发酵培养基优化策略.docx

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1、发酵培育基优化策略李勇昊;周长海;丁雷;孙元章;杨建明【摘 要】在发酵过程中,常常需要通过试验来查找争论对象的变化规律,这些对象包括培育基的设计、工艺参数等;而这些变化规律的查找就要通过科学的试验设计与数据分析来实现.通过对规律的争论到达各种有用的目的,比方提高产量、降低消耗、提高产品质量等,特别对于菌种、产品的试验.本文对发酵培育基优化的根本方向进展了综述,并比较了常用的试验设计与数据分析方法.【期刊名称】北京联合大学学报自然科学版【年(卷),期】2023(000)002【总页数】7 页(P53-59)【关键词】培育基优化;试验设计;数据分析【作 者】李勇昊;周长海;丁雷;孙元章;杨建明【作

2、者单位】吉林大学生物与农业工程学院,长春,130022;吉林大学生物与农业工程学院,长春,130022;东北林业大学生命科学学院,哈尔滨,150040;中国科学院青岛生物能源与过程争论所,青岛,266071;中国科学院青岛生物能源与过程争论所,青 岛,266071【正文语种】中 文【中图分类】TQ920.61 发酵培育基的初期选择策略1.1 发酵的预备发酵的第一步往往是选择适宜的培育基，然而不能光靠试验来猎取数据，那么选择初始培育基的最简洁途径就是查阅文献，通过以往发表的相关文献，尤其是自己争论领域的相关文献，会节约大量的时间，并且行之有效。1.2 培育基成份的更换由于依据文献查到的培育基并不

3、肯定适合自己的菌种，由于所处的地点不同，菌种的来源不同，很难保证菌种的生长需求一样，并且很多用于生产贵重商品的培育基配方被视为公司机密，这就说明发酵培育基对发酵生产的重要性。由于不同的菌种利用碳源、氮源的速度不同;尤其是工程菌，菌种对生长和质粒稳定性的要求更加苛刻，所以有必要对培育基的根底成份进展筛选，在保持其他条件不变的状况下， 只转变一种成份来确定适合自己菌种的培育基成份。王志军等1认为碳源和氮源对质粒稳定性有很大影响，不同碳源和氮源的种类可影响质粒生产的稳定。Bryersl2和 kennedy 等3认为大肠杆菌中的质粒 DNA 丧失率与碳氮比有很大的关系，当大肠杆菌在较高的碳氮比中生长时

4、，葡萄糖大局部被代谢为乙酸及其他一些次生代谢产物，而削减了葡萄糖的利用率，这就有可能使细胞中质粒的拷贝数受到影响，进而使质粒的产量削减。1.3 培育基成份的定量通常培育基中成份的量是有肯定范围的，高浓度的碳源、氮源和盐会造成溶液渗透 压过高、细胞脱水死亡，而浓度过低又不能保证菌种的正常生长代谢。Haggstrom4给出了一般常用的养分极限指标为:氨盐 5 g/L，磷酸盐 10 g/L，硝酸盐 5 g/L，NaCl 10 15 g/L，乙醇 100 g/L，葡萄糖 100 g/L。所以确定培育基养分成份的量对菌种生长及代谢起着重要作用。一般我们在确定量时要进展相应的“生物仿照”，即了解自己所培育

5、菌种的细胞各种成份的比例，这是设计培育基时的重要参考依据。其中在添加磷元素的时候一般借磷酸缓冲液进展调整，比方选用 K2HPO4 和 KH2PO4，当两种物质浓度相等时 pH 为 6.8，而且Mg2+是很多重要酶的激活剂，同时也要考虑微量元素和维生素的添加，由于这些都是微生物生长所必需的5。1.4 摇瓶的作用简便、易行、快速是摇瓶试验的优点，因而在涉及到大量试验的培育基优化中，用发酵罐完成是不现实的，所以摇瓶是优化试验中所必不行少的。但是它也同样有很多缺点6:不能在发酵过程中掌握 pH 值;发酵过程中溶氧匮乏;在发酵过程中发酵液简洁蒸发;摇瓶中发酵液缺少足够的混合。正由于这些缺点，所以不能把摇

6、瓶的最优培育基简洁扩大到发酵罐中，而 Kennedy6的争论显示 10 L 的发酵罐和摇瓶的数据差异不大，但是发酵罐的设计抑制了摇瓶培育的缺点，说明假设简洁地将体系放大，发酵的结果就无法显示优势，所以应当利用发酵罐的优势，对摇瓶的数据连续进展优化，在线掌握 pH 值、溶氧等参数，查找补料发酵模式和连续发酵条件。2 试验设计目前试验室最常用的试验方法仍旧是单因素法(one at a time)，每次只转变一个因素的水平，固定其他条件，逐个考察因素的优化方法。这种方法没有考虑各因素间的交互作用，因此获得的最优条件并不是真正的最优。但是承受全面试验(full factorial)的方法，并且要考察的

7、因素过多时，则需要格外多的试验次数，而且目前尚无适宜的理论模型应用于发酵工艺中，所以承受数理统计的原理，在可能的试验空间里选择少量有代表性的试验点进展争论，本文对发酵优化中常见的试验设计进展了分析和比较。2.1 均匀设计均匀设计(uniform design)是中国数学家方开泰和王元于 1981 年首先提出的，它是一种只考虑试验点在试验范围内均匀散布的一种试验设计方法，思想源于正交试验和数论方法的结合，是通过一套细心设计的均匀表来安排试验的，由于不考虑“整齐可比”，只考虑“均匀散布”，所以大大削减了试验次数。为了保证这种细心设计的均匀表有足够的“均匀散布”性，需要符合以下条件7:1) 每列不同

8、数字只消灭 1 次;2) 任 2 个因素的试验点在平面的格子点上，每行每列有且仅有一个试验点;3) 均匀设计表任两列组成的试验方案一般并不等价;4) 等水平均匀表的试验次数与水平数是全都的。优点:适用于试验周期长、原材料费用高的试验，水平数即为试验次数;在试验数一样的条件下，均匀设计的偏差远比正交设计小。缺点:由于没有考虑“整齐可比”，所以不能用方差分析法，一般承受多元回归分析法。2.2 正交设计当需要考察的因素较多，并且水平数多于 2 个时，假设要做全面试验，试验数是相当惊人的。假设用正交设计(orthogonal design)来安排试验，则会大大削减试验次数。正交试验使用正交表来安排试验

9、。正交表依据正交原理进展设计，不但符合“均匀分散”，而且符合“整齐可比”性，符合以下特点7:1) 表中任 1 列，不同的数字消灭的次数一样;2) 表中任意 2 列，把同一行的 2 个数字看成有序数字对时，全部可能的数字对消灭的次数一样。正交试验设计的试验结果一般使用极差或者方差进展分析，通过正交试验设计可以选择出代表性强的少数试验方案，通过统计分析可以推出较优方案，并且对试验结果进一步分析可以得到更接近最优结果的信息。优点:此法试验次数少，能在全部试验方案中均匀地选择出代表性强的点，可以快速得出重要因素或较优方案，并且可以对试验结果进一步争论。缺点:所选水平未必是最优水平;当水平数较多时，试验

10、次数也很多。2.3 局部因子试验设计局部因子试验设计(fractional factorial design，FFD)是一种快速有效筛选重要因素的试验设计方法，每个因素只取高(+1)、低(1)2 个水平，也可以增加中心点(0)试验来估量试验误差，一般用 2nk 来表示8。其中 n 为因素数，2nk 的结果就是需要进展的试验数。它与 PB 试验的共性在于都是 2 水平试验，差异在于简化取样点的方法不同，进而导致所得结果的代表性有差异。优点:比全面试验次数少;缺点:没有考虑相互作用，只适用于重要因素的筛选。2.4 Plackett-Burman 设计Plackett-Burman 试验设计(PB)

11、由 Plackett 和 Burman 提出，是一种以不完全平衡块(Balanced incomplete blocks)为原理的局部因子设计法，适用于从众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素供进一步争论使用9。对于N 次试验至多可争论 N1 个因素，但实际因素应当少于 N1 个，至少有 1 个虚构变量用以估量误差。每个因素取 2 个水平，低水平为原始培育条件，高水平约取低水平的 1.252 倍。但对某些因素凹凸水平的差值不能过大，以防掩盖了其它因素的重要性，应依试验条件而定10。PB 设计矩阵都符合以下特征:1) 每行凹凸水平的数目为(K+1)/2;2) 每列含凹凸水平数目相等。

12、PB 设计数学模型: y=a+Ex1x1+Ex2x2+Exixi每个因子对目标的影响 Exi 由下式计算:PB 设计一般用 Pareto 图的形式直观地显示结果。优点:只需要很少的试验次数，而且只需要做 2 水平试验;缺点:没有考虑因素的交互作用;该方法只适用于对因素重要性的筛选，而不适于因素的最优化。2.5 Box-behnken 设计该设计是由 Box 和 Behnken 于 1960 年提出的拟合响应曲面的 3 水平设计。这些设计是由 2k 析因与不完全区组设计组合而成。所得出的设计对所要求做的试验次数来说格外有效，而且他们是可旋转的。BBD 图解如图 1 所示。图 1 三因素的 Box

13、-behnken 设计留意到 BBD 不包含由各个变量的上限和下限所生成的立方体区域的顶点处的任一点。当立方体角上的点代表因素水平组合，或试验本钱过于昂贵或因试验限制而不能做试验时，此设计就显示出其优势。优点:试验次数较少，可以考虑因素的交互作用，估量曲率; 缺点:掩盖范围比 CCD 少。2.6 中心复合设计(CCD)该设计是由 Box 和 Wilson 开发的一种国际上较为常用的试验设计，其二阶模型为:Y=b0+CCD 是由 2k 析因设计或分式析因设计添加上 2k 个坐标轴点(，0， 0)，(0，0)，(0，0， )(0，0， )和 N 个中心点(0，0，0)所组成，k=2、k=3 的 C

14、CD 如图 2 所示。恰当使用 可以使中心组合设计具有旋转性，其意义在于使设计在最优值为主的状况下各个方向上供给等精度的估量。而且恰中选取中心点个数 n 可以使 CCD 是正交的，或者是全都精度的设计。全都精度设计比正交设计更能防止回归系数的偏差，由于在真实的曲面中会消灭三阶或更高阶的项。优点:CCD 具有旋转性，试验次数较少，可以考虑因素的交互作用，估量了曲率; 图 2 k=2 和 k=3 的中心复合设计缺点:试验次数比 BBD 多。3 试验数据处理在对试验进展设计并得出结果后，需要利用合理的数据处理方法来对数据进展分析， 这对我们确定发酵培育基和工艺参数起着至关重要的影响，一般来说某种试验

15、设计 有固定的数据处理方法，比方正交设计常用方差分析，PB 设计常用回归分析，而CCD 常用响应面来分析，但也不是肯定的，比方正交设计也可以用回归分析法。下面介绍四种目前常用的数据处理分析方法。3.1 方差分析法在试验数据的处理过程中，方差分析(ANOVA)是一种格外有用、有效的统计检验方法，能用于检验试验过程中有关因素对试验结果的影响是否显著。方差分析的一般步骤是计算平均值、离差平方和、自由度，然后通过 F 检验确定因素的显著性水平7。通过对各个因素、误差和交互作用的显著性水平的检验来确定试验最优方案的一种分析方法。优点:使用广泛、简洁有效;缺点:没有整齐可比的试验无法用此方法，比方均匀设计

16、。3.2 回归分析法回归分析(regression analysis)是一种处理变量之间关系最常用的统计方法，用它可以查找隐蔽在随机性后面的统计规律。依据一个因素或者多个因素分为一元回归分析和多元回归分析，不管一元回归分析还是多元回归分析，均可分为线性和非线性回归两种形式8。利用相应的试验设计方法，得出结论后用最小二乘法求出相关系数，可以用相关系数法或者 F 检验来验证方程的显著性。最终可以通过偏回归系数的检验来确定因素对试验指标的影响，也可以用求极值的方法求出试验的最优因素水平。优点:使用广泛、简洁有效;缺点:通过多项式来推出的结果，有时不符合实际。3.3 最速上升法系统最优运行条件的初步估

17、量常常远离实际的最优点，在这种状况下试验者的目的是要快速地进入到最优点的四周区域11。我们期望利用既简洁又经济有效的试验方法，当远离最优点时，通常假定 x 的一个小区域范围内一阶模型是真实曲面的适宜近似。最速上升法(Steepest ascent，SA)是沿着最速上升的路径，即响应有最大增量的方向逐步移动的方法。固然，假设求的是最小值，则叫做最速下降法。拟合的一阶模型为与一阶响应曲面相应的 y 的等高线，是一系列平行直线， 如图 3 所示。图 3 一阶响应曲面等高线与最速上升路径最速上升的方向就是 y 增加的最快的方面。这一方向平行于拟合相应曲面等高线的法线方向。通常取通过所感兴趣的区域的中心

18、并且垂直于拟合曲面等高线的直线为最速上升路径。这样沿着路径的步长就和回归系数成正比。实际的步长大小是由试验者依据阅历、其他参考文献和现实状况来考虑确定的12。优点:简洁，快速接近最优区。3.4 响应面分析法响应面设计法(RSM)是一种查找多因素系统中最正确条件的数学统计方法，是数学方法和统计方法结合的产物，它将多因子试验中因素与试验结果的相互关系用多项式近似，通过拟合面的方式对函数的面进展分析，寻求优化区。相对于只用多元回归方程模型来分析因子与响应的关系，响应面法用拟合面的方式来完成具有更直观、更清楚的优点。假设拟合面是函数的恰当渐进，则对拟合面的分析就近似于对实际系统的分析7。优点:很好的用

19、 3D 图形显示结果，直观、试验次数少、周期短、精度高; 缺点:响应值仅限于 2 个变量，仅在一小段区间有很好的响应。4 发酵罐验证当摇瓶试验进入发酵罐水寻常，都不能简洁地将摇瓶培育基成份按容积系数放大， 而放大技术就是制约瓶颈，其中通气则是放大技术最主要因素之一29。因此在摇瓶优化好条件之后，需要用发酵罐进展验证，而且还有必要对相应的参数进展优化，比方溶氧、复原糖和 pH 值等。以至于我们可以连续争论补料分批发酵，连续发酵以到达高密度菌种发酵的目的。5 完毕语培育基优化是现代工业的一个重要课题，也是限制产量的重要因素。它不仅关系到发酵本钱的问题，而且关系到科研进度。但是由于发酵的特别性，并没

20、有一个确定的发酵优化方法。本文通过近几年国内外关于培育基优化的相关文献(见表 1)，综述了目前较为常用的培育基优化路线(见图 4)，并比较了常用的试验设计方法与数据分析方法。通过对近几年培育基优化文献的阅读，觉察响应面法成为最常用的优化方法，响应面设计和建立在极差理论根底上的正交设计相比，确实是进步了很多， 但是事物的进展规律并不总能用函数关系来表示，这就需要选择适宜的试验设计与 分析方法。期望本文能帮助更多的科研工作者和在发酵第一线的工作者选择适宜的 发酵优化方法，得到好的试验结果。表 1 试验设计和数据分析在培育基优化中的应用作者 年份 因素 试验设计 数据处理 软件 产量提高王磊等13

21、2023 5 One at a time，orthogonal design 极差分析 提高了 42.6%杨毅等14 2023 4 One at a time，orthogonal design ANOVA 3.25 倍姜维等15 2023 7 One at a time，27 4，CCD SAS，Statistica 最 高 提 高 了 102.6%孙子羽等16 2023 3 One at a time， BBD ANOVA，RSM Minitab 2.14 倍崔志芳等17 2023 4 orthogonaldesign 极差分析 6.6 倍阮文兵等9 2023 10 PB，SA，BBD A

22、NOVA，RSM SAS 提高了 25.87%宋萍等18 2023 10 One at a time，PB，SA，CCDANOVA，regression analysis，RSM ANOVA，RSM Statistical 提高了 6.7 倍郑洪立等19 2023 10 PB，SA，CCD ANOVA，RSM Statistical 提高了近 2 倍 Chun-Hui Zhang 2023 4 BBD ANOVA，RSM minitab Increased by about 100%Wanmeng Mu 等20SAS，Design-Expert 苯丙二酸产量高于其他报道Hong Gao 等22

23、 2023 11 PB，CCD Pareto 图， ANOVA，SA，RSM 等212023 7 Uniform design，CCD regression analysis，RSM Minitab 1.45 倍宋明军等23 2023 5 One at a time，Uniform design regression analysis 实际提取率为 32.42%。Jie Zhao 等24 2023 6 26 2，CCD ANOVA，RSM Design-Expert 2.2 倍 Wang Zhiwen SAS，Design-Expert3.05 倍等252023 4 24 1，CCD regr

24、ession analysis，SA，RSM 罗玲泉26 2023 4 Uniform design regression analysis SAS 得到最正确感官品质配方 Xiao Ziju 等27 2023 7 PB，SA，CCD Pareto 图， ANOVA，RSM SAS New records Jasmine Isar 等28 2023 5 One at a time，CCD ANOVA ， RSM Design-Expert 3.5 倍图 4 培育基优化基策略参考文献1 王志军，乐国伟，施用晖，等养分条件对 psDNA32HBS 质粒 DNA 生产的影响J生物工程学报，2023，

25、27(3):320313.2 0Kennedy R D，Baldwin C，Keshavarz M EEffects of growth medium selection on plasmid DNA production and initial processing stepsJJournal of Biotechnology，2023(76):175 183.3 Bryers J D，Huang C T，Peretti S WEffects of medium carbon-to- nitrogen ratio on bioflim formation and plasmid stabil

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29、面法优化产低温生淀粉糖化酶发酵培育基J中国酿造，2023(7):110113.17 崔志芳，刘娜，季爱云植酸酶产生菌的快速筛选及发酵条件优化J中国酿造，2023(7):137139.18 宋萍，戚小灵，胡邁，等响应面法优化枯草芽孢杆菌产脂肪酶的合成培育基J中国生物工程杂志，2023，30(8):100105.19 郑洪立，高振，黄和，等响应面法优化自养小球藻产生物柴油油脂J中国生物工程杂志，2023，30(8):106111.20 Zhang Chunhui，Ma Yujiu，Yang Fangxiao，et alOptimization of medium composition for b

30、utyric acid prodution by clostridium thermobutyricum using response surface methodologyJBioresource Technology，2023(100):4284 4288.21 Mu Wanmeng，Chen Chao，Li Xingfeng，et alOptimization of culture medium for the producion of phenyllactic acid by Lactobacillus spSK007JBioresource Technology，2023(100):

31、1366 1370.22 Gao Hong，Liu Mei，Liu Jintao，et alMedium optimization for the production of avermectin B1a by Streptomyces avermitilis 14 12A using response surface methodologyJBioresource Technology， 2023(100):4012 4016.23 宋明军，汪志君，顾林均匀设计法姜油树脂提取工艺的优化争论J中国酿造，2023(7):4446.24 Zhao Jie，Wang Yonghong，Chu Ju，

32、et alStatistical optimization of medium for the production of pyruvate oxidase by the recombinantEscherichia coliJJ Ind Microbiol Biotechnol，2023(35):257 262.25 Wang Zhiwen，Liu XunliMedium optimization for antifungal active substances production from a newly isolated Paenibacillus spUsing response s

33、urface methodologyJBioresource Technology， 2023(99):8245 8251.26 罗玲泉均匀设计法优化草莓发酵乳饮料配方争论J中国酿造， 2023(16):8486.27 Xiao Zijun，Qin Jiayang，Xu Ping，et alStatistical optimization of medium components for enhanced acetoin production from molasses and soybean meal hydrolysateJAppl Microbiol Biotechnol，2023(74):61- 68.28 Jasmine I，Lata A，Saurabh S，et alA statistical method for enhancing the production of succinic acid from Escherichia coli under anaerobic conditionsJBioresource Technology，2023(97):1443 1448.29 焦瑞身等，陈远童，储炬，等微生物工程M北京:化学工业出版社， 2023.