地高辛标记及检测试剂盒I(POD)说明书.docx

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1、DIG Random Labeling and Detection KitPOD withDAB)DNA 探针标记和检测试剂盒产品编号：MK1008保存期：一年-20冰冻保存。用途：(for color detection10 / 28用于 DNA 探针的随机引物标记及各种膜上杂交和原位杂交。工作量：可用于标记0.13g 的探针 6 次及 1000 张切片的原位杂交或 12 次 1010cm 膜上杂交检测。原理所谓 DNA 探针，实质上是一段的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。假设靶基因和探针的核苷酸序列一样，就可按碱基配对原则进展核酸分子杂交，从而到达检查样品基因的目的。在随机引

2、物法标记反响液中，有随机合成的六聚体核昔酸(hexanucleotide)作为引物，dATP、dCTP、 dGTP、dTTP 和 D1G-11-dUTP 作为合成底物，以单链 DNA 作为模板，在 Klenow 酶的作用下，合成掺入地高辛的 DNA 链。以地高辛标记的探针与靶基因 DNA 链杂交后，再通过免疫反响来进展检测。一般通过酶标抗地高辛抗体来检测，就可以确定杂交反响的存在。免疫检测承受过氧化物酶系统，DAB 显色。敏感性很高。可用于膜上杂交和原位杂交。试剂盒内容：1. DIG Random Labeling Mix(高效)，25l 2.BiotinMouseAntiDigoxin200

3、l3. SABCPOD200l4. DAB Stock Solution5ml5. Blocking Reagent，5g特点： 1标记属高效标记反响。以 1g DNA 探针为例，1 小时反响即可产生0.8g 标记探针，20 小时可产生 2g 左右的标记探针。（2） 试剂将标记反响所需的引物、核苷酸、DIG-11dUTP 和 Klenow 酶等混合在一起。一次标记只需吸取一次标记液，使用至为简便。（3） 标记反响适于下述对象 ：a. DNA 从 10ng3g。b. 不等的 DNA 长度 100bp10kb。c.线形排列或呈高度卷曲之 DNA。d.低融点 xx 中的 DNA。（4） 检测系统抗体

4、为抗地高辛单抗+SABC。抗地高辛单抗标记生物素，效价 1：1000-2023膜上杂交或 1：1000原位杂交。（5） 显色剂为 DAB，格外稳定。用时 1：40 稀释。（6） 试剂盒敏感性到达0.1pg，足够检测出 1g 基因组 DNA 中的单个基因。（7） 除用于各种膜上杂交之外，还可用于原位杂交(ISH)。操作程序一随机引物标记操作程序如下：用灭菌去离子蒸馏水稀释 1g DNA 至总体积 16l。DNA 热变性：把 DNA 瓶置于沸水中，水浴 10 分钟。然后，快速地插入碎冰中 3 分钟以上。 加 4l DIG Random Labeling Mix(高效),混匀后再离心 2023/r.

5、p.m5 分钟。置 37反响至少 120 分钟。时间越长，产量越高。延长反响时间至 20小时可明显增加地高辛标记 DNA 的产量。应依据需要掌握反响时间。参加 21 10mM EDTA 以中止反响，对于原位杂交和膜上杂交反响来说， 标记反响可告完毕，上述反响液置-20保存至少一年以上。且可反复使用。可依据下表估量标记产量：DNA 模板量10ng30ng 100ng 300ng 1000ng3000ng 标记一小时45ng130ng 270ng450ng 850ng1350ng 标记二十小时600ng1050ng 1500ng 2023ng 2300ng 2650ng二核酸探针膜上杂交原理和操作

6、一杂交总原则脱氧核苷酸通过磷酸二酯键缩合成长链构成 DNA 的一级构造。两条碱基互补的多核苷酸链按碱基配对原则形成双螺旋，构成 DNA 的二级构造。某些条件(如酸碱、有机溶剂、加热)可使氢键断裂，DNA 双链翻开成单链重结合。所谓杂交，是具有肯定互补挨次的核酸单链，DNA 单链仍旧可与序列同源的单链按碱基互补原则结合成异源性双链的过程。二杂交膜的选择杂交膜可以选择硝酸纤维素膜和尼龙膜。硝酸纤维膜的优点在于本底较 低，但只能用于显色性检测，且不能用于重简单交。尼龙膜分为带正电荷的膜和不带电荷的膜两种。带正电荷的尼龙膜对核酸结合力强，敏感性也较高。不带电荷的膜结合力低，相应敏感性也较低。尼龙膜的优

7、点在于杂交用过的膜， 用洗脱液(0.1SSC，0.1%SDS)煮沸 5-10 分钟后去除探针，可用于的探针杂交。假设对杂交结果不满足，如背景太高或显色不强，也可洗去探针之后重杂交。三探针浓度探针浓度是获得抱负杂交检测的关键因素，浓度太高则会导致本底太深； 假设浓度太低又会导致信号减弱。为了解决过高探针浓度所引起的高背景，必需进展模拟杂交试验。所谓模拟杂交试验，即选择几小片杂交膜，在未转移 DNA 的状况下，进展封闭、不同浓度的探针孵育及随后的免疫检测。以背景能被承受的最高探针浓度为正式杂交试验的浓度。模拟杂交试验不同浓度的探针可以参考下述方法配制：取 5l 标记反响液加 1ml 探针稀释液，混

8、匀。取0.5ml 等倍释后，再取0.5ml 连续等倍稀释。假设 20l 标记反响液中含 1g 标记的探针，则系列稀释探针的浓度分别是：200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml。四预杂交和杂交液预杂交和杂交都使用一样缓冲液，不同的仅仅是预杂交液中不含有探针。下面是几种根本杂交液配方：5SSC,Standard buffer:0.1%(w/v) N-Lauroylsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1% Blocking Reagent。Standardbuffer+50%formamide50%formamide(de

9、ionized),5SSC, 0.1%(W/V)N-Lauroylsarcosine,0.02 %(w/v)SDS,2% Blocking Reagent。HighSDSbuffer(Churchbuffer):7%SDS,50%formamide(deionized),5SSC,2%Blo ckingReagent,50mM Sodium Phosphate,0.1% N-Lauroylsarcosine五Southern BlottingDNA 片段经电泳分别后按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上。1975 年Southern 制造了利用浓盐溶液的推动作用将变性的单链 DNA 转移到硝酸纤维素膜

10、上的方法，解决了原位转移的问题。虽然其原理和操作均很简洁，却是基因分析中必不行少的手段，已经得到了广泛的应用。 Southern 印迹杂交包括两个主要步骤把电泳分级的 DNA 转移到固相支持膜上。与标记的 DNA 探针杂交。1Southern 转移首先将 DNA 用限制性内切酶消化。预备肯定浓度的琼脂凝胶。琼脂凝胶必需是高纯度和核酸级的。电泳后经溴化乙锭染色并在紫外灯下照相后，将需要转移的琼脂糖凝胶切下，放入搪瓷盘中，然后进展下面的步骤。试剂a.0.25M HC1b.变性液： 0.5N NaoH,1.5M Nac1c.xx：0.5M Tris-HC1,pH7.4,3M Nac1 d.20SSC

11、：0.3M 柠檬酸钠,3M Nac1e.2SSC：0.03 M 柠檬酸钠,0.3M Nac1程序：（1） 将胶浸入0.25M HC1 中 10 分钟。HC1 处理的作用主要是通过去嘌呤使 DNA 分子断裂，因而有利于高分子量 DNA 的转移，但不能处理时间过长。要转移全部小于10kb 的 DNA 片段时可省略此步骤。（2） 进入变性液之前，用蒸馏水漂洗 20-30 分钟。（3） 把胶浸入变性液中，室温浸泡 15 分钟2 次。（4） 蒸馏水漂洗凝胶 2 次。（5） 把胶浸入中和液中，室温泡 15 分钟2 次。（6） 在处理凝胶的同时，切一张与胶同样大小的尼龙膜或硝酸纤维膜。硝酸纤维膜用 2SSC

12、 浸泡。剪两张 Whatman3#滤纸和一叠吸水用的粗滤纸留意不能用手指直接触及膜面。（7） 预备转移用平器和支架，平器中放 20SSC。架子上搭滤纸桥使溶液能够虹吸上来。（8） 依次放：处理好的凝胶，硝酸纤维素膜，吸水滤纸，玻璃板，适量重物(500- 1000g)留意：要检查 PH 值，用硝纤膜时 PH9。要确保各层间没有气泡，否则会发生局部“绝缘”，气泡处的 DNA 难以被吸到硝酸纤维膜上。（9） 于室温转移 12-20 小时。（10） 取出转移膜，用 2SSC 漂洗数次，以去掉可能粘附于膜上的凝胶。（11） 固定：可选择下述方法之一进展 DNA 固定紫外线固定：使用长波紫外线照耀 10-

13、20 分钟，简洁漂洗后枯燥备用。xx 膜置+120烘烤 30 分钟。硝纤膜置真空烤箱中，80减压烘烤 2-2.5 小时，以避开硝纤膜自熔。假设无真空烤箱，亦可在一般烤箱中 65-70烘烤 3-4 小时，也能到达固定目的。 固定后，将膜封于塑料袋中，保存于枯燥处待杂交。留意事项 转移液的盐浓度对转移具有肯定影响。应选择 20SSC 快。10SSC 转移速度较快，对于高分子量 DNA(10Kb)效果比较抱负。因此要依据不同目的选择适当的转移液。现象。硝酸纤维膜对于转移时不能移动上边重物，防止消灭“重影”0.5kb 以下的小分子 DNA 结合不牢，转移时简洁丢掉。要探测小片时最好用尼龙膜。2 .So

14、uthern 印迹杂交成功的关键因素之一在于选择杂交液。应通过预试验来选择适宜的杂交液。另一个比较重要的因素是标记探针的浓度，一般选择5- 25ng/ml，应通过模拟杂交试验来选择适宜的探针浓度。试剂a.Standard bufferb.Standard buffer+50% formamide c.High SDS bufferd.Wash Solution I:2XSSC, 0.1%SDSe.Wash Solution:0.5XSSC,0.1%SDS程序将转移好的尼龙膜或硝纤膜装入塑料袋中，每边各留 2-4mm 空隙。灌注杂交液的一边留 1cm 空隙。在角上剪开一个小口，灌注预杂交液，从切

15、口处赶走气泡，用封膜机封口，浸入水浴中。20 小时：依据所选择的不同预杂交液，承受不同的温度预杂交 4-Standard buffer:预杂交温度 65-68，Standard buffer+50% formamide:37-42，High SDS buffer:37-42。使用双链 DNA 探针时，沸水浴 10 分钟以变性探针。然后快速插入冰中。按模拟杂交试验所确定的探针浓度将适量探针参加到预杂交液中，配成杂交液，一般浓度 5-25ng/ml 3.5ml 配制杂交液。按每 100cm2 膜参加至少使用和预杂交一样的杂交温度，一般杂交 16-20 小时。杂交完毕后，取出杂交袋，剪开一个小口，将

16、杂交液倒入带盖的试管 中，储存于-20以备下次使用。这样至少可保存一年。再次使用之前应在冻融之后，加热至+9510 分钟以变性探针。杂交液如含有 50%甲酰胺，则在 68变性 10 分钟即可。取出杂交膜，用 Wash Solution I 洗 5 分钟3 次。保温冲洗：用 Wash Solution于 68冲洗 15 分钟2 次。(六)DNA Dot Blotting此检测方法用于快速定性筛选 DNA。样品可以是纯化 DNA，也可以是细胞碎片 PCR 扩的 DNA。预杂交和杂交方法与 Southern 根本全都，不同的仅是样品的处理不同。 试剂：DNA dilution buffer 10mM

17、 Tris-HC1；1mM EDTA,PH 8.0；50g/ml herringSperm DNA程序将样本 DNA 稀释成不同浓度。将样本 DNA 于+95水浴 10 分钟，快速插入冰中。取 1l 点样至尼龙膜或硝纤膜上。点样前先画上圆卷做记号。用紫外线照耀固定或+120烘烤 30 分钟固定。其后杂交步骤 Southern 一样七DAB 显色检测法试剂：a. .BiotinMouseAntiDigoxin200lb. SABCPOD200lc. DAB Stock Solution5ml d.冲洗液：0.1M Tris-HC1,0.15M Nac1, PH7.4。e.封闭液：1% Block

18、ing Reagent/ 0.1M Tris-HC1,0.15M Nac1。f.显色缓冲液：0.1M PBS,150mM Nacl,PH7.4。g.TE 缓冲液：10mM Tris,1mM EDTA,PH8.0程序：1.2.3.4. 经过杂交及杂交后的冲洗之后，膜置于冲洗液中平衡 1 分钟。用干净的杂交袋或平皿，封闭液室温封闭 60 分钟。用冲洗液冲洗 5 分钟3 次，每次 100ml。用封闭液(e)1：1000-2023 稀释 BiotinMouseAntiDigoxin，例如 10l BiotinMouseAntiDigoxin 加至 10-20ml 封闭液中(稀释液+4可稳定 24 小时

19、左右)。将适量稀释抗体参加杂交袋中 37反响 1-2 小时。5. 用冲洗液冲洗 5 分钟3 次，每次 100ml。6. 用封闭液(e)1：1000-2023 稀释 SABC，例如 10lSABC 加至 10-20ml 封闭液中(稀释液+4可稳定 24 小时左右)。将适量稀释 SABC 参加杂交袋中 37反响1-2 小时。7. 用冲洗液冲洗 15 分钟3 次，每次 100ml。8. 按 1：40 配制底物显色液：250l 储藏液加至 10ml 显色缓冲液中，用前加最终浓度为0.03%的 H2O2，室温显色 530 分钟左右。 当所需要的显色点或带消灭之后，蒸馏水洗以终止反响。结果可以进展照相记录

20、。还有一种选择是让膜枯燥保存。三原位杂交所谓原位杂交是指在保存染色体、细胞或组织构造的前提下，用探针定位检查出相关基因序列。结合免疫细胞化学，原位杂交可以提醒出基因在DNA、mRNA 水平的表达。原位杂交技术最早 Pardue and Gall 和 John etal。分别在 1969 年觉察。最初，放射性标记技术是唯一的方法，其使用受到明显限制。由于非放射性标记技术的简洁、高敏感性，为原位杂交技术广泛应用开避了道路。一染色体原位杂交的一般技术1 玻片预备为了开放染色体，酒精清洁玻片即可。但为了防止细胞和组织的脱落，必需用多聚赖氨酸或 APES 处理玻片。2 固定为了保存形态构造，生物材料都必

21、需予以固定。染色体的固定比较简洁， 甲醇/乙酸固定即已足够。假设是石蜡包埋组织，承受福尔马林固定。冰冻切片承受4%甲醛或 Bouin”s 固定液固定 30 分钟。应予留意的是，DNA 和 RNA 虽然不和各种交联剂反响。但包围 DNA.RNA 的各种蛋白质和交联剂反响后，就会遮盖住靶核苷酸。因此，必需实行各种增加通透性的程序。3 玻片上材料的预处理a.内源性酶的灭活假设用酶作为标记物，内源性酶必需预先予灭活。如过氧化物酶，可用1%H2O2/甲醇 30 分钟处理。至于碱性磷酸酶，由于杂交过程的破坏，剩余碱性磷酸酶的活力会完全消逝。b. RNA 酶的处理DNA-DNA 杂交时需要处理内源性 RNA

22、。内源性 RNA 的存在，会由于 DNA-RNA 的杂交而增加背景。处理方法： DNase-free RAase(100g/ml)/2SSC,37孵育 60 分钟。(SSC=150mMNac1,15mM Sodium Citrate,PH 7.4)c. HC1 处理 用 200mM HC1 处理 20-30 分钟可以增加信/噪比值，其机理尚不清楚。可能与蛋白的抽提和局部功能核苷酸片断的溶解有关。d. 去垢剂处理在脂膜成分未被固定，脱水、包埋等程序抽提时，可以进一步使用去垢剂处理，如 Triton X-100,Sodium dodecyl Sulfate 等，同样有助于原位杂交技术。e. 蛋白酶

23、消化蛋白酶消化有助于增进探针和核苷酸之间的接触性。消化通常用蛋白酶K， 溶于 20mM Tris-HC1,2mMCac12，PH7.4 ,3715-30 分钟。蛋白酶K 浓度依不同对象来确定。例如对染色体和核的分别局部，可以用 1g/ml 蛋白酶K。4 探针和靶基因的变性对染色体 DNA 的原位杂交，必需进展变性处理。热变性越来越常用，它不仅简洁，而且效果很好。对不同的杂交，应试验不同的时间和温度，以找到最正确的变性条件。热变性时，探针和靶基因可以同时变性。将探针加到玻片上，盖上盖玻 片。玻片放到 80，2 分钟后取出冷却至 37。假设是组织切片，变性时间应到达 8010 分钟。组织和细胞 m

24、RNA 的杂交则不需变性处理。5 杂交后的冲洗标记探针能够和其序列具有局部同源性的基因非特异性的杂交。这类杂交分子的稳定性总是不及完全同源的杂交分子。分别用不同强度冲洗液可以有效地洗掉非特异杂交的/探针，而保存特异杂交的探针。冲洗液的强度可通过转变甲酰胺浓度、盐浓度和温度来掌握。通常用 2SSC50%甲酰胺来冲洗。有时可用更高强度的冲洗液。总的来说，杂交时用高强度缓冲液，冲洗时用低强度的冲洗液(盐浓度越低，甲酰胺浓度越高和温度越高，则冲洗强度越大)。6 免疫细胞化学免疫细胞化学和常规方法一样，必需先进展非特异性的封闭处理。如探针为地高辛标记时，Tris-HC1 缓冲液含“Blocking Re

25、agent”。此外0.4M NaCl 的参加也有助于降低背景。免疫细胞化学中最常用的酶是过氧化物酶和碱性磷酸酶。前者用 DAB 作显色剂。后者用 BCIP/NBT 作显色剂，方法同膜上杂交。显色强度由显微镜下掌握。7 影响原位杂交的主要因素a.探针 xx：原位杂交和其它杂交方法不同，它要求较短的探针。由于探针越短，渗透性越强，可以渗透至细胞内部和染色体。不同的杂交所允许的最小核苷酸如下述公式所计算：b. 探针浓度 ：浓度越高，则杂交速度越快。但过高的浓度也会使背景增加，因此，宜选择可承受背景的最高探针浓度。c. 硫酸萄聚糖：在水溶液中，硫酸萄聚糖是高度水化物质，因此使得大分子(如探针)难以接触

26、到其结合水，相对浓度大大增加，杂交速度明显加快。d. 碱基错配：碱基错配会引起杂交速度及二倍体的稳定性下降。因此在严格的杂交条件下，可以阻挡探针与靶基因的非特异结合。e. 冲洗条件8 杂交标准条件适于 DNA 探针100bp50%去离子甲酰胺2SSC50mM NaH 2PO4/Na2HPO4,PH7.01mM EDTA载体 DNA任选组合：1Denhardtsdextran sulfate,1-10%温度 37-42杂交时间：5-16 小时二组织切片的原位杂交目前，原位杂交已成病理学的一个有力工具，原位杂交可以用于诸如病 毒，癌基因，基因突变等领域的检查。尤其是非放射性标记探针技术，为更多的试

27、验室广泛应用原位杂交制造了条件。对福尔马林固定、石蜡包埋切片的原位杂交，关键是以下三个步骤 ：靶 DNA 的暴露。这要靠细心设计的消化步骤。DNA 的变性和杂交。杂交的分子的冲洗和检测。1 探针的预备2 玻片的处理去污剂浸泡一晚，大量自来水冲洗，然后用蒸留水清洗。枯燥之后，浸入丙酮中 3 分钟。玻片移入 1：50 丙酮稀释的 APES 溶液中，浸泡 5 分钟。玻片用蒸馏水略加清洗。枯燥备用。处理后的玻片置枯燥无尘环境可保存半年。玻片也可用“多聚赖氨酸”处理。3 组织切片的预备组织用常规 4%中性缓冲甲醛溶液固定，石蜡包埋。常规切片。切片捞于涂有粘片剂的玻片上。切片处理：先置 60烘片 30 分

28、钟。二甲苯脱蜡，逐级酒精至水清洗。临用前配制蛋白酶K 溶液： 储藏液：ProteinaseK,10mg/mlH2O，小量分袋-20保存。将储藏液用 TES 稀释成 100g/ml。TES=5mM Tris-HC1,10mM EDTA,10mM Nac1,PH7.4每张切片用 Proteinase k20-30l 37消化 5-15 分钟。消化过程中加盖硅化盖玻片，并置湿盒中。留意消化对组织原位杂交是至关重要的。过度消化会导致切片消逝殆尽， 消化缺乏则敏感性不够，因此应针对不同组织尝试不同的消化条件。4 杂交蛋白K 消化后，去除盖玻片。用 4%甲醛 4固定 5 分钟。蒸馏水洗 5 分钟。让切片上

29、水分滴下去，并在室温枯燥 5 分钟。留意只能让切片上水份削减，不能让切片完全枯燥。每张切片加 5-10l 探针(大切片需相应增加)。设立严格的比照组，每张切片加 5-10l 不加探针的杂交液。切片上加硅化盖玻片，将玻片置+95变性 6 分钟。把玻片放到冰上 1 分钟。切片置温盒，42杂交 3 小时以上。假设便利，应杂交过夜。5 冲洗去掉盖玻片，按下述程序冲洗2SSC 洗 5 分钟2 次(室温)01SSC 洗 10 分钟(42)6 杂交分子的免疫检测切片置于01M TBS 缓冲液中，PH74每张切片加 20-40l 封闭液：1%Blocking Reagont/0.1M TBS。 室温反响 15

30、 分钟。 用封闭液 1：1000 稀释 Biotin MouseAntiDigoxin,每张切片加 20-50l 稀释试剂，湿盒室温反响 1-2 小时。用01M TBS 洗 5 分钟3 次。用封闭液 1：1000 稀释 SABC，37反响 60 分钟。01M TBS 洗 10 分钟3 次。配显色剂： 将 DAB 储藏液用01M PBS，PH75 缓冲液 1：20 稀释。加最终为0.03%H2O2。每张切片加 50l，一般显色 5-30 分钟。信号弱时显色延长。三细胞的原位杂交下面的程序是用标记 DNA 探针来检测培育细胞中的 mRNA。其它类型的检测可以参照此程序进展。1 细胞预备，固定和增加

31、通透性留意：全部溶液都必需用 RNase 抑制剂处理。玻片用多聚赖氨酸处理。直接用 5%CO2 在玻片上培育细胞。所用培育基为无酚红 Dulbecco”s 根底培育基。37PBS 清洗细胞。然后用下述固定液室温固定 30 分钟：4%甲醛，5%乙酸和09%NaC1。室温 PBS 清洗固定细胞，用 70%乙醇储存于 4杂交前用下述方法脱水：70%，90%和 100%乙醇；10%二甲苯；然后再用 100%，90%，70%乙醇，最终 PBS 洗二次。 用胃蛋白酶消化固定细胞： 0.1%Pepsin/0.1N HC1,375-10 分钟。PBS 洗 5 分钟后，1%甲醛固定 10 分钟。PBS 洗。其余

32、步骤参照组织切片程序实行。附录一：各种溶液的配制1SSC：150mM Nacl 15mMSodium Citrate PH 7.020SSC：3M Nac1 300mM Sodium Citrate PH 7.010SSC：1.5M Nac1 150mM Sodium Citrate PH 7.0Washing Solution 2SSC：300mM Nac1 30mM Sodium Citrate Washing Solution0.5SSC：0.5SSC+0.1%SDSWashing Solution0.1SSC:0.1SSC+0.1% SDSN-Lauroylsarcosine:10%(

33、w/v)in Sterile H 20,filtered through a0.2-0.45m membraneSDS 10%(w/v)in Sterile H 2O:filtered through a 0.2-0.45mmembraneDenaturation Solution(for Southern transfer)： 0.5N NaoH,1.5M Nac1Neutralization Solution(for Soutiern transfer)： 0.5M Tris-HC1,3M Nac1,PH7.4Blocking Reagent：加 10g Blocking Reagent

34、至 100ml 01M TBS，PH74 缓冲液中。搅拌以助溶解。假设必要时，加01%DEPC(dimethylpyrocarbonate)。Standard hybridization buffer:：5SSC,0.1 N-lauroylsarcosine0.02% SDS 1% Blocking ReagentStandard hybridization buffer+50% formamide：5SSC，50% deionized formamide,0.1% N-Lauroylsarcosine,0.02% SDS，2% Blocking ReagentHigh SDS Concent

35、ration hybridization buffer：7%SDS,50% deionizod formamide,5SSC,2% Blocking Reagent,50mM Sodium Phosphate,PH7.0，0.1% N-Lauroylsarcosine500ml High SDS hybridization buffer 可按下述方法配制： formamide250ml，30SSC83ml，1M sodium Phosphate,PH100% deionized7.0 25ml，10% blocking solution100ml，10% N-Lauroylsarcosine

36、5ml将上述混合液倒入有 35g SDS 的烧瓶中(通风橱)。搅拦促进溶解，最终参加灭菌水至 500ml。储存于-20。Detection Washing buffer： 0.1M Tris-HC1,0.15M NaC1,PH7.4Detection buffer：0.1M PBS,150mM Nac1,PH7.4TE buffer：10mM Tris-HC, 1mM EDTA,PH 8.0。玻璃和塑料器皿的硅化：先将待硅化器皿放入玻璃真空枯燥器中；加 1ml 二氧二甲基硅烷于一小烧杯中，放入枯燥器。将真空枯燥器与真空泵相连。抽气至二氯二甲基硅烷沸腾。关闭真空泵，保持枯燥器的真空。1-2 小时

37、后，渐渐往枯燥器内通气，取出器皿 180烘烤 2 小时，塑料器高压消毒，用前用水冲洗干净。附录二：使用留意事项核酸探针的标记及杂交是一个很简单的过程，步骤多耗时长，影响因素 多。要想获得抱负结果，每一步都应严格操作。下面几个问题尤其应予留意：无菌操作：标记和杂交的各种溶液应高压灭菌；含 SDS，Tween20 的溶液应在滤膜除菌后参加其它溶液；使用灭菌吸头。使用干净平皿：每次用前必需严格清洗 。膜的操作：操作膜时戴无尘的手套；只用无齿镊操作膜的边缘。原位杂交：每步反响均应加盖硅化的盖玻片有关参考文献1. Rigby,P.W.J,et al.Labeling deoxyribonucleic a

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