【生物课件】重组DNA技术的基本工具 2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3.pptx

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1、重组DNA技术的基本工具 基因工程基因工程 糖糖尿尿病病是是一一种种常常见见内内分分泌泌疾疾病病，为为了了治治疗疗糖糖尿尿病病，有有的的病病人人要要经经常常注注射射胰胰岛岛素素。如何获取胰岛素如何获取胰岛素？20世纪20年代，人们开始从猪、牛胰腺中提取胰岛素。但是，从动物胰腺中提取胰岛素成本高、产量低。而且猪胰岛素与人胰岛素有1个氨基酸不同，容易发生免疫反应。方案1：动物体内提取 日本研究人员将分泌胰岛素的胰岛细胞与拥有增殖能力的干细胞融合到一起,形成一种新细胞,移植到患有重度糖尿病的大鼠体内之后,显著改善了大鼠的症状。方案2：人工合成方案3：动物细胞融合技术 1965年，世界上第一个人工合成

2、的蛋白质牛胰岛素在中国诞生，这是世界上第一次人工合成与天然胰岛素分子相同化学结构并具有完整生物活性的蛋白质。方案4：发酵工程 利用 大肠杆菌生产人的胰岛素。转基因转基因方案可行么？理论基础？人的胰岛人的胰岛素基因素基因大肠大肠杆菌杆菌剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达载体载体检测鉴定检测鉴定表达产物表达产物人的组人的组织细胞织细胞提取提取研究过程中遇到了困惑：切割后的DNA片段往往不能进行复制并很容易在细胞中降解。Herbert Wayne Boyer（具备（具备在受体细胞中独在受体细胞中独立复制性能立复制性能的的 DNA DNA 分子）分子）【问题1】胰岛素基因能够进入大肠杆菌么？该变异可以遗

3、传么？基因工程基因工程诞生的理论基础诞生的理论基础 质质粒粒是是一一种种裸裸露露的的、结结构构简简单单、独独立立于于真真核核细细胞胞细细胞胞核核或或原原核核细细胞胞拟拟核核DNA之之外外，并并具具有有自自我我复复制制能能力力的的环环状状双双链链DNA分分子子。理论基础1.DNA的基本组成单位相同(都是四种脱氧核苷酸)2.都遵循碱基互补配对原则3.DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构 理论基础理论基础1.基因是控制生物性状的结构与功能单位2.遗传信息传递都遵循中心法则3.生物界几乎共用一套遗传密码【问题2】为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？【问题3】为什么一种生物的基因可以在另一种生物细

4、胞内表达？基因工程基因工程诞生的理论基础诞生的理论基础基因工程基因工程 基基因因工工程程是是指指在在体体外外通通过过人人工工“剪剪切切”和和“拼拼接接”等等方方法法，将将外外源源目目的的基基因因与与载载体体DNA进进行行组组合合形形成成重重组组DNA，然然后后导导入入受受体体细细胞胞，并并使使其其在在受受体体细胞中表达细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。，产生人类需要的基因产物的技术。归纳定义归纳定义工程别名重组DNA技术 转基因技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平基本过程剪切拼接导入表达原理基因重组基因工程基因工程分子分子运输车运输车分子手术刀分子手术刀分子缝合针分子

5、缝合针 DNADNA分分子子直直径径只只有有2nm,2nm,要要想想实实现现这这样样一一个个精精确确的的过过程程，我我们们应应该该选选择择具具有有什么功能的工具来对什么功能的工具来对DNADNA分子进行操作呢分子进行操作呢?5335 和和 交替交替连接，排列在外连接，排列在外侧，侧，构成构成 ；排列排列在内侧。在内侧。两两条条链链上上的的碱碱基基通通过过 连连接接成成碱碱基基对对，且且遵遵循循 。DNADNA是是由由两两条条单单链链组组成成的的，这这两两条条链链按按 方式方式盘旋成双螺旋结构。盘旋成双螺旋结构。反向平行反向平行脱氧核糖脱氧核糖磷酸磷酸碱基碱基基本骨架基本骨架氢键氢键碱基互补配对

6、原则碱基互补配对原则 回顾回顾DNA磷酸二酯键 ATGCCGTGGAATTCC ATGCCGTGGAATTCC TACGGCACCTTAAGG TACGGCACCTTAAGG 磷酸磷酸二酯键二酯键氢键氢键01“分子手术刀分子手术刀”带32P放射性标记的病毒侵染未标记的细菌没有病毒释放没有在细菌中检测到放射性DNA 推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么?切切割割外外源源DNADNA使使之之失失效效，从从而而达到保护自身的目的。达到保护自身的目的。推测未能检测到放射性的原因推测未能检测到放射性的原因?保温一段时间保温一段时间推测：该菌具有推测：该菌具有剪切外源剪切外源DNADNA作用的酶作用

7、的酶。史密斯限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。EcoR 识别的序列？催化断开的化学键？EcoREcoR 酶切形成的末端都一样，说明限制酶的作用有什么特点？53535335353501限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶-“分子手术刀分子手术刀”EcoR：大大肠肠杆杆菌菌（Escherichia coli）R型型菌株中分离出的第一个菌株中分离出的第一个限制酶。限制酶。EcoR 种加词头两个字母菌株型号数字表示分离出来的第几种限制酶属名首字母01黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端只能识别只能识别

8、GAATTCGAATTC序列，并在序列，并在G G和和A A之间切开。之间切开。被限制酶切开的被限制酶切开的DNADNA两条单链的切口，两条单链的切口，带有几个带有几个伸出的核苷酸，他们之间正，他们之间正好好互补配对，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端。EcoR I 限制酶的切割：限制酶的切割：01限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶-“分子手术刀分子手术刀”Hind Sma Xma BamH Bgl 5GAATTC33CTTAAG55CCCGGG33GGGCCC55GGATCC33CCTAGG55AGATCT33TCTAGA55CCCGGG33GGGCCC5 识别序列都可以找到一条中轴线，中轴线

9、两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列，即即在在切切割割位位点点，DNADNA一一条链条链和它的反向互补链的序列一样和它的反向互补链的序列一样。图中为限制酶识别位点，三角标示酶切位置。观察不同限制酶的识别序列，分析限制酶的识别序列在碱基的排列顺序上有什么特点?Hind Sma Xma BamH Bgl 5GAATTC33CTTAAG55CCCGGG33GGGCCC55GGATCC33CCTAGG55AGATCT33TCTAGA55CCCGGG33GGGCCC55G3CTTAAAATTC3G55CCC3GGGGGG3CCC55C3GGGCCCCGGG3C55G3CCTAGGA

10、TCC3G55A3TCTAGGATCT3A51.1.所有所有限制酶限制酶的切割结果的切割结果都是黏性末端都是黏性末端?2.2.有没有哪些限制酶的切割产生了相同的黏性末端？有没有哪些限制酶的切割产生了相同的黏性末端？思考：01限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶-“分子手术刀分子手术刀”主要来自主要来自原核生物原核生物数千种数千种限制酶限制酶不是一种酶，而是一类酶。不是一种酶，而是一类酶。来源来源种类种类特点特点能能识识别别双双链链 DNA 分分子子的的特特定定核核苷苷酸酸序序列列，并使每一条链中特定部位的并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。作用部位作用部位识别序列长度识别序列长

11、度特定切点上的特定切点上的磷酸二酯键磷酸二酯键大多数是大多数是6个核苷酸序列个核苷酸序列结果结果产生产生黏性末端黏性末端或或平末端平末端01限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶-“分子手术刀分子手术刀”胰岛素基因TAGGATCCGCGAATTCTTATCCTAGGCGCTTAAGAATCCGAATTCCAAGCTTAGGCTTAAGGTTCGAA请用剪刀模拟EcoRI的识别序列和切割位点将目的基因“切割”下来。要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性可产生几个黏性(平平)末端？末端？要切要切2 2个切口，产生个切口

12、，产生4 4个黏性个黏性(平平)末端。末端。5533识别识别GAATTCGAATTC序列，并在序列，并在G G和和A A之间切开。之间切开。GAATTCCTTAAG02限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶-“分子手术刀分子手术刀”怎样把切割下来的胰岛素基因和环形怎样把切割下来的胰岛素基因和环形DNADNA载体连接起来？载体连接起来？缺口缺口怎么办？怎么办？这两个片段之间能连上么？这两个片段之间能连上么？切割载体的限制酶有什么要求切割载体的限制酶有什么要求？02 A A T T GCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶 DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶？02“分子缝合针分子缝合针

13、”推测：自然界中存在一种酶能将断开的DNA连接起来么？作作用用：将将单单个个脱脱氧氧核核苷苷酸酸依依次次连连接到单链接到单链末端末端。171702（1 1）E.coli DNA连接酶连接酶或或T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接黏连接黏性末端性末端02DNA连接酶连接酶-“分子缝合针分子缝合针”可把黏性末端之间的缝隙可把黏性末端之间的缝隙“缝合缝合”起来起来，02（2 2）T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶连接连接平平末端末端02DNA连接酶连接酶-“分子缝合针分子缝合针”T4 DNA连连接接酶酶黏黏性性末末端端与与平平末末端端均均可可连连接接，但，但连接平末端的效率相对比较低。连接平末

14、端的效率相对比较低。将将双双链链 DNA双双链链片片段段“缝缝合合”起起来来，恢恢复复被被限限制制酶酶切开的两个核苷酸之间的切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯磷酸二酯键键。作用作用02DNA连接酶连接酶-“分子缝合针分子缝合针”名称名称作用部位作用部位作用作用结果结果（反应物（反应物产物）产物）限制酶磷酸二酯键 将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端解旋酶碱基对之间的氢键将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链归纳总结几种相关酶的比较1.限制酶的作用特点、结果?体现了酶的什么特性?两种DNA连接

15、酶的区别?且目的基因与载体用什么切割后，通过什么连接从而形成基因表达载体?2.限制酶和DNA解旋酶，DNA 连接酶、DNA 聚合酶的作用部位的区别？如何连接DNA的平末端?3.基因工程的原理?基因工程常用的工具酶?4.画出下边3种酶切割后的末端 G A A T T C C T T A A G A A T T T T A A G G G C C C C C C G G G 3.某质粒上有3个限制酶A识别位点,如图所示。用一定量的限制酶A短暂处理足量的该质粒后电泳分离。在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小和构象等有关,则可得电泳条带数目是()A.7B.8C.9D.10一段DNA被多种限制

16、性核酸内切酶进行切割，通过电泳对其进行分离,获得的数据如下:(1)起始DNA是线状的还是环状的?(2)绘制一幅酶切位点图,同比例反映上述数据。酶片段数量片段大小（kb）EcoR 21.5kb1.5kbHind 13.0kbEcoR+Hind 30.8kb0.7kb1.5kb尝试把载体酶切后，将载体和目的基因连接。尝试把载体酶切后，将载体和目的基因连接。思考实际连接中还可能出现哪些连接方式？思考实际连接中还可能出现哪些连接方式？02DNA连接酶连接酶-“分子缝合针分子缝合针”需要的重组质粒目的基因目的基因和质粒环化和质粒环化目的基因目的基因和质粒环化和质粒环化目的基因目的基因质质 粒粒目的基因目

17、的基因和质粒环化和质粒环化两目的基因两目的基因环化环化两质粒两质粒环化环化质质 粒粒自我环化自我环化目的基因目的基因自我环化自我环化尝试把载体酶切后，将载体和目的基因连接。尝试把载体酶切后，将载体和目的基因连接。02DNA连接酶连接酶-“分子缝合针分子缝合针”连出来的重组连出来的重组DNADNA一样么一样么？思考：思考：对基因工程操作有什么影响？如何改进酶切，才能让目的基因与载体正确相连？02DNA连接酶连接酶-“分子缝合针分子缝合针”目的基因质粒质粒目的基因目的基因需要的重组质粒目的基因目的基因和质粒环化和质粒环化两目的基因两目的基因环化环化两质粒两质粒环化环化质质 粒粒自我环化自我环化目的

18、基因目的基因自我环化自我环化两质粒两质粒环化环化两目的基因两目的基因环化环化目的基因目的基因和质粒环化和质粒环化单酶切的问题：目的基因、质粒的自身环化目的基因与质粒反向连接 双双酶酶切切法法：即在基因工程中使用2 种限制酶分别切割目的基因的两端，同时用上述2种限制酶切割质粒，然后用DNA 连接酶连接，以获得所需要重组质粒。目的基因质 粒质粒长片段和目的基因环化两目的基因环化质粒短片段和目的基因环化两质粒短片段环化两质粒长片段环化需要的重组质粒02DNA连接酶连接酶-“分子缝合针分子缝合针”03基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体-“分子运输车分子运输车”作用作用将目的基因转入受体细胞将

19、目的基因转入受体细胞&在受体细胞内对目的基因进行大量复制在受体细胞内对目的基因进行大量复制 种类种类质粒动植物病毒噬菌体（噬菌体的衍生物）质质粒粒是是一一种种裸裸露露的的、结结构构简简单单、独独立立于于真真核核细细胞胞细细胞胞核核或或原原核核细细胞胞拟拟核核DNA之之外外，并并具具有有自自我我复复制制能能力力的的环环状状双双链链DNA分分子子。质粒可以在细菌之间转移,从而使其他本不耐药的细菌获得耐药性。质粒03基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体-“分子运输车分子运输车”载体的作用有哪些？1.作为运载工具，将目的基因转移到受体中2.利用载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制，使目的基

20、因在受体细胞中能够表达和发挥作用1.分别写出DNA聚合酶、限制酶、解旋酶、DNA连接酶作用部位和作用结果。2.写出运载体需要具备的条件。（4个）3.写出两种DNA连接酶的名称及其对应的连接末端。4.写出DNA的基本单位的名称并画出DNA基本单位的结构，标注五碳糖上五个碳原子的编号。5.写出运载体的三种类型。03基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体-“分子运输车分子运输车”便于插入（携带）目的便于插入（携带）目的基因基因运载体需具备的条件能在受体细胞中稳定保存并复制能在受体细胞中稳定保存并复制有一个至多个限制酶切割位点有一个至多个限制酶切割位点具具有有标标记记基基因因，便便于于筛筛查查含

21、含有有重重组组DNA分分子的子的细胞细胞（抗生素抗性基因、具有颜色反应的基因）（抗生素抗性基因、具有颜色反应的基因）对受体细胞对受体细胞无害无害真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。大肠杆菌及质粒结构模式图03基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体-“分子运输车分子运输车”载体上标记基因的标记原理载体上标记基因的标记原理普通培养基不含抗生素选择培养基50g/ml四环素人的胰岛人的胰岛素基因素基因大肠大肠杆菌杆菌剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达载体载体检测鉴定检测鉴定表达产物表达产物人的组人的组织细胞织细

22、胞提取提取（具备（具备在受体细胞中独在受体细胞中独立复制性能立复制性能的的 DNA DNA 分子）分子）基因工程基因工程诞生的理论基础诞生的理论基础选择质粒酶切位点时有什么要求？保留复制起点至少保留一个标记基因限制酶DNA连接酶载体对受体细胞无害；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊的标记基因；能自我复制或能整合到宿主DNA上。质粒、噬菌体、动植物病毒基因工程的基本工具作为载体的条件种类：磷酸二酯键来源：主要来源于原核生物特点：作用部位：具有专一性结果：形成黏性末端或平末端连接部位：磷酸二酯键种类：E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶作用：把两条双链DNA片段拼接起来小结小结1基因工程的原

23、理是基因重组，此变异是定向的。()2DNA聚合酶也可以用作DNA重组技术的工具。()4不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。()5DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。()6载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等，其中动植物病毒必须是DNA病毒。()1.1.下面下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（哪项不具有限制酶识别序列的特征（）A AGAATTC GAATTC B BGGGGCCCC GGGGCCCC C CCTGCAG CTGCAG D DCTAAATCCTAAATC CTTAAG CCCCGGGG GACGTC GATTTAGCTTAAG CCCCGGGG GACG

24、TC GATTTAGD D2.2.下下图表示三种黏性末端图表示三种黏性末端，下列说法正确的是下列说法正确的是C CA A乙中的酶切位点在乙中的酶切位点在A A与与G G之间之间B B甲、乙、丙由两种限制酶作用产生甲、乙、丙由两种限制酶作用产生 C C若甲中的若甲中的G G处发生突变，限制酶可能无法识别该切割位点处发生突变，限制酶可能无法识别该切割位点D D限制性核酸内切酶作用于碱基对之间的氢键限制性核酸内切酶作用于碱基对之间的氢键如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是()ABCDC【反馈练习】02DNA连接酶连接酶-

25、“分子缝合针分子缝合针”38根据所学知识，完成以下填空：限制酶解旋酶DNA连接酶DNA聚合酶RNA聚合酶baA.切断a处的酶为_B.连接a处的酶为_C.切断b处的酶为_a：磷酸二酯键；b：氢键某线性DNA分子含有5000个碱基对（bp），先用限制酶 a 完全切割，产物再用限制酶b完全切割，得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b 的识别序列和切割位点如下图所示。下列有关叙述错误的是：DA酶a与酶b切断的化学键相同B该DNA分子中酶a能识别的碱基序列有3处C仅用酶b切割该DNA分子可能得到三种DNA片段D酶a和酶b切出的DNA片段不能相互连接酶a切割产物（bp）酶b再次切割产物（bp）2100,

26、1400,1000,5001900,200,800,600,1000,500酶a切割位点线性DNA分子酶b切割位点酶a切割后末端:酶b切割后末端:AGATCTGGATCCTCTAGACCTAGG酶a切割产物（bp）酶b再次切割产物（bp）2100,1400,1000,5001900,200,800,600,1000,5002100 1400 1000 5002100 1400 1000 5001900 200 800 600 1000 5001.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（）A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端2.在重组DNA技术中,将外源基因送入受体细胞的载体可以是 （）A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶C.DNA片段的黏性末端 D.用来识别特定基因的DNA探针CA424201平末端平末端平末端01限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶-“分子手术刀分子手术刀”