发酵液预处理与固液分离.docx

《发酵液预处理与固液分离.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《发酵液预处理与固液分离.docx（9页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、发酵液的预处理和固液分别方法综述摘要：鲁彬彬1002023044从微生物发酵液或细胞培育液中提取生化物质的第一个重要步骤，就是预处理和固液分别。其目的不仅在于分别细胞、菌体和其他悬浮颗粒，还期望除去局部可溶性杂质和转变滤液的性质，以利于后续的各步操作。关键字：正文：预处理固液分别一、发酵液预处理微生物发酵和细胞培育的目标产物主要有菌体、胞内产物和胞外产物三类物质。从发酵液和细胞培育液中提取所需的生化物质，第一步就需进展预处理，以便于固液分别，使代谢产物后续的分别纯化工序顺当进展。其缘由有三个方面： 首先，发酵液多为悬浮液，粘度大，为非牛顿型流体，不易过滤，而所需的生化物质往往只有分布在液相，才

2、能有效地提纯。并且，在有些发酵液中，菌体自溶， 核酸、蛋白质及其他有机粘性物质这三类物质会造成滤液混浊、滤速极慢，必需设法增大悬浮物的颗粒直径，提高沉降速度，以利于过滤；其次，目标产物在发酵液中的浓度通常较低；此外，发酵液的成分简单，大量的菌丝体、菌种代谢物和剩余培育基会对提取造成很大的影响。所以，对发酵液进展适当的预处理，从而分别细胞、菌体和其他悬浮颗粒如细胞碎片、核酸以及蛋白质的沉淀物，并除去局部可溶性杂质和转变发酵液的过滤性能，是生化物质分别纯化过程中必不行少的首要步骤。预处理方法要依据发酵产品、所用菌种和发酵液特性来选择。大多数发酵产品存于发酵液中，少数存于菌体中，而发酵液和菌体中都有

3、产物存在的情形也比较常见。假设目的产物是胞外产物，则通过离心或过滤实现固液分别，使其转入液相；而对于胞内产物而言，收集细胞是预处理的首要一步。细胞经裂开或整体细胞萃取使目的产物释放，转入液相，再进展细胞碎片的分别。假设所需的产物为细胞，离心或过滤所得固相经枯燥等过程就可得到菌体。图 11 为生化产品分别纯化的一般步骤，图中虚线以上为预处理过程示意图。1.1 预处理简述图 11生化产品分别纯化的一般步骤【1】发酵液经过预处理，一些物理性质会转变，从悬浮液中分别固形物的速度随之提高，过滤操作更易进展；在预处理过程中，产物大多转移进入易于后处理的相中一般为液相。同时，发酵液中的局部杂质也得以去除。发

4、酵液的预处理过程一般包括以下几局部：（1） 发酵液杂质的去除：包括除去蛋白质、无机离子以及色素、热原质、毒性物质等有机物质。（2） 改善培育液的处理性能：主要通过降低发酵液的粘度，调整适宜的 pH值和温度1及絮凝与分散等操作来实现。预处理在生物技术产品的加工和提纯过程中相当重要。目的产物不同，承受的预处理方法也不同。并且，由于具体发酵液的实际状况差异很大，预处理方法就更加敏捷，多样，应依据生产需要进展选择和改进。发酵液预处理之后，再进展固液分别，进入后续的分别纯化工艺。1.2 发酵液杂质的去除发酵液成分简单，目的产品与很多溶解的和悬浮的杂质夹杂在一起。在这些杂质中对提取影响最大的是高价无机离子

5、和杂蛋白。在承受离子交换法提炼时，高价无机离子，尤其是Ca2+ 、Mg2+ 、Fe3+的存在，会影响树脂对生化物质的交换容量。而杂蛋白，一方面，在承受离子交换法和大网格树脂吸附法提炼时会降低吸附力量，另一方面，在承受有机溶剂或两水相萃取时，常有乳化现象， 使两相分别不清。除此之外，在常规过滤或膜过滤时，杂蛋白还会使滤速下降， 污染滤膜。因此，在预处理时，应尽量除去这些杂质。【2】1.2.1 无机离子的去除由于培育基或水中含有无机盐，发酵液中往往存在很多无机离子，如Mg2+、Ca2+等，因而需要常常测定并除去无机离子。去除的方法比较固定，因此，在这方面的争论也比较少。1.2.2 可溶性蛋白质的去

6、除及其生化机理在发酵液中除了上述高价无机离子外，还存在可溶性杂蛋白。一般来讲，对于无机或有机酸、碱及其金属盐类，在特定条件下，通过溶媒转向、离子交换等方法可使其与产物逐步分别。但对于可溶性杂蛋白，假设任其进入滤液，将给以后各步的分别精制工作带来极大的不便。因此发酵液的预处理，从根本上说，是如何使可溶性杂蛋白形成沉淀，以便随固形物一同除去的过程。在各种方法中， 变性沉淀最为常用。正确生疏蛋白质的性质和变性理论很重要，由于它是发酵液预处理所依据的生化机理3。1.3 有色物质的去除在发酵的过程中，培育根本身可能带入色素，如糖蜜、玉米浸出液等都带有颜色，使得发酵液的颜色加深；此外，微生物在代谢过程中，

7、本身也可能产生有色物质。但是，从提高产物的质量的观点来看，又必需除去发酵液中有色物质【3】。色素的化学构造比较简单，性质多样，给脱色工作带来了相当大的麻烦。常用的脱色方法为吸附法，如活性炭吸附，树脂吸附等。吸附法可以不用或少用有机溶剂，操作简便，设备简洁，生产过程中的pH 值变化范围小。陈碧娥等人承受 K15 颗粒活性炭作脱色剂对 L乳酸发酵液进展脱色，脱色率到达 97%， 而乳酸钙的损耗仅为 1%左右。常用于吸附的树脂又称为“脱色树脂”，它外表积大，具有多孔性，吸附力量强等特点。在发酵工业中多用于脱色、吸附大分子的产物和除去蛋白质。近年来消灭的大网格树脂孔隙大，树脂内外表积大，也可应用于脱色

8、工艺。例如食品工业上的糖浆脱色时多用大网格树脂。此外，脱色工艺还可以利用某些离子交换树脂进展。例如，承受强碱性阴离子交换树脂，使果胶酶溶液脱色，酶活损失率不超过 15%20%。阴离子交换树脂对糖浆中的有色物质具有很强的吸附力量，可以用在谷氨酸发酵液的脱色中，树脂的最正确操作形式为磷酸盐式。用 DEAE纤维素从含酶溶剂中吸附有色物质，通常可同时除去非活性蛋白质，使主产物纯化 25 倍。另外，现在的预处理工艺也承受工业酶制剂完成，如净化发酵产物、除去干扰性浑浊物。用淀粉酶将发酵液中残留的不溶性多糖转为单糖，可以提高过滤速度；用带电胶体如鱼胶添加到浑浊的饮料中以除去悬浮体等等。2.1. 液处理性能的

9、改善2.1.1 降低发酵液的粘度依据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的粘度成反比，因此降低液体粘度可以有效的提高过滤速率。降低液体粘度的常用方法有加热法和加水稀释法两种。上升发酵液的温度可以有效的降低液体粘度，提高过滤速率。同时，在适宜的温度和受热时间下，蛋白质会分散，形成大颗粒的分散物，发酵液的过滤特性得到了进一步的改善。但是，生物产品往往对温度敏感，因此，加热时必需严格的掌握加热温度和加热时间。首先，加热温度必需低于目的产物的变性温度：其次，温度过高或时间过长，细胞溶解，会使胞外物质外溢，反而增加了发酵液的简单性，影响其后的产物分别与纯化。例如，在 40时，12Be麦芽汁的粘度为 1

10、.210-3Pas，当温度升至 75时，粘度可下降一半，过滤速率加倍。对于链霉素的发酵液，在pH 值 3.0 的条件下，升温至 70后维持半小时，可使液体粘度下降 1/6，过滤速率增大 10100 倍。加水稀释法也是降低发酵液粘度的方法。但是，稀释后悬浮液的体积增大， 加大了后续过程的处理任务。针对过滤操作而言，稀释后过滤速率提高的百分比必需大于加水比，才能认为有效，即假设加水一倍，稀释后液体粘度应下降一半以上，过滤速率才能得到有效提高。2.2.2 调整 pH 值调整 pH 值是发酵液预处理的常用方法之一。由于 pH 值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，通过调整 pH 值可以改善其过

11、滤特性。首先，对于氨基酸和蛋白质等两性物质而言，将 pH 值调至等电点，即可沉淀除去。其次， 在膜过滤时，发酵液中的大分子物质简洁吸附于膜上，调整发酵液的 pH 值可改变易吸附分子的电荷性质，削减膜的堵塞和污染。此外，在适宜的 pH 值下，细胞和细胞碎片及某些胶体物质会趋于絮凝状态，形成较大的颗粒，有利于过滤操作的进展。除降低粘度和调整 pH 值外，还可承受絮凝操作改善发酵液的处理性能。由于絮凝是一种重要而且常用的预处理方法。3.预处理总结与展望目前，预处理的争论，一方面是改进传统的处理方法；另一方面，在生化分别技术走向整合的大背景下，全发酵液的提取技术将预处理与后续提取纯化操作相结合倍受关注

12、。由于发酵液的预处理是生化分别过程中首要的一步，因此， 正确高效的预处理是得到目标产物的关键。越来越多的人已经生疏到了预处理的重要性。随着对其争论的深入，预处理环节必将对提高产品质量和产率作出巨大奉献。二、固液分别技术1. 概述固液分别是生物产品分别纯化过程中重要的单元操作。在生产中，培育基、发酵液、一些中间产品和半成品均须进展固液分别。其中，发酵液的种类多、成分简单、粘度大，属于非牛顿型流体，因此，发酵液的固液分别最为困难。生物产品的生产中，固液分别的方法有分别筛、悬浮分别、重力沉降以及离心和过滤等。在这些方法中，用于发酵液固液分别的主要是离心和过滤操作。具体的固液分别方法和设备应依据发酵液

13、的特性进展选择。对于丝状菌，如霉菌和放线菌，体形比较大，一般承受过滤的方法处理发酵液；而单细胞的细菌和酵母菌，其菌体大小一般在 110m，高速离心的效果比较好。但是，当固形物粒径较小时，通过预处理改善发酵液的特性，就可用过滤实现固液分别。例如，在氨基酸的发酵液中，菌体很小，假设在预处理过程中进展絮凝，并添加助滤剂， 就可使用板框过滤机分别菌体。由此看来，发酵液的预处理为固液分别及后处理作了预备工作。表【4】21 给出了主要的固液分别技术，并从原理、设备和优缺点四个方面进展了比较。表 21主要的固液分别技术及其特点序号方法原理设备高速冷冻离心机特点适用于粒径小、热稳定差的物质回收，常用于试验室缺

14、点产量小，连续操作困难，大规模工业应用差1 离心2 过滤3 膜分别在离心产生的重力场 作 用下，加快颗粒的沉降速度依据过滤介质的孔隙大小进展分别依据被分别分子和膜孔大小进展分别碟片式离心机管式离心机倾析式离心机框式离心机板框过滤机、平板过滤机、真空旋转过滤机、管式过滤器、蜂窝式过滤器、深层过滤器板框式、管式、中空纤维式和螺旋卷式等膜过滤器。适用于大规模工业应用，可连续或批式操作，操作稳定性较好， 易放大、推广批式操作、转速高， 固液分别效果较好、含水低，易放大推广连续操作，易放大， 易工业应用，操作稳定实质为离心力作用下的过滤。适用于大颗粒固形物的回收，放大简洁，操作较简洁、稳定、适用于工业应

15、用设备简洁，操作简洁， 适用大规模工业应用，适用于大颗粒固体过滤主要用于分别细胞。操作简洁，效果好， 可无菌操作，适用性好，易放大半连续或批式操作时出渣、清洗简单， 连续操作固形物含水量高，总的分别效率低容量有限，拆装频繁、处理量小、噪声大对很小颗粒的固形物回收困难，设备投资高批式操作或半连续操作，转速低，分别效果较差，操作繁重，离心的设备投资高，操作本钱高分别速度低，分别效果受物料性质变化的影响，劳动强度大膜易污染，分别效果与操作技巧关系亲热，需要细心保养、清洗，膜易污染，分别效果与物料性质亲热相关2. 过滤过滤就是利用多孔性介质如滤布截留固液悬浮物中的固体颗粒，从而实现固液分别的方法。微生

16、物发酵液属于非牛顿型液体，在悬浮液中含有大量的菌体，细胞或细胞碎片以及剩余的固体培育基，这些固体颗粒均可通过过滤操作削减或除去。目前，在生化工业中，过滤的方法还是以传统的板框过滤或真空过滤等为主。随着膜分别技术的进展，过滤已超出了传统意义上固液分别的范畴。选择性和高效性使膜分别技术在生物产品的分别提取中蕴含着巨大的潜力。2.1 传统的过滤方法传统的过滤单元操作，据过滤机理的不同，可分为深层过滤和滤饼过滤两种。深层过滤所用的过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性碳和塑料颗粒等。过滤介质填充于过滤器内形成过滤层。过滤时，悬浮液通过滤层，滤层上的颗粒阻拦或者吸附固体颗粒，使滤液澄清，因此，过滤介质在过滤中起

17、主要作用。澄清过滤适于过滤固体含量少于 0.1g/100ml、颗粒直径在 5100m 范围内的悬浮液，如河水、麦芽汁等。滤饼过滤的过滤介质是滤布。悬浮液通过滤布时，固体颗粒被阻拦形成滤饼或滤渣。悬浮液本身形成的滤饼起主要过滤作用。滤饼过滤一般用于过滤固体含量大于 0.1g/100ml 的悬浮液。就滤饼过滤而言，假设按过滤推动力的不同，又可分为常压过滤、加压过滤和真空过滤三类。常压过滤效率低，所以只适合于过滤易分别的物料。例如，啤酒糖化醪的过滤。而加压和真空过滤在生物和化工工业中的应用比较广泛。设备一般为板框压滤机和鼓式真空过滤机等。2.2 膜过滤在传统观念中，过滤仅仅是一种过滤分别的手段，但是

18、随着膜技术的进展， 过滤已经扩展成为一种选择性滤出肯定大小物质的方法。目标产物可依据设计滤出或保存在溶液中。由于膜在分别过程中，不涉及相变，没有二次污染，具有生物膜浓缩富集的功能，同时它又是一种效率较高的分别手段，在某种程度上可以代替传统的过滤、吸附、重结晶、蒸馏和萃取等分别技术，因此，作为一种兴的有效的生化分别方法，膜分别技术已被国际上公认为 20 世纪末至 21 世纪中期很有进展前途的重大生产技术。利用膜进展分别可以带来很大的经济效益。但由于膜在操作过程中会发生污染及浓差极化，使膜通量下降，进而导致设备本钱上升、产品质量下降。为解决这些问题，目前有关滤膜污染及抗污染膜的研制已成为膜分别技术

19、的争论热点。广义的“膜”分隔两相界面，并以特定的形式限制和传递各种化学物质。它可以是对称或非对称的、全透性或半透性的、固体或液体的、中性或荷电性的， 可以独立于流体之间或附于支持体和载体的微孔隙中4。一般来讲，膜是均匀的一相或是由两相以上的分散物质所构成的复合体，厚度在 0.5mm 以下。但是， 膜不管薄到什么程度，至少要有两个界面，才能与两侧的流体相互接触。并且， 膜传递某物质的速度必需比传递其他物质快，才能实现有效的分别。膜分别是利用具有肯定选择透过特性的过滤介质进展物质的分别纯化，过程的实质是物质通过膜的传递速度不同而得以分别，过程近似于筛分，不同孔径的膜截留粒子的大小不同。在分别过程中

20、，膜的作用主要表达在三个方面5：完成物质的识别与透过、充当界面和反响场。物质的识别与透过是使混合物中各种组分之间实现分别的必要条件和内在因素；在分别中，膜作为界面，将透过液和保存液料液分为不相混合的两相；而作为反响场，由于膜外表及孔内外表含有可与特定溶质发生相互作用的官能团，因此可以通过物理作用、化学反响或生化反响提高膜分别的选择性和分别速度。膜分别的推动力的不同，一般有浓度差、电位差和压力差三种。常见的膜过滤有渗透、透析、电渗析、反渗透、纳滤、超滤和微滤。3 离心离心是生产中广泛使用的一种固液分别手段。它在生物工业中应用格外广泛。从啤酒和果酒的澄清、谷氨酸结晶的分别，至发酵液菌体、细胞的回收

21、或除去，血球、胞内细胞器、病毒以及蛋白质的分别，以及液液相的分别都大量使用离心分别技术。离心分别与压滤相比，具有分别速度快，效率高，液相澄清度好，操作时卫生条件好等优点，适合于大规模的分别过程。但是，离心分别设备投资费用高， 能耗较大，固相枯燥程度不如过滤操作。依靠惯性离心力的作用而实现的沉降过程称为离心。对于两相密度差较小， 颗粒粒度较细的非均相体系，在重力场中的沉降效率很低，甚至不能完全分别， 假设改用离心可以大大提高沉降速度，缩小设备尺寸。4、固液分别的进展动向改善固液分别的手段主要从以下三方面进展：利用错流过滤；利用遗传工程的方法来转变菌体的大小和外形；承受双水相萃取处理细胞匀浆液；离心分别技术；不进展固液分别的方法。【5】参考文献1. 梅乐和等编著. 生化生产工艺学. 科学出版社, 19982. 俞俊堂, 唐孝宣主编. 生物工艺学. 华东理工大学出版社, 19963. 严希康编著. 生化分别技术. 华东理工大学出版社, 19964. 梅乐和等编著. 生化生产工艺学. 科学出版社, 19985. 俞俊堂, 唐孝宣主编. 生物工艺学. 华东理工大学出版社, 1996