哺乳动物组织基因组DNA提取实验报告.docx

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1、0.5mol/L乙二胺四乙酸pH8. 0 (EDTA):配制等摩尔的Na2EDTA和NaOII溶液(0.5mol/L),混合后形成EDTA的三钠盐。或称取9. 31g 的Na2EDTA 2H20和1g的NaOH, pH调至8.0,并溶于约401nl水中,定容至50ml 3mol/L 乙酸钠 pH5. 2 (Sodium acetate)：溶解20. 4g的三水乙酸钠于约40ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至5. 2,再加水定容到50ml；2%十二烷基硫酸钠(SDS)：称取IgSDS慢慢转移到约含40ml的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定 容至50ml；40%氢氧化钠(NaOH)：

2、溶解40g氢氧化钠颗粒于约90ml水的烧杯中(磁力搅拌器搅拌)，氢氧化钠完全溶解后用 水定容至100ml olmol/L盐酸(HC1)：加8.6ml的浓盐酸至91.4ml的水中。 10mg/ml 蛋白酶 K (proteinase K)：将100mg的蛋白酶k加入到9. 5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混 合。加水定容到10ml,然后分装成小份贮存于-20。 lOmg/mlRnase (无 DNase) (DNase free RNase)：即无 DNA 酶的核糖核酸酶溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸钠水溶液中(pH 5. 0)。溶解后于水浴 中

3、煮沸15min,使DNA酶失活。用lmol/L的Tris HC1调pH至7. 5,于-20贮存。(配制过 程中要戴手套)；(9)1 mol / L Tris. HC1 缓冲液(Tris-HCl buffer pH 8.0)：将121g的Tris碱溶解于约0.9L水中，再根据所要求的pH (25下)加入46 ml的浓盐酸, 用蒸储水调整终体积至1L；6 X凝胶加样缓冲液：0. 25%浸酚蓝(bromophenol blue)：取60nli双蒸水，将250mg浸酚蓝溶解于其中；40% (W/V)蔗糖水溶液(sucrose in water)：在上述溶液中加入40g蔗糖。另外：I . 100mL 5

4、XTBE pH8. 0 (电泳缓冲液)的配制:称取5. 4g Tris, 2. 75g硼酸加入2mL 0. 5mol / L EDTA (pH8. 0)溶液中,再用蒸储水补加到100mLII. 10ml组织匀浆液(装入10ml离心管中)的配制：lOOmmol / L NaCl： 0. 2ml ( 5M NaCl)25 mmol / L EDTA(pH8. 0)： 0. 5ml ( 0. 5M EDTA PH8. 0)lOmmol /LTris.HCIpH 8. 0) ：0. 1ml (IM LTris.HCIpH 8. 0)加三蒸水：9. 2mlIII. 1ml酶解液(装入1. 5ml离心管中

5、)：200mmol /L NaCl： 0. 04ml ( 5M NaCl)50mmol / L EDTA (pH 8. 0)： 0. 1ml ( 0. 5M EDTA pH8. 0)20mmol / LTris. HC1 (pH 8. 0) ： 0. 02ml (IM Tris.HCIpH 8. 0)1%SDS： 0. 5ml (2% SDS)200 u g / mL 蛋白酶 K： 0. 02ml (lOmg / mL)加三蒸水：0. 32mlW.提取液1：平衡酚(pH8.0)：氯仿：异戊醇(25： 24： 1)即配即用，每管加500ul平衡酚(pH8.0)：250ul氯仿：240ul异戊醇：

6、10ulV .提取液2：氯仿：异戊醇(24： 1)即配即用，每支试管加500 ul氯仿： 480ul异戊醇：20ulVI .TE缓冲液：5mllOmmol / L TrisJICKpH 8. 0) ： 0. 05ml (IM LTris. HCIpH 8. 0)Immol / L EDTA (PH8. 0) ： 0.01ml ( 0. 5M EDTA pH8. 0)最后加三蒸水至4. 94mL 4.实验方法步骤及注意事项1）实验方法步骤：第一步操作：破碎、酶解细胞（过夜）取0.2g鼠肝，用冰冷的生理盐水洗3次，然后置于2. 0mL匀浆液中，用玻璃匀浆器匀浆至 无明显组织块存在（冰浴操作，切勿将

7、细胞破碎，可镜检观察）；（2）将组织细胞液移至1. 5mL离心管中,5000r / min离心3060s,（尽可能在低温下操作），弃上清，若沉淀中血细胞较多，可再加入5倍于细胞体积的匀浆液洗一次；沉淀加400uL无菌水迅速吹散，再加400uL酶解液，翻转混匀（动作一定要轻）55c水浴处 理 1218h；第二步操作：抽提DNA、乙醇沉淀纯化DNA（4）取20uL RNase加入L 5ml离心管内,使RNase至终浓度200 n g / mL, 37c水浴lh；将待抽提的样品等量分装在两支离心管内，各加入等体积提取液 酚/氯仿/异戊醇 500ul （25： 24： 1现配先用），抽提（慢慢旋转混匀

8、，倾斜使两相接触面增大）一次。4 10min 静置，然后lOOOOr / min离心10min ；（6）用扩口吸头移出含DNA的水相.（注意勿吸出界面中蛋白沉淀，有时如果DNA含量过高，水相 在下层，实验时注意观察）；然后加等体积提取液:氯仿/异戊醇500ul （24： 1现配现用）抽提，4静置10min,然 后100001/01简离心10111皿（若界面或水相中蛋白含量多，可重复5, 6, 7操作）；用扩口吸头小心吸出上层含DNA的水相，加1 / 10体积的NaAc,小心混匀（要充分）；再向每管中加入2倍体积的无水乙醇，-20 l-2h ；(10) 12000r / min 离心 15min

9、,弃上清；(11) 75%冷乙醇洗涤一次,12000r / min 离心 15min ；(12)室温干燥(不要太干，否则DNA不易溶解)，加入50ULTE缓冲液。轻摇混匀，即可得到实验动物基因组DNA。存放于4；第三步操作：琼脂糖凝胶电泳检测DNA(Agarose Gel Electrophoresis)(13)制备琼脂糖凝胶(Preparation of the gel)：琼脂糖凝胶浓度为0. 3%；(14)加入DNA样品(Loading DNA samples)：DNA samples 16Ml + Loading buffer4Ml(15)电泳(Gel)：电压 120V(16)电泳结果的

10、拍照(Gel photography)：通过紫外透射仪检测凝胶，然后获取图片。并将产 物条带与已知分子量的标淮条带进行比较，便可以对合适分子量大小的产物进行鉴定。2)注意事项:(1)所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶；(2)所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制；(3)；用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性；(4)用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验(如Southern杂交、PCR等)目的，如要求更高，可参考有关资料进行DNA纯化；(5)进行小鼠基因组DNA样品室温干燥时，不要太过于干燥，否则DNA不易溶解；(6)在用冰冷的生理盐水洗鼠肝之前，先要将玻璃匀浆器置于冰块中，

11、待温度下降到一定程 度再将鼠肝放入玻璃匀浆器，冰浴操作，但切勿将细胞破碎，整个过程尽可能在低温下操作；(7)用无菌水迅速吹散沉淀，加入酶解液后，翻转混匀时动作一定要轻；(8)抽提时慢慢旋转混匀，倾斜使两相接触面增大，离心后用扩口吸头移出含DNA的水相时, 注意勿吸出界面中蛋白沉淀，有时如果DNA含量过高，水相在下层，实验时注意观察 二.实验内容1 .实验现象与结果：此次试验本小组所得紫外透射仪检测凝胶照片显示的天道如图所示：小白鼠基因组DNA的电泳条带图2 .对实验现象、实验结果的分析及其结论:(1)对实验现象的分析及其结论：从上述所示的DNA电泳条带图可以看出：小鼠基因组DNA的电泳条带都在同一条水平线上，但同时条带也有些暗淡，形状不佳。(2)对实验结果的分析及其结论：本次实验抽提所得到的小白鼠肝脏细胞基因组DNA样品不纯，可能含有其他的一些杂质； 本次所用的凝胶浓度为0.3%,浓度过低，也有可能是导致电泳条带形状不佳的原因之一。3 .对本次实验的自我总结：本次试验各个组员都积极参与，合作有序，按时按质完成了本次实验；通过本次实验进一步认识了作为分子生物学实验重要研究手段之琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术；由于本次哺乳动物组织基因组DNA提取实验未在电泳时向凝胶中加入相对分子质量标准物 Marker作为标准对照，故不好进行进一步的分析。教师评语及评分:签名: