实验10 几种常用培养基的制备及高压蒸气灭菌和干热灭菌.docx

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1、实验十几种常用培养基的制备及高压蒸汽灭菌和干热灭菌杨明轩 生物111 1102040128 一、实验目的1、学习并掌握常用培养基的制备方法。2、学习并掌握高压蒸气灭菌和干热灭菌的原理及方法。二、实验原理培养基是一种人工配制的适合微生物生长繁殖并积累代谢产物的混合养料，通常包含碳源、氮源、无 机盐、生长因子和水六大类营养成分。就其营养物而言，可分为天然培养基、半合成培养基和合成培养基。 就用途而言，可分为基础培养基、加富培养基、鉴别培养基以及选择培养基。其中，牛肉膏蛋白月东培养基、 马铃薯培养基及高氏一号培养基是几种常用的培养基，它们分别用来培养细菌、真菌以及放线菌。前两者 属于天然培养基，后者

2、是合成培养基。牛肉膏是牛肉浸液的浓缩物，含有丰富的营养物质，可提供碳源、 氮源及多种维生素；蛋白豚是酪蛋白、大豆蛋白或鱼粉蛋白酶水解后的中间产物，富含营养；马铃薯浸液 同样也是丰富的氮源物质以及多种维生素。高压蒸汽灭菌是实验室常用的灭菌方法，适用于培养基、生理盐水、各种缓冲液以及玻璃器皿的灭菌。 常用高压蒸汽锅进行灭菌，原理是通过提高灭菌锅内的蒸汽温度以达到灭菌的目的。当蒸汽压为1.05kg/cm2 时，锅内温度达到121.3,在该温度下保持20-30min即可杀灭所有微生物及芽胞。灭菌所需时间和温度 取决于被灭培养基中营养物的耐热性、容器体积大小及装物量等因素。干热灭菌常用于玻璃器皿的灭菌，

3、 常用电热烘箱进行。干热灭菌主要是利用高温使微生物细胞内的蛋白凝固变性而达到灭菌的作用。细胞内 蛋白质凝固性与自身含水率有关，当菌体受热时，环境和细胞含水率越大，蛋白凝固越快。常在160-170 条件下维持2h即可进行彻底灭菌。三、实验材料1、试剂：牛肉膏、蛋白陈、蔗糖、可溶性淀粉、马铃薯、NaCI、KNO3、K2HPO4 3H2。、MgSO4-7H2O FeSO4 7H2O 琼脂、lmol/LNaOH lmol/LHCL 无菌水；2、器皿：台式天平、2000ml搪瓷锅、500ml烧杯、500ml三角瓶、500mL 1000ml量筒、漏斗、玻璃 棒、15X150mm试管、1ml、10ml吸管、

4、滴管；3、仪器：立式高压蒸汽灭菌锅、手提式高压蒸汽灭菌锅、电热烘箱；4、其它：pH试纸、药勺、滤纸、防潮纸、纱布、棉花、线绳。四、实验方法(1)制备牛肉膏蛋白陈培养基按照下表1称量各药品。用量筒取900ml蒸馈水与搪瓷锅中，加入各药品至全部溶解，补水定容至1000ml。 然后用Imol/LNaOH调pH到7。趁热分装,5个500ml三角瓶，每瓶300mL并力口 3.4g琼脂粉。加塞， 包扎，做好标记，准备灭菌。(2)制备马铃薯培养基按照下表1称量各药品。将洗净去皮的马铃薯切成lcrr?的小块置于搪瓷锅中，加入900ml蒸储水煮沸 15min,然后用4层纱布过滤，加入蔗糖至全部溶解，补水定容至1

5、000ml。然后用lmol/L HCI调pH到6.5。趁 热分装，5个500ml三角瓶，每瓶300ml,并加3.4g琼脂粉。加塞，包孔，做好标记，准备灭菌。(3)制备高氏1号培养基按照下表1称量各药品。先用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少量沸水并加热使淀粉充分溶解，加入 900ml蒸储水,加入其他药品至全部溶解，补水定容至1000ml。然后用lmol/L NaOH调pH到7.3。趁热分装， 5个500ml三角瓶，每瓶300ml,并加3.4g琼脂粉。加塞，包扎，做好标记，准备灭菌。(4)无菌水的制备将蒸储水分装于200 ml三角瓶中，每瓶内含20.30粒玻璃珠，每瓶90ml。5义150mm试管中

6、装9 ml蒸 储水，7支一捆，包好后准备灭菌。表1三种培养基的成分牛肉膏蛋白陈培养基马铃薯培养基高氏1号培养基牛肉膏3g去皮马铃薯200g可溶性淀粉20g蛋白陈10g蔗糖20gNaCI0.5gNaCI5g琼脂17gKNO3lg琼脂17g蒸储水1000mlK2HPO4 3H2O0.5g蒸储水1000mlpH6.5MgSO4 7 H2O0.5gPH7.0-7.2FeSO4 7 H2O0.01g琼脂17g蒸储水1000mlpH7.2-7.4（5）高压蒸气灭菌1、加水：向灭菌锅夹层加蒸储水至适当水位刻度；2、装料：放入需灭菌的物品；注意：装量适当，使瓶口或试管口向中心摆放，不要紧贴锅内壁，以防冷凝 水

7、沾湿棉塞3、加盖：盖好灭菌锅，对称拧好螺栓；4、灭菌：通电加热，待灭菌锅排出大股水蒸汽时记时15分钟后，关闭排气阀。继续加热至所需条件，如 压力达1.05kg/cm2即121.3C,维持2030分钟；5、降压：灭菌后立即关闭电源，待压力降至0时，打开排气阀，放空剩余蒸汽。再打开锅盖，取出灭菌物 品；6、后处理：灭菌完毕，放空夹层内的水，保持锅内干净。（6）干热灭菌1、装料：打开烘箱门，放入需灭菌的物品，关好烘箱门；（注意：勿使纸包物品紧靠烘箱壁，以免引起火 灾！）；2、灭菌：打开排气孔，接通电源，加热升温至160C,关闭排气孔，维持2小时；（注意：灭菌温度绝对 不可以超过180）3、降温：灭菌

8、后，立即关闭电源，将温度旋钮转至0。待温度降至20以下时，打开烘箱门，取出灭菌物 品。六、思考题1、制好培养基后为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？答：新配制的培养基中营养物质丰富，适合微生物的生长。配制培养基时可能会带入杂菌，如果灭菌不及 时，会导致培养基被杂菌消耗；同时杂菌的生长也会干扰正常应接种微生物的生长：导致培养基无法使用。检测灭菌培养基是否无菌，可以将培养基在适宜条件下放置，如果没有杂菌生长则证明该培养基无菌， 否则说明培养基灭菌不够彻底。2、为什么干热灭菌比高压蒸汽灭菌所需的时间长、温度高？答：高温灭菌的原理是通过高温使微生物中的蛋白质等大分子变性。一方面，高压蒸汽灭菌以高压高 温的水蒸气为导热介质，而干热灭菌以高温空气为导热介质。显然由于水的热容大于空气，水蒸气对热的 传导能力强于空气，更易导热。另一方面，菌体受热时，环境和细胞内含水量越大，蛋白质凝固越快。在 高压蒸汽灭菌的体系中，水分含量明显更高。所以，只考虑灭菌能力，高压蒸汽灭菌更强。因此，要达到 同样的灭菌效果，干热灭菌比高压蒸汽灭菌所需的时间长、温度高。