流式细胞仪检测细胞周期操作步骤.docx

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1、流式细胞仪检测细胞周期操作步骤取对数生长期的A549细胞，按1义IO, cells/ mL以1mL接种于 100mm培养皿内24h后,进行所需的处理（比如加药,照射）特定时间后终止培养，进行下一步的实验收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中lOOOrpm离心5min （短时低速离心）弃上清，用预冷PBS, lOOOrpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片加入预冷PBS,在涡旋状态下加入无水乙醇，混匀后，于4固 定30min,或-20。长期保存。1000r/min,离心 5min细胞有较强的绿色荧光，坏死细胞(包括极晚期凋亡细胞)有绿 色和红色荧光双

2、重染色。在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞，为(Annexin V-/PI-);右上象限是非活细胞，即坏死细 胞，为Annexin V +/PI+；而右下象限为凋亡细胞，显现 Annexin V +/PI。将乙醇吸除，加PBS清洗混匀1000r/min, 5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去吸除离心管内PBS,加入200ul PBS和2ul的RNA酶（ml） （37下 孵育30min）加入的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min将离心管内的细胞过滤（300um尼龙网膜）至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管提前一天网上预约开机（

3、先开仪器后开软件）I流式细胞仪的结构一般分为5部分：流动室及液流驱动系统； 激光光源及光束成形系统；光学系统；信号检测、存贮、 显示、分析系统；细胞分选系统。检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激发光源）I荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）I在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析Modfit软件分析O图片拷贝：直接Ctrl+CFlowjo软件分析CDFCM-DN

4、A量分析1个细胞增殖群时，可将DNA含量分布组方图分为三部分，即GO/K S、G2Mo G0/1和G2M细胞峰的DNA分布均为正态分布，S期可以认为是一个加宽的正态分布I检测结果刻录光盘保存I关机（先关软件后关仪器，关机前需清洗）正常细胞DNA含量：2n-4n凋亡细胞：核内DNA断裂，乙醇固定后膜通透性增加，小片段DNA 穿膜丢失，胞内DNA含量减少。PI染色后，荧光强度减小而形 成一个DNA含量小于2n的分布区(亚G1峰)。1、纵坐标Cell Number：即计数的有效细胞数；2、横坐标DNA Content：即DNA含量；3、Gl、G2、S三期在图中已经标示；4、右侧数字含义：Dip %

5、at ,即G1期DNA含量平均值为；%即G1期细胞数占总数的%; Dip % at ,即G2期DNA含量平均值为，即G2期细胞数占总数的加Annexin V-EGFP/PI双染法检测细胞凋亡基本原理：磷脂酰丝氨酸(PS)能与连接素V (AnnexinV)发生特异结合；PI是核酸荧光染料，不能透过正常细胞膜，只能进入已经破损的细胞膜，在嵌入双链DNA后释放红色荧光，荧光强度与PI结合量呈良好的线性关系。正常细胞：膜完整，PS不外翻一一PI-/AnnexinV-凋亡早期：膜完整，PS翻转一一PI-/AnnexinV +凋亡晚期：PS外翻，膜通透性增加PI+/AnnexinV +坏死细胞：膜严重破损

6、，PS不外翻PI+/Annexin V +几乎不存在膜结构PI+/Annexin V实验步骤：取对数生长期的细胞，按IX ICT cells/ mL以1mL接种于培养皿内I24h后，进行所需的处理（比如加入药物）I特定时间后终止培养，进行下一步的实验I细胞用%胰酶37消化5min（胰酶消化时间不易过长，以防引起假阳 性）加入PBS制成细胞悬液（移液枪吹打6-8次）倒置显微镜下观察细胞状态（单个分离悬浮）将细胞悬液移入15ml离心管中2000rpm 离心 5min, PBS 吸除用PBS清洗细胞2次（2000rpm,离心5m清收集细胞）用400ul IXBinding Buffer悬浮细胞（浓度大约为1 X IO,cells/ml）在细胞悬液中加入5ul Annexin V-EGFP,轻轻混匀后于2-8避光条件下孵育15 min加入10ul PI后轻轻混匀，于2-8避光条件下孵育5 min在1 h内用流式细胞仪检测流式细胞仪激发光波长采用Ex. = 488nm双波长激发，Em.=510 nm检测EGFP荧光（FL1 channel）和575 run的发射波长检测Pio细胞应可分成三个亚群：活细胞仅有很低的荧光强度，凋亡