pcr扩增的原理和步骤.docx

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1、PCR扩增反应的操作第一节PCR扩增反应的基本原理一、聚合魄式反应(PCR)的基本构成PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板(克隆或基因组DNA)的扩 增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有 广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等.PCR基本原理：是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3,末墙有引物存在的情 况下， 用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微鼠的模板DNA得到极大程度的扩增.在微量离心管 中，加入与待扩增的DNA片段两端己知序列分别互补的两个引物、适量的冲液、微量的DNA

2、膜 板、四种dNTP溶液、耐热TaqDNA聚合醇、Mg2件,反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下 变性，双链解开为单链状态：然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其祀序列配对，形成部分双 链，称为堰火；再将温度升至合适温度,在TaqDNA聚合酶的催化 下，以dNTP为原料，引物沿方向 延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反 应的模板，如此重夏改变温度，由高温变性、 低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增.因此PCR循环过程为三部 分构成：模板变性、引物退火、痢稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成(见图)。1,模板DNA的变性模板DNA加热

3、到90八5-C时，双螺旋结构的级键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以 便它与引物结合.为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G.C含量有关，GC间由三个 氢键连接，而 A-T间只有两个狙键相连.所以Gt含量较高的模板，其解链温度相对要高些.故PCR中DNA变性需要 的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有 关。对于高G_C含量的模板 DNA在实验中需添加一定量二甲基亚破(DMSO),并且在PCR循 环中起始阶段热变性温度可以采用 97.C,时间适当延长，即所谓的热启动.2 .模板DNA与引物的退火将反应混合物温度降低至37-65C时，寡核昔酸引物与单链模板杂交，

4、形成DNA棋板引物 复合 物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核昔酸的碱基组成。一般要求 引物的浓度大大高于棋板DNA的浓度，井由于引物的长度显著短于棋板的长度，因此在 退火时，引 物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为2min。3,引物的延伸DNA模板-引物复合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板.按基困 对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA能互补的新链。重复循环变性退火延伸三过程，就可获 得更多的“半保留复制鞋”，而且这种新负圭又可成为下次循环的模板,延伸所需要的时间取决于模板 DNA的

5、长度。在72*C条件下,TaqDNA聚合醪催化的合成速度大约为4060个碱基，秒,经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环也 新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加一倍,每完成一个循环 需2s4min, 一次PCR经过30s40次循环，约2s3 _L扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引 物、模板、聚合酶达到一定比值时.酶的催化反应趋于抱和，便出现所谓的“平台效应” .即爬DNA 产物的浓度不再增加.PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升.反应最终的DNA扩增量可用Y=(1+X) *计算.Y代表DNA片段扩增后的拷贝数

6、，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩 增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增 加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加,而进入性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩 增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素.大多数情况下，平台期的到 来是不可避免的。PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分.短产物片段的长度严格地限定在两个引物 链5,端之间.是需要扩增的特定片段.短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的棋板不一样而形 成的，以一个

7、原始模板为例，在第一个反应周期中.以两条互补的DNA为模板，引物是从3,端开始延 伸.其5,端是固定的3,端则没有固定的止点.长短不一，这就是“长产物片段“.进入第二周期后.引物除 与原始棋板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段”）结合。引物在与新链结合时，由于新 链模板的5,端序列是固定的.这就等于这次延伸的片段3,端被固定了止点，保狂了新片段的起点和止 点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”.不难看出“短产物片段”是按指数 倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计.这使得PCR的反应产物不需要 再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用.+ O

8、引物合曲变性退火延伸图PCR的反应历程二、PCR疝的五个刑参与PCR反应的物质主要为五种：引物、酶、dNTP,模板和M叶.I-引物引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与棋板DNA互补的程度。理 论上. 只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核甘酸桂做引物，利用PCR就可将模板 DNA在体外大堂扩增“引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补.其次引物与引 物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即 错配）.引物的选择将决定PCR产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重 要物理参

9、数.好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生,甚至在RNA-PCR中也能识别CDNA或基 因组模板。引物设计也极大的影响扩增产量：若使用设计粗槌的弓I物,产物将很少甚至没有：而使用 正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。当然，即使有了好的引物，依然 需要进行反应条件的优化，比如调整M曹愀度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚甲酰胺和甘油。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则， 则有助于引物的设计。3的聚合酵活力，53,的外切核酸酵活力，无 3J 5 的外切核酸酶活力，会在3,末端不依赖模板加入I个脱氧核昔酸（通常为A,故PCR产物克 隆中有与之匹

10、配的T载体），在体外实验中，TaqDNA聚合酶的出错率为叶此酶的发现使PCR 广泛的被应用。此酶具有以下特点：（1）耐高温，在70C下反应2小时后其残留活性在90%以上,在93C下反应2小时后其残 留活 性是仍能保持60%,而在95C下反应2小时后为原来的40%o（2）在热变性时不会被钝化，故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新醴。一般扩增的PCR产物长度可达2.0 kb,且特异性也较高.PCR的广泛应用得益于此酶，目前各试剂公司中开发了多种类型的Taq酶，有用于长片段扩增的 酶，扩增长度极端可达40kb；有在常温条件下即可应用的常温PCR聚合酶；还有针对不同实验对象 的酶等。一典型的PCR反

11、应约需的酶量为2.5u （总反应体积为50gl时）浓度过高可引起非特异性扩增， 浓度过低则合成产物最减少-3 . dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生 物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后.以IMNaOH或IMTris.HCI的缓冲液将其pH调 节到7.07.5，小量分装，-20*C冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反 应中，dNTP应为50 200呻。1/1 .尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其 它几种时（偏高或间氐），就会引起错配.浓度过低又会降低PC

12、R产物的 产量.dNTP能与M。+结合， 使游高的Mg浓度降低。4 .模板（靶基因）核酸棋板核酸的量与纯化程度.是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS 和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而 溶解脱蛋白 而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白.SDS还能与蛋白质结合而沉淀蛋白酶K能水解消化蛋白质， 特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂（酚与氯仿抽抽提除去蛋白质和其它细胞组份用乙 醇或异丙醇沉淀核酸，该核酸即可作为棋板用于PCR反应,一般临床检测标本，可采用快速筒便的方 法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离

13、，宜接用于PCR扩增.模板DNA投入量对于细菌基因组DNA 一般在I10ng佃，实验中模板浓度常常需要优化，一般 可迭择几个浓度梯度（浓度差以10倍为一个梯度）,在PCR反应中，过高的模板投入：fi往 往会导致 PCR实验的失败。5 . M叶浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的彩响,在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200呻 。1/1时，度为1.52.0mmof/l为宜。Mg?+浓度过高，反应特异性降低.出现非特异 扩增，浓度过低会 降低TaqDNA聚合酶的活性,使反应产物减少。一般厂商提供的Taq DNA聚 合酵均有相应的缓冲液， 而Mg?他已添加，如果特殊实验应采用无Mg2

14、,的缓冲液,，在PCR反应体系中添加一定量的Mg2三、PCR反应待点PCR反应具有以下特点：1 .强特异性PCR反应的特异性决定因素为：（1）引物与棋板DNA特异性的结合I （2）碱基配对原则| （3） TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性】（4）靶基因的特异性与保守性.其中引物与模板的正确结合是关键，引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则 的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中棋板与引物的结合（复性）可 以 在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度.再通 过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高”2 .高

15、灵敏度PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pgFF%量级的起始待测模板扩增到 微克 （gg=IOGg）水平.能从100万个细胞中检出一个靶细胞：在病毒的检测中，PCR的灵敏度 可达3个 RFU （空斑形成单位由在细菌学中最小检出率为3个细菌。3 .快速简便PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合藕,一次性地将反应液加好后，叩在PCR仪上进行变性一退火一 延伸反应，反应一般在2s4小时完成。扩增产物常用电泳分析，操作简单易推广，如采用特殊PCR 仪（荧光时时定SPCR仪）则可全程监测PCR反应的结果，故耗时将更短.4 .低纯度模板不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA等均

16、可作为扩增模板.可直接 用临床 标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测.第二节PCR扩增反应的实施一、PCR反应的条件PCR反应条件为温度、时间和循环次数.1 ,温度与时间的设置基于PCR原理三步骤而设贸变性-退火-延伸三个温度点,在标准反应中采用三温度点法，双链DNA 在90s95*C变性，再迅速冷却至40s60*C,引物退火并结合到区已序列上，然后快速升温 至70s75c. 在TaqDNA聚合酶的作用下.使引物链沿棋板延伸,对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二 温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94P变性，65鼠左右退火与

17、延伸 （此温度TaqDNAB仍有较高的催化活性）。（I）变性温度与时向：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下， 93cs94Tlmin足以使棋板DNA变性，若低于93c则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对醇的活性有影响.此步若不能使系己基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败-（2）退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因索。变性后温度快 速 冷却至40P-&TC,可使引物和模板发生结合.由于模板DNA比引物复杂得多，引物和棋板 之间的碰撞 结合机会远远高于模板互补链之间的碰擅。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱 基组成及其浓 度

18、，还有靶基序列的长度。对于20个核昔酸，G+C含量约50%的引物，55*C为选 择最适退火温度的 起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm 值（解链温度）=4 （G+C） +2 （A+T）复性温度=Tm值510C）在Tm值允许范围内.选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR 反应的特异性。复性时间一般为3060戏，足以使引物与模板之间完全结合。（3）延伸温度与时间* Taq DNA聚合醵的生物学活性：70-80C, 150核昔酸/S博分子】7 or, 60 核昔酸/S/酶分子；55C, 24核昔酸酶分子；高于90c时.DNA合成几乎不能进行。

19、（4） PCR反应的延伸温度一般选择在70675c之间，常用温度为72C,过高的延伸温度不 利于引 物和棋板的结合.PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般Ikb以内的DNA片段，延 伸时间Imin是足够的。3s4kb的条己序列需3s4min：扩增lOkb需延伸至】5min延伸进间过长会导 致非特异性扩增带的出现.对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些-2 循环次数循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度，一般的循环次数选在 30-40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。二、PCR扩增油分析PCR产物是否为特异性扩增,其结果是否准确可靠，必

20、须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出 正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。1,凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB漠乙锭染色紫外仪下观察,初步判断产物的特异性。PCR 产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR,应用多对引物，其产物片断都应符合预 讦的大小, 这是起码条件（1）琼脂糖凝胶电泳：通常应用12%的琼脂糖凝胶，供检测用.（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳：610%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂惊好，条带比较集中， 可用于科研及检测分析。2,酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酵的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合 理论的片段，此法既能进行产物的

21、鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。3 .分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有 效方法-4 . Southern印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核昔酸链（内部寡核昔酸）标记后做探针. 与PCR产物杂交.此法既可作特异性鉴定.又可以提高检测PCR产物的灵敏度还可知其分子量及条带 形状，主要用于科研.5 .斑点杂交：将PCR产物点在硝酸纤雉素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核昔酸探针杂交，观 察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。6,核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。三、PCR结果异常分析PCR产物的电泳检测时间一

22、殷为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚 致消失.1 .假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关健环节有：模板核酸的制备：引物的质量与特异性；（3）酶的质最及活性： PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。（1）模板：棋板中含有杂蛋白质,模板中含有Taq蘸抑制剂；模板中蛋白质没有消化除 净，特别是染色体中的组蚩白：在提取制备模板时丢失过多.或吸入酚：模板核酸变性不彻底。 在酶和引物质量好时.不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取 过程出了毛病，因 而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改（2）酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导 致假阴性.需注意的是有时忘加Taq酶或漠乙锭。 25-35个循环72t 延伸 Imin J72t 延伸 7min完成后可在PCR仪作15c保存。最后做琼脂精擦胶电泳，电泳胶的浓度和体积根据实际需要确定.采用天根（TIANGEN.天根生化科技有限公司）2XHosStartTaq Master Mix,该产品包含HotStartTaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg%、反应缓冲液、PCR反应增强剂和优化剂以及稳 定剂，浓度为2X。