单抗制备步骤.docx

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1、单克隆抗体技术是现代生命科学争论的重要工具,在基因和蛋白质的构造和功能争论方面有着不行或缺的作用。近年来,随着分子生物学技术的进展,消灭了嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展现技术、核糖体展现技术及共价展现技术所产生的单克隆抗体。这些技术将有效解决单克隆抗体的鼠源性等问题。本文主要表达制备单抗的试验过程，并对试验结果及其影响因素进展分析。摘 要关键词：抗体，单克隆，肿瘤，细胞融合，淋巴细胞AbstractThe monoclonal antibody technology is the modern life sciences research important tool, has the

2、 indispensable function in the gene and the protein structure and the function research aspect. In recent years, along with the molecular biology technology”s development, presented the embedment monoclonal antibody and by the transgene mouse, the bacteriophage demonstrated that the technology, the

3、ribosome demonstrated the technology and the covalence demonstrated the technology produces monoclonal antibody. These technologies effective addressing monoclonal antibody questions and so on mouse source. This article mainly prepares Shan Kang the new technology to the above several kinds to make

4、a summary and analysis of factors.Keywords:antibodi,monoclonal, neoplasms,cell fusion,lymphocyteI单克隆抗体的制备1、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原打算簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原打算簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原打算簇的常规血清抗体，仍是由不同B 细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规

5、血清抗体又称多克隆抗体polyclonal antibody，简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来很多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供给的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。1975 年，Kohler 和 Milstein 建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培育中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成 B 细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培育中能无限地快 速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和

6、分泌特异性抗体。通过克隆化可得 到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗 原打算簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体monoclonal antibody，简称单抗。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供给。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的进展。Kohler 和 Milstein 两人由此出色奉献而荣获 1984 年度诺贝尔生理学和医学奖。2、杂交瘤技术2.1 杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面进展的必 然结果，抗体

7、生成的克隆选择学说、抗体基因的争论、抗体构造与生物合成以及其多第 1 页，共 43 页样性产生气制的提醒等，为杂交瘤技术供给了必要理论根底，同时，骨髓瘤细胞的体 外培育、细胞融合与杂交细胞的筛选等供给了技术贮备。1975 年 8 月 7 日，Kohler 和 Milstein 在英国自然杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培育” Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延长为将丧失合成次黄嘌呤 -鸟嘌呤磷酸

8、核糖转移酶 hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进展融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤hypoxanthine， H、氨基喋呤aminopterin，A和胸腺嘧啶核苷thymidine，T的培育基HAT中生进步行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾 细胞是 HGPRT+，但不能连续培育，只能在培育基中存活几天，而未融合的 HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的 HGPRT-骨髓瘤细胞不能在 HAT 培育基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成

9、的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT 和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT 培育基中存活下来。试验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠 后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体， 即单克隆抗体。这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂，后来觉察聚乙二醇 PEG的融合效果更好，且避开了病毒的污染问题，从而得 到广泛的应用 。随后建立的骨 髓瘤细胞系如 SP2/0-Ag14 ， X63-Ag8.653 和 NSO/1 都是既不合成

10、轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，抑制了骨髓瘤细胞MOPC-21 等的缺乏。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系，但其根本原理和方法是一样的。2.2 根本程序和方法杂交瘤技术在具体操作上，各试验室使用的程序不尽全都。本节中介绍的方法是作者所在试验室承受的、实践证明成熟的程序，该程序适合国内大多数试验室。在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培育骨髓瘤和杂交瘤细胞必需具备以下主要仪器设第 2 页，共 43 页备：超净工作台、CO2 恒温培育箱、超低温冰箱-70、倒置显微镜、周密天平或电子天平、液氮罐、离心机水平转子，4000r/m

11、in、37水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml 细胞培育瓶，10ml、1ml 刻度吸管，试管，滴管弯头、直头，平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml 盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml 注射器等，96 孔、24 孔细胞培育板，融合管50ml 圆底带盖玻璃或塑料离心管，眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器50ul，200ul，1000ul，弯头针头，200 目筛网，小鼠固定装置等。此外，杂交瘤细胞的筛选与检测的仪器设备，依据检测单抗的方法不同而各异，请参阅本节有关局部。 淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞

12、融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等.2.2.1 、动物免疫2.2.1.1 抗原制备2.2.1.2. 免疫动物的选择制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得 到所需单抗的时机增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好， 应依据所争论的抗原和试验室的条件来打算。一般来说，抗原的来源有限，或性质不稳定，提纯时易变性，或其免疫原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或分析等，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是假设这些混杂物的免疫原性较强时，则必需对抗原进展纯化。检测用抗原可以是与免疫抗原纯度

13、一样，也可是不同的纯度，这主要打算于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。2.2.1.3 免疫程序确实定依据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。由于，全部的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于 BALB/c 小鼠，全部的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c 大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是，有时为了特别目的而需进展种间杂交，则可免疫其他动物。种间杂交瘤一般分泌抗体的力量不稳定，由于染色体简洁丧失。就小鼠而言，初次免疫时以 8-12 周龄为宜，雌性鼠较便于操作。第 3 页，共 43 页免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使 B 淋巴细胞在特异抗

14、原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合形成杂交细胞，并增加获得分泌特异性抗体的杂交 瘤的时机。因此在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答力量等。没有一个免疫程序 能适用于各种抗原。现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。表 6-1 列举了目前常用的免疫程序。免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注 射，也承受足垫、皮内、滴鼻或点眼。最终一次加强免疫多承受腹腔或静脉注射，目 前尤其推崇后者，由于可使抗原对脾细胞作用更快速而充分。在最终一次加强免疫后 第 3 天取脾融合为好，很多试验室的结果说明，初次免疫和再

15、次免疫应答反响中，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，特异性杂交瘤的形成顶峰分别为第 4 天和第 22 天，在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌 IgM 抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG 抗体。笔者体会阳性杂交瘤消灭的顶峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系，且多在血清抗体顶峰之前。因此，为到达最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞，这在最终一次加强免疫后第 3 天取脾进展融合较适宜。已有人报道承受脾内免疫，可提高小鼠对抗原的免疫反响性，且节约时间，一般免疫 3 天后即可融合。2.2.2 、细胞融合2.2.2.1 主要试剂的配制2.2.2.1.1 、 细胞培育基杂交瘤技术中使用的细胞

16、培育基主要有 RPMI-1640 或 DMEMDulberco ModifiedEagles Medium两种根底培育基，具体配制方法按厂家规定的程序，配好后过滤除菌0.22um，分装，4保存。不完全 RPMI-1640 培育基：RPMI-1640 培育基原液 96ml100L.G.溶液 1ml双抗溶液 1ml7.5% NaHCO3 溶液 1-2mlHEPES 溶液 1ml不完全 DMEM 培育基：DMEM 13.37g第 4 页，共 43 页超纯水或四蒸水 980ml NaHCO3 3.7g双抗溶液 10ml100L.G.溶液 10ml用 1N HCl 调试 PH 至 7.2-7.4，过滤除

17、菌，分装 4保存。完全 RPMI-1640 或 DMEM 培育基：不完全 RPMI-1640 或 DMEM 培育基 80ml小牛血清 15-20ml用于骨髓瘤细胞 SP2/0 和建株后的杂交瘤细胞培育。HT 培育基：完全 RPMI-1640 或 DMEM 培育基 99ml HT 贮存液 1ml HAT 培育基：完全 RPMI-1640 或 DMEM 培育基 98ml HT 贮存液 1mlA 贮存液 1ml氨基喋呤A贮存液100，410-5mol/L2.2.2.1.2 、: 称取 1.76mg 氨基喋呤Aminopterin MW 440.4，溶于 90ml 超纯水或四蒸水中，滴加 1mol/L

18、 NaOH 0.5ml中和，再补加超纯水或四蒸水至 100ml。过滤除菌，分装小瓶2ml/瓶，-20保存。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷 HT 贮存液(100 ,H:10-2mol/L ， T：2.2.2.1.3 、1.610-3mol/L): 称取 136.1mg 次黄嘌呤(Hypoxanthine,MW 136.1)和 38.8mg 胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 242.2)，加超纯水或四蒸水至 100ml，置 45-50水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶2ml/瓶，-20冻存。用前可置 37加温助溶。L-谷氨酰胺L.G.溶液100，0.2mol/L2.2.2.1.4 、: 称取 2.

19、92g L-谷氨酰胺L-glutamine，MW 146.15，用 100ml 不完全培育液或超纯水或四蒸水溶解，过滤除菌，分装小瓶4-5ml/瓶，-20冻存。2.2.2.1.5 、 青、链霉素双抗溶液100: 取青霉素G钠盐100 万单位和链霉素硫酸盐1g，溶于 100ml 灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶4-5ml/瓶，-20冻存。7.5% NaHCO3 溶液2.2.2.1.6 、: 称取分析纯 NaHCO3 7.5g，溶于 100ml 超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶4-5ml/瓶，盖紧瓶塞，4保存。HEPES溶 液 1mol/L :2.2.2.1.7 、称 取23.83gHEPESN

20、-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonic acid，N-2-羟乙基哌嗪- N，第 5 页，共 43 页-2-乙基磺酸，MW 238.3溶于 100ml 超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶4-5ml/ 瓶，4保存。2.2.2.1.8 、 8-氮鸟嘌呤贮存液100: 称取 200mg 8-氮鸟嘌呤8-azaguanine， MW 152.1，参加 4mol/L NaOH 1ml，待其溶解后，参加超纯水或四蒸水 99ml，过滤除菌；分装小瓶，-20冻存。使用时按 1%浓度参加到培育液中即终浓度为 20ug/ml。50% PEG:2.2.2.1.9、

21、称取 PEG 1000 或 4000 20-50g 于三角瓶中，盖紧，60-802.2.2.2 髓瘤细胞的预备水浴溶化，0.6ml 分装于青霉素小瓶中，盖紧，8 磅高压蒸汽 15 分钟，-20存放备用。临用前加热溶化，加等量不完全培育基，用少许 7.5% NaHCO3 调 PH 至 8.0，或购置 Sigma 或 Gibco 公司现成产品。融合前骨髓瘤细胞维持的方式，对成功地得到杂交瘤是最为重要的。目标是使细 胞处于对数生长的时间尽可能长，融合前确定不能少于 1 周。冻存的细胞在复苏后要2 周时间才能处于适合于融合的状态，长过了的骨髓瘤细胞至少几天才可能恢复。在试验室中处于对数生长的骨髓瘤细胞

22、维持在含 10%小牛血清的培育基中，方法是用 6 个装 5ml 培育基的培育瓶，接种 10 倍系列稀释的骨髓瘤细胞。1 周后到细胞相当密而又未长过的一瓶重移植。典型的倍增时间为 14-16 小时。骨髓瘤细胞悬液的制备方法如下：2.2.2.2.1 、 于融合前 48-36 小时，将骨髓细胞扩大培育一般按一块 96 孔板的融合试验约需 2-3 瓶 100ml 培育瓶培育的细胞进展预备。2.2.2.2.2 、 融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁瘤轻轻吹下，收集于 50ml 离心管或融合管内。2.2.2.2.3 、 1000r/min 离心 5-10 分钟，弃去上清。d、 参加 30ml 不完全培育基，

23、同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于10ml 不完全培育基，混匀。2.2.2.2.4 、 取骨髓瘤细胞悬液，加 0.4%台盼蓝染液作活细胞计数后备用。细胞计数2.2.2.3 脾淋巴细胞的预备时，取细胞悬液 0.1ml 参加 0.9ml 台盼蓝染液中，混匀，用血球计数板计数。计算细胞数目的公式为：每毫升细胞数=4 个大方格细胞数105/4；或每毫升细胞数=5 个中方格细胞数106/2取已经免疫的 BALB/c 小鼠，摘除眼球采血，并分别血清作为抗体检测时的阳性对第 6 页，共 43 页2.2.2.4 饲养细胞Feeder cells的制备照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于 75%酒精中 5

24、分钟，于解剖台板上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪剪开腹膜， 取出脾脏置于已盛有 10ml 不完全培育基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去四周结缔组织。将脾脏移入另一盛有 10ml 不完全培育基的平皿中，用弯头镊子或装在 1ml 注射器上的弯针头轻轻挤压脾脏也可用注射器内芯挤压脾脏，使脾细胞进入平皿中的不完全培育基。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。为了除去脾细胞悬液中的大团块，可用 200 目铜网过滤。收获脾细胞悬液，1000r/min 离心 5-10 分钟，用不完全培育基离心洗涤 1-2 次，然后将细胞重悬于 10ml 不完全培育基混匀，取上述悬液，加台酚蓝

25、染液作活细胞计数后备用。通常每只小鼠可得 1108-2.5108 个脾细胞，每只大鼠脾脏可得 5108-10108 脾细胞。在细胞融合后选择性培育过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时 单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必需参加其他活细胞使之生殖，这种被参加的活细胞称为饲养细胞。饲养细胞促进其他细胞增殖的机制尚不明白，一般认为它们可能释放非种属特异性的生长刺激因子，为杂交瘤细胞供给必要的生长条 件；也可能是为了满足生杂交瘤细胞对细胞密度的依靠性。常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞。其中以小鼠腹腔巨噬细胞 的来源及制备较为便利，且有吞噬去除死亡细胞及其碎片的作

26、用，因此使用最为普遍。其制备方法如下：按上述采小鼠脾细胞的方法将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射 10ml 不完全培育基至腹腔，留意避开穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部 1 分钟，随后吸出注入的培育液。1000r/min 离心 5-10 分钟，弃上清。先用 5ml HAT 培育基将沉淀细胞悬浮，依据细胞计数结果，补加 HAT 培育基， 使细胞浓度为 2105/ml，备用。通常对巨噬细胞来说，96 孔培育板每孔需 2104 个细胞，24 孔板每孔需 105 细胞。每只小鼠可得 3-51

27、06 个细胞，因此一只小鼠可供两块 96 孔板的饲养细胞。也可在细胞融合前 1-2 天制备并培育饲养细胞，这样使培育板孔底先铺上一层饲养细胞层。做法是，将上述细胞悬液参加 96 孔板，每孔 0.1ml相当于 2 滴，然后置 37 6% CO2 的培育箱中培育。第 7 页，共 43 页2.2.2.5 细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培育细胞融合的程序已报道的有很多种，这里介绍的是作者所在试验室常用的一种。2.2.2.5.1、 将 1108 脾细胞与 2107-5107 骨髓瘤细胞 SP2/0-Ag14 混合于一支50ml 融合管中，补加不完全培育基至 30ml，充分混匀。2.2.2.5.2 、 10

28、00r/min 离心 5-10 分钟，将上清尽量吸净。2.2.2.5.3 、 在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀;置 40水浴中预热。2.2.2.5.4 、 用 1ml 吸管在 1 分钟左右最正确时间为 45 秒加预热至 40的 50% PEGPH 8.01ml，边加边轻轻搅拌。2.2.2.5.5 、用 10ml 吸管在 90 秒内加 20-30ml 预热至 37的不完全培育基；20-37静置 10 分钟。2.2.2.5.6 、 1000r/min 5 分钟；弃去上清。2.2.2.5.7 、 参加 5ml HAT 培育基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔巨噬细胞的 HAT

29、 培育基至 80-100ml。2.2.2.5.8、分装 96 孔细胞培育板，每孔 0.10-0.15ml；分装 24 孔板，每孔 1.0-1.5ml；然后将培育板置 37，6% CO2 培育箱内培育。2.2.2.5.9 、 5 天后用 HAT 培育基换出 1/2 培育基。2.2.2.5.10 、 7-10 天后用 HT 培育基换出 HAT 培育基；第 14 天后可用一般完全培育基。2.2.2.5.11 、 常常观看杂交瘤细胞生长状况，待其长至孔底面积 1/10 以上时吸出上清供抗体检测。2.2.3 、杂交瘤细胞筛选杂交瘤细胞在融合后 2 周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选

30、出来，通常也称为抗体检测。抗体检测的方法很多，通常依据所争论的抗原和试验室的条件而定。但作为杂交瘤筛选的抗体检测方法必需具有快速、预备、简便，便于一次处理大量样品等特点。由于往往有几百个样品需要在短短几个小时就报告结果， 以便打算杂交瘤细胞的取舍。所以选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、牢靠、花费小和节约人力。一般说来，在融合之前就必需建立好抗体检测方法，并抑制可能存在的问题。另一个重要问题是抗体检测方法所需要的“动力学范围”，即检出第 8 页，共 43 页2.2.3.1 免疫酶技术背景以上的最强与最弱信号之比，依所用的检测抗原是否纯洁而定。如杂交瘤抗体是针对纯化的蛋白质抗原的， 100

31、%的抗原参与反响，一个阳性/阴性判别系统就够了。另一方面，假设杂交瘤抗体是针对细胞外表微量的蛋白抗原，检测系统可能需要能测出微弱信号，则动力学范围至少应为 10：1，最好为 100：1。另外，检测方法的选择还受所需杂交瘤抗体的类型和预定的用途的影响。结合补体的抗体可以用基于细胞毒性反响的检测方法来选出。如需结合A 蛋白的杂交瘤抗体，就要用结合蛋白A 的检测方法。下面简要介绍几种常用的抗体检测方法：免疫酶技术是将抗原抗体反响的特异性和酶对底物显色反响的高效催化作用有机 结合而成的免疫学技术。由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。2.2.3.1.1、器材和试剂2.2.3.1.1.1

32、. 包被缓冲液：碳酸盐缓冲液：取 0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml 混合，再加 75ml蒸馏水，调 PH 至 9.6。Tris-HCl 缓冲液PH8.0，0.02mol/L：取 0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸馏水至 1000ml。2.2.3.1.1.2. 洗涤缓冲液PH7.2 的 PBS：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO412H2O2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸馏水至 1000ml。2.2.3.1.1.3. 稀释液和封闭液：牛血清白蛋

33、白BSA0.1g，加洗涤液至 100ml；或用洗涤液将小牛血清配成 5-10%使用。2.2.3.1.1.4. 酶反响终止液2mol/L H2SO4：取蒸馏水 178.3ml，滴加浓硫酸98%21.7ml。2.2.3.1.1.5. 底物缓冲液PH5.0，磷酸盐-柠檬酸缓冲液：取 0.2mol/L Na2HPO425.7ml，0.1ml/L 柠檬酸 24.3ml，再加 50ml 蒸馏水。柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。2.2.3.1.1.6. 底物使用液：OPD 底物使用液测 490nm 的 OD 值：OPD 5mg，底物缓冲液 10ml，3% H2O2 0.

34、15ml。 TMBS 或 TMB 底物使用液测 450nm 的 OD 值：TMBS 或 TMB1mg/ml1.0ml，底物缓冲液 10ml，1% H2O2 25ul。ABTS 底物使用液测 410nm 的 OD 值：ABTS 0.5mg，底物缓冲液 1ml，3% H2O2 2ul。第 9 页，共 43 页2.2.3.1.1.7. 抗体比照：以骨髓瘤细胞培育上清作为阴性比照，以免疫鼠血清作为阳性血清。2.2.3.1.1.8. 抗原： 可溶性抗原：尽量纯化，以获得高特异性。病毒感染的传代细胞或全菌抗原。淋巴细胞等悬液。2.2.3.1.1.9. 酶标抗鼠抗体或酶标 SPA 或其他类似试剂。2.2.3

35、.1.1.10. 细胞固定液：-20丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4500mg，蒸馏水 150ml，丙酮 225ml，甲醛 125ml；或丙酮-甲醛溶液1;1；或-20甲醇。2.2.3.1.1.11. 聚苯乙烯微孔板：40 孔、96 孔、或条孔；硬板或软板均可使用。2.2.3.1.1.12. 酶联免疫阅读仪；或光镜。2.2.3.1.1.13. 吸管、加样器及水浴箱、离心机等。2.2.3.1.2 、 可溶性抗原的酶联免疫吸附试验ELISA2.2.3.1.2.1. 纯化抗原用包被液稀释至 1-20ug/ml。2.2.3.1.2.2. 以 50-100ul/孔量参加

36、酶标板孔中，置 4过夜或 37吸附 2 小时。2.2.3.1.2.3. 弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗 3 次，每次 3-5 分钟，拍干。2.2.3.1.2.4. 每孔加 200ul 封闭液 4过夜或 37封闭 2 小时；该步骤对于一些抗原，可省略。2.2.3.1.2.5. 洗涤液洗 3 次；此时包被板可-20或 4保存备用。2.2.3.1.2.6. 每孔加 50-100ul 待检杂交瘤细胞培育上清，同时设立阳性、阴性比照和空白比照；37孵育 1-2 小时；洗涤，拍干。2.2.3.1.2.7. 加酶标其次抗体，每孔 50-100ul，37孵育 1-2 小时，洗涤，拍干。2.2.3.1.2.8.

37、 加底物液，每孔加颖配制的底物使用液 50-100ul，3710-30 分钟。2.2.3.1.2.9. 以 2mol/L H2SO4 终止反响，在酶联免疫阅读仪上读取 OD 值。2.2.3.1.2.10. 结果判定：以 P/N?2.1，或 P?N+3D 为阳性。假设阴性比照孔无色或接近无色，阳性比照孔明确显色，则可直接用肉眼观看结果。2.2.3.1.3 、 全菌抗原的 ELISAS2.2.3.1.3.1. 颖培育的细菌用蒸馏水或 PBS 悬浮，并调整细菌浓度至 1108 个/ml。必需指出，对于人畜共患病病原体需留意安全操作，最好是灭活处理。2.2.3.1.3.2. 每孔中加 100ul 5%

38、戊二醛溶液0.1mol/L NaHCO3 95ml+25%戊二醛溶第 10 页，共 43 页液 5ml，37作用 2 小时，蒸馏水洗涤 3 次；加上述细菌悬液 50ul/孔；37-56烘干；每孔加 200ul 封闭液 4过夜或 37 2 小时封闭。2.2.3.1.3.3. 步骤b 也可承受先每孔加 50ul 细菌悬液，37-56烘干，然后用-20预冷的无水甲醇室温作用 15 分钟，蒸馏水洗涤 3 次；每孔加 200ul 封闭液 4过夜或37 2 小时封闭。2.2.3.1.3.4. 洗涤液洗 3 次；此时包被板可在-20或 4保存备用。2.2.3.1.3.5. 以下步骤同上法。2.2.3.1.4

39、 、 用全细胞抗原的 ELISA2.2.3.1.4.1. 按常规方法培育细胞，接种病毒，收获感染细胞和未感染细胞，进展细胞计数，用 PBS 制成适当浓度悬液。2.2.3.1.4.2. 淋巴细胞悬液的制备承受颖外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴细胞 分别液之上，1500rpm 离心 30 分钟，吸取界面细胞洗涤二次，即为颖淋巴细胞悬液。该细胞悬液中假设仍混有红细胞，离心后加 0.83%的氯化铵溶液，室温 10 分钟，洗涤一次即可。将该细胞悬液稀释至适当浓度。2.2.3.1.4.3. 每孔加 100ul 上述 a 或 b 的细胞悬液，使每孔含细胞 5104 个；1500r/min 15 分钟，甩去上清

40、；室温枯燥或吹干后用丙酮-甲醇1：14固定 102.2.3.2 免疫荧光技术分钟；可 4或-20保存备用。2.2.3.1.4.4. 以下步骤同上法。免疫荧光技术可用于多种抗原的杂交瘤抗体检测，如细胞性抗原包括细菌和动物细胞、感染细胞中的病毒抗原和膜抗原等。其操作简洁、敏感性高，可直接观看抗原定位等优点，在 McAb 的筛选与鉴定上具有重要的应用价值。2.2.3.2.1 、器材和试剂2.2.3.2.1.1. 供检测抗体用的抗原制备?固定细胞片或板，活细胞悬液。2.2.3.2.1.2. PBSPH7.2，0.01mol/L2.2.3.2.1.3. 待检的 McAb 样品。2.2.3.2.1.4.

41、冷丙酮2.2.3.2.1.5. FITC异硫氰酸荧光素或 TRITC四甲基异硫氰酸罗丹明荧光素标记的抗鼠 Ig 抗体等2.2.3.2.1.6. 荧光显微镜，磁力搅拌器，离心机，水浴箱等。第 11 页，共 43 页2.2.3.2.2 、间接免疫荧光法2.2.3.2.2.1. 固定细胞片的制备：生长在盖片上的细胞接种或未接种病毒，可直接收获盖片，在 PBS 中洗涤，用 4丙酮固定 10 分钟，空气枯燥，置密封容器于-20 保存备用；单细胞悬液可在盖片上制成涂片，固定方法同上。细胞涂片的制备：将 10ul 细菌悬液1108 个/ml涂抹721mm 盖片上，自然枯燥后，用-20丙酮固定 10-15 分

42、钟，于-20保存备用。2.2.3.2.2.2. 盖片在去离子水中潮湿后置架上滴加 10-20ul 杂交瘤上清或其他待检样品；设立阳性、阴性比照；置 37水浴孵育 0.5-1 小时。2.2.3.2.2.3. 取出盖片置 PBS 中用磁力搅拌器洗涤 15 分钟。2.2.3.2.2.4. 盖片置架上，滴加工作浓度的抗鼠 Ig 的荧光抗体 10-20ul，37孵育0.5-1 小时。2.2.3.2.2.5. 同法洗涤 15 分钟；取出盖片，用延缓荧光碎灭的封载剂如缓冲甘油，9 份甘油加 1 份 PBS封于干净载玻片上。2.2.3.2.2.6. 光显微镜上观看，阳性结果可见特异性荧光FITC 为黄绿色荧光

43、，TRITC为桔红色荧光。2.2.3.3 间接血凝试验2.2.3.2.2.7. 细胞固定片的制备，也可改在培育板孔中进展，其余步骤同上，在观看结果时，将培育板翻转置于荧光显微镜下，推断标准不变。间接血凝试验又称被动血凝试验PHA，是目前应用较广的检测方法之一。本试验是以包被可溶性抗原的红细胞作为指示系统，当被检抗体与包被在红细胞上的抗原产生特异性反响时，导致红细胞呈凝集现象。可见，该法具有灵敏、快速、简洁操作和无需昂贵仪器等优点，而且经改用醛化红细胞以后，抑制原来重复性差的缺点。2.2.3.3.1、 器材和试剂2.2.3.3.1.1. 绵羊抗凝血，或人“O”型抗凝血。2.2.3.3.1.2.

44、缓冲液：PBSPH7.2；醋酸缓冲液。2.2.3.3.1.3. 甲醛，丙酮醛，NaN3，抗凝剂等。2.2.3.3.1.4. 血凝板，振荡器等。2.2.3.3.2 、 多糖抗原的间接血凝试验2.2.3.3.2.1. 甲醛化绵羊红细胞的制备：无菌采集绵羊颈静脉血 50ml，用枸橼酸钠作抗凝剂；用 5 倍于红细胞压积的 PH7.2 PBSNa2HPO412H2O 3.58g，KH2PO4 0.41g，第 12 页，共 43 页NaCl 8.01g，蒸馏水 1000ml充分洗涤 5 次，每次 1500r/min 5-10 分钟，直至上清测定无蛋白质用饱和硫酸铵滴定上清，观看有无白色沉淀，再以一样缓冲液

45、配成25%红细胞悬液；将 25%红细胞悬液与 20%甲醛以 2.5：1 的比例混匀，37水浴作用 2 小时，每 15 分钟振荡一次，红细胞颜色渐渐由鲜红色转变为棕色；以 PH7.2 PBS 洗涤 4 次，每次 2023r/min 10 分钟，再以同样的PBS 制成 25%红细胞悬液；其后，重复醛化一次，方法同前；最终配成 20%醛化绵羊红细胞悬液，加甲醛至 0.3%防腐，4 保存备用。2.2.3.3.2.2. 脂多糖抗原致 敏甲醛化绵 羊红细胞的 制备：取脂 多糖 LPS，以0.2mol/L PH8.0 PB 液，调整多糖浓度至 120ug/ml，然后 100水浴处理 1 小时；将冷却至 37

46、的热处理 LPS 与 6%醛化红细胞等量混合，37搅拌作用 45 分钟；取出离心 2023r/min 10 分钟，以 0.01mol/L PH7.2 PBS 洗涤 4 次；配制成 4%致敏血球，分装，保存于 4备用，或冻干保存。2.2.3.4 放射免疫测定2.2.3.3.2.3. McAb 的筛选：取待测 McAb 样品 25ul，参加 V 型微量血凝板孔中，同时设立阴性、阳性比照；再参加 0.5-4%致敏红血球悬液 25ul，在振荡器上混匀 30 秒； 置室温或 37 30-60 分钟观看结果。阴性比照孔应呈紧缩的圆点。放射免疫测定是用放射性同位素标记抗原或抗体，以检测相应抗原或抗体的定量 方法。在筛选和鉴定单抗时常用抗原固相法，即用抗原包被聚乙烯微板，借以检测样品中的 McAb，其操作步骤如下：2.2.3.4.1. 用碳酸盐缓冲液将抗原稀释至适宜的浓度1-100ug/ml，滴加聚乙烯微板孔内，100ul/孔，4过夜或 37 2 小时。2.2.3.4.2. 弃去抗原液，每孔加 100ul 含 0.5-1% BSA 的 PBS，4 1-2 小时封