发酵液中透明质酸提取纯化工艺的研究.docx

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1、龙源期刊网 :/ qikan .cn发酵液中透亮质酸提取纯化工艺的争论 宋磊 孟国庆 郭燕风 王传宝 王宜磊来源：山东农业科学2023 年第 03 期摘要：本争论利用乙醇初步提取发酵液中透亮质酸，确定最正确提取方案为乙醇体积分数60%，洗涤次数为两次。然后，以透亮质酸含量为指标，在单因素试验的根底上，承受依据Box-Behnken 原理设计的响应面法优化透亮质酸纯化工艺。方差分析和交互作用分析说明，最正确纯化工艺为NaCl 浓度 45 g/L，温度 55，pH 值 9.6，在此工艺条件下，透亮质酸含量为93.71%。本工艺所生产的透亮质酸纯度較高，符合化装品、医药行业标准，具有广泛的应用价值。

2、关键词：透亮质酸；发酵液；分别纯化；响应面中图分类号：TS218 文献标识号：A 文章编号：1001-4942202303-0134-06 AbstractIn this research， the hyaluronic acid was preliminarily extracted from fermentationbroth using alcohol. The best extraction parameters were ethanol volume fraction of 60% and washingfor two times. Using the content of hyal

3、uronic acid as indicator， single-factor experiments were performed. Then the response surface analysis based on Box-Behnken experimental design was carried out to optimize the purification process of hyaluronic acid. Through analysis of variance and interaction， the optimal purification process was

4、NaCl additive amount of 45 g/L， temperature of 55 and pH value of 9.6. Under the optimized conditions， the actual content of hyaluronic acid reached up to 93.71%. By this process， the content of hyaluronic acid was higher， which conformed to the stands of cosmetic and pharmaceutical industries， so i

5、t had extensive application value.KeywordsHyaluronic acid； Fermentation broth； Separation and purification； Response surface透亮质酸hyaluronic acid，HA是一种高分子量的酸性黏多糖，由N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸通过-1，4 和-1，3 糖苷键反复交替连接而成1，由于其独特的流变学特性、黏弹性、保湿性以及良好的生物相容性，透亮质酸在化装品、医学领域都有广泛的应用2。透亮 质酸用于食品领域还处于起步阶段。近年来国内外关于HA 口服后吸取、代谢和成效的争论越来越

6、多，大量科学证据证明白其成效。特别是2023 年 5 月，国家卫生部依据资源食品管 理方法的规定公布相关公告，批准透亮质酸钠作为一种资源食品用于保健食品原料。这一公告的公布必将进一步推动HA 在我国保健食品中的应用。微生物发酵法是目前透亮质酸的主要生产方式，而下游分别纯化工艺是获得高纯度HA 的关键环节，也是制约多数企业生产高标准透亮质酸的瓶颈。依据透亮质酸国家质量标准和行业标准，成品中热源蛋白质含量越低，透亮质酸含量越高，产品质量越高。因此，除去发酵液中的热源蛋白是透亮质酸分别纯化的首要任务。依据文献，从发酵液中分别提纯透亮质酸主要有大量稀释膜滤法、季铵盐法、氯仿法、酶法、离子交换层析等3-

7、5，这些方法存在生产本钱高、操作简单、纯度和回收率低、环境不友好等诸多缺点，不利于在工业中应用。本争论利用乙醇对发酵液中透亮质酸进展初步粗提，之后承受响应面法优化纯化工艺，得到了纯度和产率都较高的透亮质酸，并在山东某透亮质酸生产工厂得到应用，具有较大的实际生产参考价值。1 材料与方法1.1 材料与仪器透亮质酸发酵液：山东某透亮质酸生产公司供给；-葡萄糖醛酸：购自 Sigma 公司；牛血清白蛋白BSA：购自北京欣经科生物技术；其他试剂均为分析纯；水为二次去离子水。UV-1910 型紫外-可见分光光度计北京普析，D2F-6090 真空烘箱上海精宏试验设备，LXJ-B 低速大容量离心机上海周密仪器仪

8、表，79480 型真空冷冻枯燥机Labconco 公司，ALC-1100 型电子分析天平北京赛多利斯仪器。1.2 试验方法1.2.1 工艺流程透亮质酸发酵液乙醇粗提洗涤溶解纯化过滤调整 pH 值95%乙醇沉淀真空冷冻枯燥成品。1.2.2 透亮质酸粗提粗提乙醇体积分数的选择：在快速搅拌下，分别向1 000 mL 颖HA 发酵液中参加 95%的乙醇，使混合液中乙醇终体积分别掌握在30%、40%、50%、60%、70%。参加过程需缓慢，避开大结块沉淀产生。参加完毕后快速搅拌10 min，静置 1 h 后置于1 000 r/min 离心机中离心 5 min。取沉淀，测HA 含量，考察添加不同体积乙醇对

9、于HA 提取量的影响。洗涤次数确实定：取离心后沉淀，参加300 mL 95%乙醇进展洗涤，洗涤次数分别为 1、2、3 次。考察洗涤次数对于溶液透光率、HA 提取量的影响。透亮质酸溶解方案确实定：取洗涤后沉淀，参加 1 5004 000 mL 去离子水进展溶解。以溶解后粘度作为确定溶解相应方案的指标。1.2.3 HA 纯化单因素及响应面试验设计首先以NaCl 添加量、溶解温度、pH 值进展影响成品中HA 含量的单因素试验，之后考虑反响时间对HA 纯化效果的影响，确定最正确反响时间。在单因素试验根底上，承受Box-Behnken 进展纯化工艺的优化设计。1.2.4 HA 纯化液处理方法向优化完毕的

10、纯化液中参加质量比为1%的珍宝岩助滤剂，搅拌均匀，通过板框过滤除去沉淀杂质，滤布型号750b，过滤压力低于 0.4 MPa。过滤完毕后，乙酸调整pH 值 7.0，使用 1.5 倍体积 95%乙醇雾状喷入滤液中，不断搅拌，使HA 在搅拌中聚拢成颗粒沉淀。收集颗粒状沉淀透亮质酸，使用95%乙醇脱水 3 次后，放入真空冷冻枯燥机冻干即得产品。1.3 指标检测方法透亮质酸含量测定：承受咔唑法6，以葡萄糖醛酸为标准品。蛋白质含量测定用考马斯亮蓝法7，以牛血清白蛋白为标准品。测定HA 的平均相对分子质量用黏度法8，参比液为0.2 mol/L 的 NaCl 溶液，测定温度为250.05，承受 3 点法外推，

11、求出特性粘度，并 依据公式=3.610-4Mr0.78 计算出平均相对分子量Da。溶液透光率的测定9：以纯水的透光率为 100%，测定样品在 550 nm 处的透光度T 值。2 结果与分析2.1 透亮质酸粗提2.1.1 粗提乙醇体积分数的选择透亮质酸不溶于有机溶剂，由于乙醇沉析作用强、挥发性 适中、无毒、可回收性强，故在工业或者争论中，常用乙醇作为透亮质酸的初步提取剂。由图 1 可以看出，随着乙醇体积的增加，透亮质酸提取量渐渐增加，但乙醇体积为70%时与 60%时相比，透亮质酸的提取量几乎没有变化，综合考虑本钱，选择乙醇体积为60%最正确。2.1.2 洗涤次数的选择依据诸多文献与资料，HA 粗

12、品中杂质含量越少，透光率越高。由图2 可以看出，洗涤次数增加，透亮质酸含量变化不大，透光率逐次增大，且洗涤2 次后，透光率显著增大，这是由于乙醇具有脱色功能，会脱去发酵液中自有的一局部颜色，特别是对于染菌发酵液、培育液灭菌温度过高等特别发酵液效果更为明显；同时，HA 粗提沉淀物中会有一大局部醇溶性杂质溶解于洗涤用乙醇溶液，故透光率会逐次增加。另一方面洗涤后杂质的削减也更利于后面纯化工艺的有效进展。考虑到生产本钱、生产周期以及洗涤效果选择洗涤2 次作为最正确选择。2.1.3 透亮质酸溶解方案确实定HA 粗沉淀溶解后粘度的大小会显著影响过滤的速度和时间，继而影响透亮质酸的分子量和回收率，故溶解体积

13、的选择主要是依据溶解后溶液的粘度来确定。粘度的大小主要受透亮质酸发酵液中透亮质酸产量和分子量的影响，透亮质酸产量和分子量越大，粘度越高；同时透亮质酸溶液是非牛顿型流体，分子量的增大会使溶液的粘度非线性显著性增加。由于每次发酵透亮质酸生产水平和分子量不同，确定一个固定的最正确溶解体积是不现实的，应选择溶解液粘度作为最终溶解体积的推断标准。经过屡次试验室和中试试验， 综合考虑生产本钱、周期、操作难易等因素，确定溶解后温度在50左右、粘度在 2 0003 500 mL/g 之间为最正确。2.2 HA 纯化单因素试验2.2.1 NaCl 添加量对HA 含量的影响溶解温度 50、pH 值 9.0 条件下

14、，掌握NaCl 添加量2060 g/L 之间，考察NaCl 添加量对HA 含量的影响，结果如图 3 所示。水溶液中蛋白质的溶解度一般在肯定离子强度范围内最大，低于或者高于此范围时溶解度均下降。依据诸多文献，盐析法是去除酸性多糖中蛋白质最常用的方法。从图3 可以看出， NaCl 浓度对于HA 纯化影响显著，在低浓度下，溶解液中蛋白质溶解度较大，HA 含量较低； 随着NaCl 浓度增大，HA 含量渐渐上升，当NaCl 添加量到达 40 g/L 时，HA 含量几乎到达最大；连续增大NaCl 添加量，效果并不显著，故NaCl 添加量确定为 40 g/L。2.2.2 温度对HA 含量的影响NaCl 添加

15、量 40 g/L、pH 值 9.0 条件下，掌握溶解温度 40 60之间，考察溶解温度对 HA 含量的影响，结果如图 4 所示。蛋白质溶解度一般随着温度上升而增大，但是在高离子强度状况下，大局部蛋白质的溶解度随着温度的上升而渐渐降低。从图4 可以看出，随着温度的上升，HA 含量逐次急剧上升， 当温度到达 50时，透亮质酸含量最大，这是由于温度的上升使绝大多数蛋白质聚拢沉淀的结果，与参考文献10的报道相吻合。当溶解温度大于 50时，HA 含量渐渐下降，可能是由于其他杂质以及极少局部蛋白质的溶解度随着温度的上升而上升，导致HA 含量下降。因此选择溶解温度为 50时最正确。2.2.3 pH 值对HA

16、 含量的影响NaCl 添加量 40 g/L、溶解温度 50条件下，掌握pH 值8.510.5 之间，考察pH 值对HA 含量的影响，结果如图 5 所示。等电点沉淀也是多糖去除蛋白常用的方法之一。从图5 可以看出，pH 值为 9.5 时含量最 大，低于或者高于 9.5 时，HA 含量都会降低，说明HA 发酵液中蛋白质等电点在 9.5 左右分布较多。故纯化时pH 值掌握在 9.5 左右最正确。2.2.4 反响时间对HA 纯化效果的影响NaCl 添加量 40 g/L、pH 值 9.5 条件下，掌握溶解温度 50，考察不同反响时间对HA 分子量及含量的影响。从图 6 可以看出，随着反响时间延长，HA

17、含量逐漸上升，在反响时间到达 2 h 时，透亮质酸含量几乎到达了最大，主要缘由在于蛋白质受盐析、等电点、升温等协同作用，渐渐沉淀下来，在过滤中被加速除去的结果；另一方面，随着反响时间的延长，HA 分子量渐渐下降， 这是由于透亮质酸多糖链的降解主要是由水解和羟基上的活性氧引起的，而pH 值的上升会影响羟基自由基的产生从而加速HA 的降解11-13。综合考虑，在保证HA 高含量提取的状况 下，应当尽量缩短反响时间，削减HA 降解。反响时间确定为 2 h 最好。2.3 响应面优化HA 纯化试验2.3.1 响应面分析方案及试验结果在单因素试验根底上，固定溶解反响时间2 h，参考NaCl 添加量、溶解温

18、度、pH 值 3 个因素对HA 含量的影响，并用响应面法进展优化，以HA 含量作为响应值，依据响应面法中的Box-Behnken 试验原理运用Design Expert 8.0 进展设计。响应面分析因素与水平见表 1，试验设计与结果见表 2。2.3.2 模型的建立及其显著性检验利用Design-Expert 8.0 软件对表 2 试验数据进展二次多项式逐步回归拟合，得回归模型方程为：Y=93.24+3.25A+0.22B+0.28C+0.45AB-0.13AC-0.17BC-3.76A2-1.3B2-2.47C2模型的牢靠性可以从方差分析及相关系数来考察，见表3。结果说明，所得的回归方程极 显

19、著P0.05，不显著，因此二次模型成立，应用此方程可以推测透亮质酸含量及纯化工艺。 从对透亮质酸含量影响来看，一次项A，二次项A2、B2、C2，交互项AB 影响极显著；一次 项 B、C 影响显著；交互项AC、BC 影响不显著，说明各个具体试验因素与响应值都不是简洁的线性关系。透亮质酸含量影响因素大小排序为ANaCl CpH 值 B温度。2.3.3 响应面分析透亮质酸纯化工艺中NaCl 添加量、溶解温度、pH 值 3 个因素之间的交互作用对HA 含量的影响如图 7 所示。由图 7a 可以看出，NaCl 浓度和温度的交互作用明显，维持NaCl 浓度在较高水寻常，增大温度对于提高HA 含量效果显著，

20、但温度过高时，HA 含量也会随温度的连续上升而渐渐下降，因此，在纯化工艺中，维持高NaCl 浓度，适当提高温度有利于HA 含量的增加。由图 7b 可以看出，在较高的NaCl 浓度条件下，维持溶解pH 值在 9.5 左右时，HA 含量可以到达最大值。由图 7c 可以看出， HA 含量随温度和pH 值上升而渐渐增大，但到达肯定值之后，HA 含量消灭下降的趋势，掌握好温度和pH 值的影响对HA 纯化有重要指导意义。2.4 最正确工艺参数确定及验证性试验通过对模型方差分析得出最正确的工艺参数为：NaCl 浓度为 45.48 g/L，温度为 54.46， pH 值 9.6 时，HA 含量可以到达 93.

21、77%。为检验响应面法优化发酵液中HA 纯化工艺的牢靠性，承受优化后的工艺条件进展验证试验，参考实际操作将优化后的工艺参数调整为NaCl 浓度为 45 g/L，温度为 55，pH 值 9.6。在此条件下，HA 含量为 93.71%，与模型推测值根本相符，说明试验具有实际应用价值。2.5 产品性状利用上述工艺条件及纯化液处理，即得透亮质酸成品，颜色为白色，无不良气味，易吸 湿。经化验，透亮质酸含量到达 93.71%，蛋白质含量为 0.025%，透光率为 99.8%，产品指标到达食品级和化装品级透亮质酸质量标准。对成品HA 溶液进展紫外图谱扫描，扫描波长为190400 nm，HA 浓度为 0.5

22、g/L。结果说明，成品仅在 198 nm 处有一个多糖吸取峰，在 280 nm 和 260 nm 处几乎没有吸取峰存在，说明HA 成品中蛋白质和核酸等杂质含量极少14。3 结论利用乙醇初步提取发酵液中透亮质酸，确定了最正确粗提工艺为乙醇体积分数为60%，洗涤次数为 2 次。通过单因素试验和响应面设计，得出影响HA 含量的工艺因素按主次挨次为NaCl 添加量pH 值溶解温度，最正确纯化条件是NaCl 浓度为 45 g/L，温度为 55，pH 值9.6。在此最正确条件下，HA 含量到达 93.71%，蛋白质含量为 0.025%，透光率为 99.8%，产品指标到达食品级和化装品级透亮质酸质量标准要求

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