发酵工程全重点总结.docx

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1、一绪论1 生物技术biotechnology: “应用自然科学及工程学原理、依靠生物作用剂的作用将物料进展加工以供给产品或为社会效劳”的技术。2 发酵的英文 Fermentation 是从拉丁语ferver 即“翻腾”、“沸涌”、“发泡”而来；由于发酵有鼓泡和类似翻腾、沸涌的现象。如中国的黄酒、欧洲的 beer 就以起泡现象作为推断发酵进程的标志。3 发酵广义通过微生物的培育使某种特定代谢产物或菌体本身大量积存的过程。狭义厌氧微生物或兼性厌氧微生物在无氧条件下进展能量代谢并获得能量的一种方式。4 发酵工业：巴斯德经纯种培育和提炼精制获得的成分单纯、无风味要求的产品的生产过程叫发酵工业。如酒精、

2、抗生素、柠檬酸、氨基酸、酶、维生素、某些色素等。、5 就发酵产品而言，发酵主要有以下主要类型：微生物菌体发酵； 酶制剂和酶调整剂的微生物发酵； 以微生物的代谢产物包括初级代谢产物和次级代谢产物为目的产物的微生物发酵； 微生物转化发酵； 工程菌和工程细胞产物的发酵等。6 生物发酵工业的进展简史 ：传统古老生物技术的追溯 ；第一代初期生物技术产品的消灭 ；其次代近代生物技术产品的进展 ；第三代现代生物技术产品的挑战。最早的发酵产品据记载起源与5000BC。据记载最早的发酵食品应是酒类，通常认为是 wine,由于大自然中具备了野生果类和酵母菌，条件适宜状况下即行发酵。在神话传奇中亦有猿猴酿酒之说。由

3、于自然界中资源的多样性F、M，便有了多种多样的发酵食品。 4000BCBeer，至古埃及即消灭了麦芽糖化。 50006000BCwine、黄酒、白酒、Cheese 4000BCBeer，至古埃及即消灭了麦芽糖化。(酱油、调味品) 白酒：农业社会粮食节余，生霉、发酵、蒸馏而得第一个转折点微生物纯种分别培育技术建立：自然发酵时期：知其然而不知其所以然，如厌气性酒类，好气性醋。微生物纯种分别培育技术，开创了人为掌握微生物时代，削减了腐败现象，实现了无菌操作；制造了简便的密封式发酵罐；人工掌握条件，提高发酵效率，稳定产品质量。1. 发酵是由微生物进展的一种化学变化，不同类型的发酵是由形态可以区分的各种

4、特别的微生物所引起的。 2. 1870 年，Pasteur 觉察了微生物之间有相互抑制的作用。即拮抗作用。 3. 其间 1804 年，法国厨师阿卑特Appert制造了瓶装罐头其次个转折点通气搅拌的好氧发酵工程技术建立深层液态发酵： 20 世纪 40 年月，由于二战爆发，刺激了抗生素发酵工业的兴起，成功建立起深层通气培育法及整套工艺，包括向发酵罐内通入大量无菌空气、 通过搅拌使空气分布均匀、培育基的灭菌和无菌接种 、通氧量、pH、培育物供给等均已解决，刺激了有机酸、酶制剂、维生素、激素等的大规模生产。 1928 年，Fleming 觉察了青霉素，开创了好气性发酵工程，建立了通风搅拌技术。第三个转

5、折点人工诱变育种和代谢掌握发酵工程技术的建立：以动态生物化学和遗传学 为根底，将微生物进展人工诱变，选育高产菌株，实现有选择地大量生产目的产物。该技术先在氨基酸生产上 获得成功，而后在核苷酸、有机酸、抗生素等其它产品中得到应用。7 发酵工业的培育方法及过程 ：1外表培育法是以微生物在基质外表进展培育的方法，依据所用培育基种类的不同，可以分为固体外表发酵和液体外表发酵。 2深层培育法是以微生物细胞生长于液体培育基深层中进展培育的方法。8 微生物发酵其本质，可以理解为物质形式的转化过程，就是利用微生物生长所需的底物转化成特定的产物。在这个过程中，有两个问题是工业化需要解决的： 1产物的社会效益，

6、2物质转变过程中产生的经济效益，即：低价值的原材料、低能耗等。其次章 培育基1 培育基：是人工配制的供微生物或动植物细胞生长、生殖、代谢和合成人们所需产物的养分物质和原料，同时培育基也为微生物等供给除养格外的其它生长所必需的环境条件。2 适宜于大规模发酵的培育基的共同点：培育基能满足产物最经济的合成；形成的副产物尽可能的少； 因地制宜，质优价廉，本钱低；能满足工艺的总体要求。3 培育基分类根本状况按纯度分：合成培育基、自然培育基 按状态分：半固体培育基、固体培育基、液体培育基 按用途分： 种子培育基、孢子培育基、发酵培育基。合成培育基 definedmedium :所用的原料其化学成清楚确、稳

7、定。适于争论菌种根本代谢和过程的物质变化等科研工作；但养分单一，价格较高。 自然培育基 complex /undefinedmedium ：所用的原料是一些自然动植物产品。 原料来源丰富、价格低廉，适用于工业生产；但组分简单，不易重复，如对原料质量等方面不加掌握会影响生产的稳定性。发酵工业普遍使用自然培育基。半合成培育基(semi-defined medium)固体培育基 solid medium ：比较适合于菌种和孢子的培育和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类。半固体培育基 semi-solid medium ：主要用于鉴定菌种，观看细菌运动特征及噬菌体的效价滴定等。在配好的液体培育基中参加

8、少量琼脂0.5%0.8%。 液体培育基 liquid medium ：配有可溶性的或不溶性的养分成分， 80% 90 %是水，是发酵工业大规模使用的培育基。种子培育基 seed medium ：供孢子发芽、生长和大量生殖菌丝体并使菌体长得粗大，成为活力强的“种子”。孢子培育基 spore medium ：制备孢子用的，要求此种培育基既能形成大量的优质孢子，又不引起菌种的变异。发酵培育基 fermentation medium ：供给菌体生长生殖和合成大量代谢产物用的。4 培育基的成分和来源：氮源有机氮源、无机氮源、碳源、水、无机盐与微量元素磷、钙、镁、硫、铁 、氯、钠、钾、钙、锌、钻、锰、铜等

9、、其他。一碳源：最主要的组成 但凡用于构成微生物细胞和代谢产物中碳素来源的养分物质均称为碳源。碳源有糖类、脂肪酸、有机醇、碳水化合物。 1在特别条件下，蛋白质水解产物氨基酸也可作为碳源。2菌种不同对不同碳源的利用速度和效率也不同 3葡萄糖是碳源中最易利用的糖，可作为加速微生物生长的一种有效的糖.二 氮源：指构成微生物细胞和代谢产物中的氮素来源的养分物质。主要功能：构成微生物细胞和含氮的代谢产物，当培育基中碳源缺乏时，可作为补充碳源。有机氮源除含有丰富的蛋白质、多肽和游离氨基酸外， 还含有少量的糖类、脂肪、无机盐、维生素及某些生长因子。 无机氮源也称之谓快速利用的氮源。 微生物对它们的吸取利用一

10、般比有机氮源快。但无机氮源的快速利用常会引起 pH 的变化。 生理酸性物质：经微生物代谢后形成酸性物质的无机氮源，如硫酸铵。 生理碱性物质：经微生物代谢后形成碱性物质的无机氮源，如硝酸钠。三无机盐与微量元素：磷 核酸和蛋白质的必要成分 ；钙 钙盐过多时，会形成磷酸钙沉淀，降低了培育基中可溶性磷的含量 ；镁 离子状态时是很多重要酶的激活剂 ；硫 含硫氨基酸的组成成分和某些辅酶的活性基 ；铁 细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的成分 ；氯 对一些嗜盐菌需要 ；钠、钾、钙 离子不参与细胞的组成，但是微生物发酵培育基的必要成分 ；锌、钻、锰、铜等微量元素大局部作为酶的辅基和激活剂。磷P培育基中特别重

11、要的元素，是构成核酸，磷脂的成分，并参与ATP,GTP 的能量转移反响。 一般需添加磷酸盐，如KH2PO4, K2HPO4, NaH2PO4, (NH4)2HPO4 硫：含硫氨基酸胱氨酸，半胱氨酸，蛋氨酸等的组成局部，辅酶的活性基。一般添加 Na2SO4, MgSO4。K, Na, Ca 虽不参与细胞的组成，却是培育基中的重要成分。Na 与维持细胞的渗透压有关，促使某些酶的产量。K 与渗透压有关，并且是很多酶的激活剂，还可促进糖代谢。Ca2+ 以离子状态掌握细胞透性和调整酸度。 CaCO3 的作用： Ca2+ 对淀粉酶， 蛋白酶，脂肪酶等多种酶活性起到格外重要的稳定和活化作用。 常用 CaCO

12、3, CaCl2 供给钙，一般不与 K2HPO4 一起使用。使用时， CaCO3 是单独灭菌，在培育基调到中性后才参加，在酸性培育基中易被分解，失去其缓冲力量。 Mg 某些细胞的叶绿素成分，是很多重要酶的激活剂，常用 MgSO4，留意在碱性溶液中会生成沉淀。 Fe 细胞色素，细胞色素氧化酶，过氧化氢酶的成分，对代谢产物的合成有较大影响。Cl 氯离子不具养分作用， 对一些含氯代谢物的发酵，还需参加 0.1%KCl 补充。 其他一些微量元素， Mn, Zn, Co 等，一般不需再参加。四生长因子:但凡微生物生长不行缺少的微量有机物质都称为生长因子。包括：维生素，生物素，嘌呤碱，嘧啶碱，氨基酸等。维

13、生素，主要是B 族维生素的硫胺素，核黄素，泛酸，吡哆素，烟酰胺，叶酸，环己六醇，生物素，多为辅基, 辅酶。发酵工业广泛使用的大多是自然原料，如玉米浆，麦芽汁，豆芽汁，酵母膏等，既是 N 源，又可供给生长因子。五前体促进剂和抑制剂 ：发酵培育基中某些成分的参加不促进微生物的生长，只是有助于调整产物的形成，这些添加的物质包括前体，抑制剂和促进剂。前体物质指某些化合物参加到发酵培育基中，能被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，其自身构造并无多大变化，但产量却因前体的参加有较大提高。前体参加量可以通过计算确定。抑制剂参加后会抑制某些代谢途径的进展，使另一途径活泼，从而获得人们所需要的某种代谢产物

14、，或使正常代谢的某一代谢中间物积存。最初应用于甘油发酵，抗生素工业应用最多。促进剂指那些既不是养分物，又不是前体，但能提高产量的添加剂，如酶生产中的诱导物或外表活性剂等。诱导剂能增加细胞的产酶速度，提高产酶量。但不能从根本上转变细胞原有的蛋白质模板，包括酶的底物，底物类似物，及被转化为诱导物的前体物质。5、培育基的设计和优化 ：一培育基的配制原则 举例： 发酵生产常承受自然成分的液体培育基。而且，常常用野生的植物淀粉、甘蔗渣、秸秆，以及乙醇、醋酸等石化产品代替粮食来配制培育基。1.培育基组分应适合微生物的养分特点目的明确：即依据不同微生物的养分需要配制不同的培育基。不同养分类型的微生物，其对养

15、分物的需求差异很大。如自养型微生物的培育基完全可以或应当由简洁的无机物质组成。异养微生物的培育基至少需要含有一种有机物质，但有机物的种类需适应所培育菌的特点。 按微生物的主要类群来说，它们所需要的培育基成分也不同：细菌： 牛肉膏蛋白胨培育基、 LB (Luria-Bertani) 放线菌：高氏一号培育基真菌： 查氏合成培育基、PDA (Potato-Dextrose-Agar) 酵母菌；麦芽汁2.养分物的浓度与比例应恰当 养分协调浓度过高微生物的生长起抑制作用，浓度过小不能满足微生物生长的需要。碳氮比C/N直接影响微生物生长与生殖及代谢物的形成与积存，故常作为考察培育基组成时的一个重要指标；C

16、/N 比值=碳源中的碳原子的 mol 数氮源中所含的氮原子的 mol 数例：谷氨酸生产中? C/N 4/1 时，菌体大量生殖，谷氨酸积存少；C/N3/1 时，菌体生长受抑制，而谷氨酸大量增加。速效性氮或碳源与迟效性氮或碳源的比例各种金属离子间的比例用于大量生产代谢产物的培育基其氮源一般应比种子培育基稍低，但假设发酵产物是含氮化合物时，有时还应提高培育基的氮源含量3.物理化学条件适宜条件适宜1pH:各类微生物的最适生长 pH 值各不一样： 细 菌：7.08.0 放线菌：7.58.5 酵母菌：3.86.0 霉 菌：4.05.8在微生物的生长和代谢过程中，由于养分物质的利用和代谢产物的形成与积存，培

17、育基的初始 pH 值会发生转变，为了维持培育基 pH 值的相对恒定，通常承受以下两种方式：内源调整：在培育基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调整培育基的碳氮比。外源调整：按实际需要不断向发酵液流加酸或碱液4.依据培育基的应用目的选择原料及其来源经济节约该培育基的应用目的，即： 是培育菌体还是积存代谢产物？ 是试验室种子培育还是大规模发酵？ 代谢产物是初级代谢产物还是次级代谢产物？用于培育菌体种子的培育基养分应丰富，氮源含量宜高碳氮比低；用于大量生产代谢产物的培育基其氮源一般应比种子培育基稍低，但假设发酵产物是含氮化合物时，有时还应提高培育基的氮源含量；假设代谢产物是次级代谢产物时要考虑是否参加

18、特别元素或特定代谢产物的前体物；当所设计的是大规模发酵用的培育基时，应重视培育基中各成份的来源和价格，应选择来源广泛、价格低廉 的原料，提倡以粗代精，以废代好。二影响培育基质量的因素 1、原料和设备的预处 2 原材料质量 3、发酵特性变化 4 灭菌第三章：灭菌和除菌1、灭菌：杀死一切微生物，包括芽孢。 分为杀菌：菌体尚存 和溶菌：菌体消逝消毒：只杀死病源菌，未伤及芽孢防腐：临时抑制微生物生长除菌：用冲洗、过滤等法，除去微生物是保证生产成功的重要手段2、灭菌的方法：可分为化学灭菌和物理灭菌（1） 化学灭菌 ：利用化学药剂杀灭或抑制微生物的方法。依据浓度，可分为抑菌剂、消毒剂、灭菌剂；依据状态，可

19、分为液态喷雾、浸泡、洗刷等，气态加热、焚烧、氧化等。一气雾消毒灭菌法 ：要求 密闭条件下保持肯定时间 ； 种类 ：甲醛和气雾盒甲醛 有刺激性和腐蚀性。机理：结合蛋白质氨基， 使其变性 。用法： 喷：5%熏：10ml/m3+1/2KMnO4气雾消毒盒特点：粉末状、刺激性小、集中力及渗透性强用法：26g/m3点燃 熏 30min 以上二液体消毒法：概念 固体或液体药品加水配成药液多现配现用种类 ：氧化剂、外表活性剂乙醇、酚类、洁尔灭、熟石灰常用灭菌剂及有效浓度：洁尔灭(苯扎溴铵)0.25%甲醛 37%杜灭芬 0.25%戊二醛 2%高锰酸钾 0.1%-0.25%苯酚 0.1%-0.15%漂白粉 5%

20、过氧乙酸 0.02%-0.2% 酒精 75%焦碳酸二乙酯 0.01%-0.1%煤酚皂来苏尔 1%5% 药品及浓度的选择依据 ：微生物特点 、物品的性质 、消毒目的 、环境影响药品标准：性质稳定 、易溶于水 、杀菌力强 、抗菌谱广 、作用较快 、使用浓度低 、价格低廉 、没有毒腐性或很小。（2） 物理灭菌一辐射灭菌法 ：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反响造成菌体死亡。包括高频灭菌法、放射线灭菌法、紫外线灭菌法电离辐射(1) 射线:电离辐射强 ， 穿透力差 缺乏穿透力，不有用(2) 射线:电离辐射强 ， 穿透力强(3) 射线:电离辐射弱， 穿透力强(4) X 射线：杀菌力不如紫外线，穿透力

21、强用途：忌热物品的灭菌消毒、食品保藏和育种等方面杀菌机制：射线使水电离为 H和 OH，这些游离基是猛烈的复原剂和氧化剂，可直接作用于细菌本身 。杀菌机理 直接：使蛋白质、酶等变性失活间接：空气中产生臭氧或过氧化氢使用 ：有效距离：1.52.0m 抱负波长：265nm30w 紫外灯照 30min避光 30min二干热灭菌：利用高温对微生物有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。常用方法：灼烧和电热箱加热，140-180 1-2h。燃烧：废弃物、尸体 灼烧：接种环、试管口干烤：玻璃器皿红外线：医疗器械三湿热灭菌 ：高压蒸气灭菌法 、流通蒸气灭菌法 、间歇灭菌法 、煮沸灭菌法利用饱和水蒸气进

22、展灭菌。 蒸汽有很强的穿远力，而且在冷凝时放出大量冷凝热，很简洁使蛋白质凝固而杀灭各种微生物。四过滤除菌 :利用适当的过滤装置，通过过滤除去微生物的一种方法。通常使用的过滤装置有膜过滤器，磁制过虑器、玻璃纤维过虑器等。0.010.45 微米孔径滤膜， 用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。3、培育基灭菌（1） 试验室种子培育基灭菌:使用高压蒸汽灭菌锅。手提式灭菌锅，容量小。立式或卧式灭菌锅，容量较大，一般能装几十瓶或几百瓶。灭菌柜。要和蒸汽锅炉配套，用于大量种瓶培育基的灭菌，一次能装几百至几千瓶(袋)。（2） 发酵培育基灭菌分批灭菌实罐灭菌、实消灭菌 batch sterilizat

23、ion ：将配制好的培育基输入发酵罐内，用直接蒸汽加热，到达灭菌要求的温度和压力后维持肯定时间，在冷却至发酵要求的温度。连续灭菌连消灭菌 continuous sterilization ：培育基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后进入已灭菌的发酵罐内的工艺过程。（3） 分批灭菌操作过程:空罐预备：清洗、检修和检测。升温：把培育基加热到灭菌所需的温度。保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间。 冷却保压：把培育基的温度降低到接种的温度。（4） 分批灭菌设备示意图三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持肯定的时间。这就是所谓的“三路进气”。四路出

24、汽： 直接蒸汽从排气、接种、进料、消沫剂管排气 。（5） 连续灭菌流程：培育基配料、 配料罐、加热器、维持罐、冷却器、无菌培育基（6） 分批灭菌 优点： 1不需附加设备 2 蒸汽利用率高 3 节约劳动力 缺点 1 培育基质量比较差 2 罐的利用率低 3.冷却水用量大。连续灭菌 优点： 1 。承受高温快速灭菌法 2可以把培育基按其性质分开灭菌 3 有利于自动掌握 4节约冷却水 。缺点 1投资费用高 2对物料要求高 3蒸汽用量大（7） 高温对培育基的有害影响：消退高温有害影响的措施 承受特别加热灭菌法(连续灭菌方法 对易破坏的含糖培育基进展灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并； 对含 Ca

25、2+或 Fe3+的培育基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；对含有在高温下易破坏成分的培育基如含糖组合培育基可进展低压灭菌。4.发酵罐灭菌 ：培育基的灭菌假设承受分批灭菌，发酵罐与培育基一起灭菌。培育基用连续灭菌时，发酵罐在注入培育基前先行单独灭菌。5.空气除菌 ： 空气中的微生物种类以细菌和细菌芽孢较多，也有酵母，霉菌孢子和病毒。 这些微生物大小不一，一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上，空气中微生物的含量一般为 103104 个米 3。灰尘粒子的平均大小约 0.6 m 左右，所以空气除菌主要是去除空气中的微粒(0.6-1 m 无菌空气的标准百分数：99.99美国联邦宇航局等

26、级标准：100 级直径小于 0.5 微米粒子数少于 3.5 个/L 温度：25 40湿度：30%45%主要有： 加热、静电和介质过滤三种方法。两级分别、冷却、加热的空气除菌流程 ：粗过滤器、压缩机、贮罐、冷却器、丝网分别器、过滤器。膜过滤确定过滤利用微孔滤膜对空气进展过滤，膜的孔径 0.2-0.45 微米，大于这一孔径的微生物能确定截留。膜过滤器 ：聚四氟乙烯、偏聚二氟乙烯、聚丙烯、纤维素脂膜等氨基酸生产方法：1、蛋白水解法：酸水解：盐水、硫酸，110-120，12-24h；缺点 氨基酸构造被破坏，污染环境。碱水解：氢氧化钠、氢氧化钡，100，6h；缺点 氨基酸构造被破坏，消旋。酶水解缺点 水

27、解不彻底，可用于生产肽、胨等。2、化学合成法：丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。化学合成法借助于有机合成及化学工程相结合的技术生产氨基酸的一种方法。虽然化学合成法可以生产目前的全部氨基酸，但多数不具备工业价值，缘由是应用化学生产 的氨基酸含有 D 和 L 两种旋光异构体手性异构体，其中的 D- 异构体不能被大多数动物所利用。因此，用化学合成法生产氨基酸时除考虑合成工艺条件外，还要考虑异构体属性问题和 D- 异构体的消旋利用，三者缺一都影响氨基酸的利用。在氨基酸工业中应用化学合成法批量生产的氨基酸仅限于甘氨酸、蛋氨酸和色氨酸。其中，甘氨酸是应用化学合成法生产的最抱负的品种，由于甘氨酸没有旋光异构体。 D

28、L 混合型蛋氨酸及色氨酸能为畜禽利用，因此也具有肯定价值。3、酶法：利用微生物细胞或微生物产生的酶来制造氨基酸。应用此法批量生产的氨基酸有赖氨酸、 L- 胱氨酸。4、发酵法：发酵法生产氨基酸是利用微生物具有的能够合成其自身所需的各种氨基酸力量，通过对菌株的诱变等处理，选育出各种缺陷型及抗性的变异菌株，以解除代谢节中的反响与阻遏，到达以过量合成某种氨基酸为 目的的一种氨基酸生产方法。应用发酵法生产氨基酸产量最大的是谷氨酸，基次是赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸。另外，色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸等也可由发酵法获得，但因生产水平低，尚不具备有用价值。生产

29、菌株一般是各种养分缺陷型的黄色短杆菌。微生物细胞内氨基酸的生物合成都是利用能量代谢过程中衍生的一些中间代谢产物为起点，经过一系列伴随着自由能损失的不行逆反响，来保证各种氨基酸的不断供给。第四章菌种选育、制备与保藏第一节 微生物的特性及工业微生物的要求一、工业生产常用的微生物、细菌(bacteria)： 短杆菌：GA、Gln、lys 枯草芽孢杆菌：淀粉酶BF7658、碱性蛋白酶等 地衣芽孢杆菌：HASS(耐高温 -淀粉酶) -Amylase 苏云金芽孢杆菌：BT 生物农药 梭状芽孢杆菌：丙酮、丁酸等的发酵、酵母菌(yeast): 啤酒酵母：酿酒酵母、辅酶类物质的发酵 酒精酵母： 汉逊酵母：食品工

30、业，用于乙酸乙酯的发酵 假丝酵母：scp 生产，石油发酵、霉菌(mould)： 黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业UV-11,UV-48、酶制剂工业糖化酶 黄曲霉：酱油生产(3042)，面酱 青霉菌：青霉素的生产 红曲霉：红曲制造，用于南方红曲酒女儿红的生产；使用红色色素的生产；豆腐乳的生产等。 赤霉菌：赤霉素的生产一种植物生长激素。、放线菌(antinomycetes)： 最大的经济价值在于能生产多种抗生素。、担子菌(basidiomycetes)：、藻类(alga)：抗生素是次级代谢产物，需要生物体进展简单的代谢，有以上是放线菌生产的。二、工业化菌种的要求:1廉价原料、生长快速、目的产物产量高。2

31、易于掌握培育条件，酶活性高。发酵周期较短。3抗杂菌和噬菌体的力量强。4菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。5产品简洁分别提纯。其次节 工业微生物菌种的选育菌种选育的目的：1、提高发酵单位或产量 2、改进产品质量 3、去除多余的产物 5、抗生素合成基因表达 4、产生抗生素一、自然育种从自然界分别获得菌种，依据菌种的自发突变进展筛选而获得菌种 。从自然界中分别筛选菌种的方法步骤： 1 采 样(方法、地点、时间和四周环境记录)2 增殖培育 3 纯种分别(纯种分别的原则就是使培育物获得单个菌落：1稀释分别法 2平板划线分别法 涂菌： 划线分别：分步划线法

32、；一次划线法：3组织分别法)4 纯培育5 生产性能测定(测定代谢产物或其它目的性状) 从自发突变体中获得菌株自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为 10-810-9自然突变有两种状况： 正突变、负突变回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丧失，生产性能下降。单菌落分别法：单细胞悬浮液平板菌落挑取、测定产生单位、生长速度等二、诱变育种通过诱变剂处理微生物细胞，使突变频率提高，变异幅度增大，选出具有优良特性的变异菌株为诱变育种。特点：速度快、收效大、方法简便、工作量大诱变剂和诱变处理物理诱变剂：射线如紫外线、X射线、 射线，快中子。物理因素中目前使用得最便利而且格外有效的是紫

33、外线。很多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般试验室、中小型工厂都适用，也很安全。其他的几种射线都是电离性质的，有肯定的穿透力，一般都由专业人员在特地 的设备中使用，否则有肯定危急性。紫外线波长范围广，对诱变最有效的波长 260nm 左右，用菌孢子悬浮液处理，功率 15W，距离 30cm。作用机理：形成胸腺嘧啶二聚体以转变 DNA 活性，造成菌体的变异或死亡。中子是原子核的组成局部，是不带电荷的粒子，可由盘旋、静电或原子反响堆产生。可以分为快 中子和慢中子。快中子能量 0.2 百万至 10 百万电子伏特；较 X 射线、 射线具有较大的电离密度，能更多的引起点突变和染色体畸变。进展诱变育种时，用

34、菌孢子悬浮液或长于平皿上的菌落处理，剂量 1001500 戈。化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、5氟尿嘧啶、烷化剂等(化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂). 使用化学诱变剂的优缺点： 1、大多数状况下，突变数量要比电离辐射更有效。2、经济。只需要少量的适宜的诱变剂，设备是试验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而电离辐射进展工作时，设备费用大，并要留意安全性。 3、大局部诱变剂是致癌剂，所以在使用中必需格外慎重，要避开化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气， 有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要留神。确定动身菌株菌种的纯化选优动身菌株的性能鉴定同步培育制备单细胞或单孢子悬液

35、活菌浓度测定诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验诱变处理平板分别计形态变异的菌落数，计算突变率挑取疑似突变菌落纯培育突变体的初步筛选用简洁快捷的方法重复筛选摇瓶发酵试验选出突变体依据状况进展生产试验或重复诱变处理动身菌株的选择菌悬液的制备前培育诱变处理变异菌株的分别和筛选杂交育种及基因工程育种： 在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。 常规的杂交育种 原生质体融合 DNA 重组技术1. 杂交育种：杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经吻合或接合使遗传物质重组合，从中分别合筛选具有性状的菌株。包括细菌的杂交育种、霉菌的杂交育种和放线菌的杂交育种。2. 原生质

36、体育种：用脱壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生质体，再用聚乙二醇PEG促进原生质体发生融合，从而获得异核体或重组合子的技术叫做原生质体融合ProtoplastFusion。 原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。 原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。 原生质体融合作为一种的基因重组手段是 1978 年第三届国际工业微生物遗传学争论会上提出来的。2.1 特点:(一)杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形的原生质体。(二)受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。(三)遗

37、传物 质传递更为完整：原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进展类似的合二为一的过程。(四)存在着两株以上 亲株同时参与融合形成融合子的可能性。(五)有可能承受产量性状较高的菌株作融合亲株。(六)提高菌株产量的潜力较大。(七)有助于建立工业微生物转化体系。2.2 原生质体融合育种步骤： 1标记菌株的筛选和稳定性验证。2原生质体制备。3等量原生质体加聚乙二醇促进融合。4涂布于再生培育基，再生出菌落。5选择性培育基上划线生长，分别验证，挑取融合子进一步试验、保藏。6生产性能筛选。原生质体制备的影响因素 1 菌体的前处理:为了使酶作用的效果好一些，可将菌作一些前处理。如细菌参加亚抑制剂量的青霉素。2

38、菌体的培育时间:为了使细胞易于原生质体化，一般选择增殖期的菌体。3 酶浓度:对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类要求不同，就是对酶的浓度也有差异。另外，最正确酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化。4 酶处理温度 5 破壁时的pH 值 6 渗透压稳定剂:等渗透压在原生质体制备中， 不仅起到保护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物的结合，渗透压稳定剂多承受甘露醇，山梨醇，蔗糖 等有机物和 KCl和 NaCl 等无机物。基因育种基因重组育种：是运用体外 DNA 各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体， 将目的基因转移至的宿主细胞并使其在的宿主细胞系统内进展复制和表达，或者通

39、过细胞间的相互作用，使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另个细胞的方法。一个完整的基因克隆过程包括以下步骤、获得待克隆的 DNA 片段基因；、目的基因与载体在体外连接； 、重组 DNA 分子导入宿主细胞；、筛选、鉴定阳性重组子；、重组子的扩增与或表达。第三节 工业微生物菌种制种子的准则 菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能快速生长，缓慢期短； 生理性状稳定； 菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求； 无杂菌污染； 保持稳定的生产力量。种子扩大培育就是指将保存在砂土管、冷冻枯燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培育面而获得肯定数量和质量的

40、纯种过程。保藏菌种(休眠状态) 斜面 渐渐扩大摇瓶或偏瓶与种子罐生产车间种子制备种子罐的级数主要打算于菌种的性质和菌体生长速度及发酵设备的合理应用；种子罐级数越少越有利于生产过程的简化和发酵过程的掌握。接种龄：种子罐中培育的菌丝体开头移入下一级种子罐或发酵罐时的培育时间。接种量：移入的种子液体积和接种后培育液体积的比例。接种量的大小取打算于生产菌种在发酵罐中生长生殖的速度。影响种子质量的因素 原材料质量 培育条件温度、湿度、通气量 斜面冷藏时间种子质量掌握措施 菌种稳定性检查 无菌检查第四节 菌种的复壮与保藏菌种复壮选育一株抱负的菌株是一件困难的工作，而欲使菌种始终保持优良性状的遗传稳定性，便

41、于长期使用，还需要 做很多日常的工作。实际上，由于各种各样的缘由，要使菌种永久不变是不行能的，菌种衰退是一种潜在的威 胁。只有把握了菌种衰退的某些规律，才能实行相应的措施，尽量削减菌种的衰退或使已衰退的菌种得以复壮。菌种衰退degeneration是指由于自发突变的结果，而使某物种原有的一系列生物学性状发生量变或质变的 现象。菌种衰退的现象菌落和细胞形态转变生长速度缓慢，产孢子越来越少代谢产物生产力量下降，即消灭负突变致病菌对宿主侵染力量下降对外界不良条件的抵抗力量下降等菌种衰退的缘由：基因突变主要缘由1、有关基因发生负突变导致菌种衰退 2、表型延迟造成菌种衰退3、质粒脱落导致菌种衰退连续传代

42、加速衰退不适宜的培育和保藏条件加速衰退菌种衰退的防止掌握传代次数制造良好的培育条件利用不易衰退的细胞移种传代承受有效的菌种保藏方法讲究菌种选育技术定期进展分别纯化菌种复壮狭义的复壮消极的措施是指在菌种已经发生衰退的状况下，通过纯种分别和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以到达恢复原菌株固有性状的相应措施。 广义的复壮乐观的措施是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就常常有意识地实行纯种分别和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。菌种复壮的主要方法纯种分别法菌落纯“菌种纯”细胞纯“菌株纯”通过纯种分别,可将衰退菌种细胞群体中一局部仍保持原有典

43、型性状的单细胞分别出来,经扩大培育,就可恢复原菌株的典型性状。宿主体内复壮法 对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。淘汰法 将衰退菌种进展肯定的处理如药物、低温、高温等，往往可以起到淘汰已衰退个体而到达复壮的目的。遗传育种法 把退化的菌种重进展遗传育种，从中再选出高产而不易退化的稳定性较好的生产菌种性状稳定的菌种是微生物工作最重要的根本要求，否则生产或科研都无法正常进展。影响微生物菌种稳定性的因素： a变异；b污染；c死亡菌种保藏目的尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以到达便于争论、交换和使用等诸方面的需要。原理 选

44、择典型菌种的优良纯种来进展保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。/人为地制造环境条件如：枯燥、低温顺缺氧，使微生物长期处于代谢不活泼、生长生殖受抑制的休眠状态。/ 尽可能承受不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株。方法 斜面低温保藏法 石蜡油封藏法 砂土管保藏法 麸皮保藏法 甘油悬液保藏法 冷冻真空枯燥保藏法 液氮超低温保藏法 宿主保藏法一斜面低温保藏法常用保藏法将菌种接种在适宜的斜面培育基上，待菌种生长完全后，置于 4左右的冰箱中保藏，每隔肯定时间保藏期再转接至的斜面培育基上，生长后连续保藏，如此连续不断。广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏主要保藏措施是低温。一般可保存 16 个

45、月左右。(简便易行，简洁推广，存活率高；但菌株仍有肯定程度的代谢活动力量，保藏期短，传代次数多，菌种较简洁发生变异和被污染。)二石蜡油封藏法在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培育成熟的菌种斜面或半固体穿刺培育物上，石蜡油层高出斜面顶端 1cm ，使培育物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或 4冰箱内保藏。 广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保存 12 年左右。三砂土管保藏法长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对枯燥敏感的细菌及酵母则不适用。兼具低温、枯燥、隔氧和无养

46、分物等诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物移接便利，经济简便。它的保藏期约 110 年。将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按肯定比例分装于小试管中，砂土的高度约 1cm ，121蒸汽灭菌 11.5h，间歇灭菌 3 次。50烘干后经检查无误后备用。将待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于枯燥器中抽真空约24h，用火焰熔封管口(或用石蜡封口)，置于枯燥器中，在室温或 4冰箱内保藏。长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对枯燥敏感的细菌及酵母则不适用。兼具低温、枯燥、隔氧和无养分物等诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物移接便利，经济简便。 它的保藏期约 110 年。四麸皮保藏法又称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然后在低温枯燥条件下保存。其制作方法是，将麸皮与水以肯定的比例拌匀，装量为试管体积 2/5，湿热灭菌后经冷却，接入颖培育的菌种，适温培育至孢子长成。将试管置于盛有氯化钙等枯燥剂的枯燥器中，于室温下枯燥数日后移入低温下保藏；枯燥后也可将试管用火焰熔封，再保藏，则效果更好。 适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，