制作基因探针；探针和转基因生物的探针和转基因生物的mRNAmRNA杂交杂交,若出现杂交带若出现杂交带,表明转录出了表明转录出了mRNAmRNA。变性变性变性变性探针探针1515N N N N1515N N N N转基因生物转基因生物的的mRNAmRNA杂交分子杂交分子杂交分子杂交分子（可检测）（可检测）（可检测）（可检测）原理：碱基互补配对原则原理：碱基互补配对原则分子杂交分子杂交方法二：方法二：第四步：目的基因的检测与鉴定第四步：目的基因的检测与鉴定第四步：目的基因的检

42、测与鉴定第四步：目的基因的检测与鉴定3 3、检测目的基因是否翻译：、检测目的基因是否翻译：抗原抗原-抗体杂交抗体杂交从棉花中从棉花中提取蛋白质提取蛋白质用相应抗体进行用相应抗体进行抗原抗原-抗体杂交检测抗体杂交检测苏云金芽孢杆菌提取Bt毒蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白抗原抗体杂交脱分化第四步：目的基因的检测与鉴定第四步：目的基因的检测与鉴定（二）个体水平的鉴定（二）个体水平的鉴定如：检测抗虫棉是否具有抗虫性状如：检测抗虫棉是否具有抗虫性状观察棉铃虫观察棉铃虫存活情况存活情况饲喂饲喂棉铃虫棉铃虫采摘抗虫采摘抗虫棉叶片棉叶片转基因生物转基因生物鉴定方法鉴定方法成功标志成功标志抗虫植物抗虫植物抗病毒（菌）植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗盐植物抗除草剂植物抗除草剂植物获取目的基因产物的获取目的基因产物的转基因生物转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡害虫死亡病毒（菌）接种实验病毒（菌）接种实验未染病未染病盐水浇灌盐水浇灌正常生长正常生长喷洒除草剂喷洒除草剂正常生长正常生长提取细胞产物与天然产品进行提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能活性比较功能、活性正常功能、活性正常u抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等第四步：目的基因的检测与鉴定第四步：目的基因的检测与鉴定（二）个体水平的鉴定（二）个体水平的鉴定