菌种的分离与培养.docx

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1、菌种的分离与培养在自然界里，食用菌都不是单独存在的，而是和许多细菌、放射菌、霉菌等生活在一 起的。所谓菌种分离，就是把这些和食用菌一起生活的杂菌分离出来，通过培养，获得纯 的优良菌种。菌种分母种、原种、栽培种。(-)母种的分离培养食用菌母种的分离，可分为胞子分离法、组织分离法以及基内菌丝分离等。1 .泡子分离法胞子分离法，是用食用菌的有性抱子或无性泡子萌发成菌丝，培养成菌种的方法。这 种菌种生活力较强，但抱子个体之间有差异，且自然分化现象较严重，变异大，需经出菇 试验才能在生产上应用。(I)单抱分离法：是每次或每支试管只取一个担泡子，让它萌发成菌丝体来获得纯 菌种的方法。蘑菇和草菇用单泡分离得

2、到的菌丝，有结实能力，可采用此法分离生产纯菌 种。单胞分离生产上较少采用，而且技术复杂，一般采用多胞分离法。(2 )多抱分离法：就是把许多抱子接种在同一培养基上，让它们萌发、自由交配来获 得食用菌纯菌种的一种方法。具体操作方法，有以下几种：种菇抱子弹射法：选择个体健壮、朵形圆正，无病虫害、出菇均匀、高产稳产，适 应性强的八九分成熟的种菇，切去大部分，菌柄用无菌水冲洗数遍后再用已灭菌的纱布或总之，污染机会很多，要注意环境消毒，按无菌操作规程彻底灭菌，层层把关，环环 抓紧，严加注意；提离菌种质量。脱脂棉、滤纸吸干表面水分。在接种箱或无菌室内，把种菇的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃 漏斗下面，漏斗倒盖在培

3、养皿上面；上端小孔用棉花塞住。培养皿放在一个铺有纱布的搪 瓷盘上，静置12 20小时，菌褶上的泡子就会散落在培养皿内。形成一层粉末状泡子印（平菇极淡紫色，蘑菇、草菇为褐色，香菇、金针菇泡子印白色1用接种针沾取少量泡 子在试管中的琼脂外面或培养皿上划线接种。待泡子萌发，生成菌落时，选抱子萌发早、 长势好的菌落进行试管培养。还可用泡子采集器收集泡子。方法是选好种菇后，按上述程序，轻轻掀开玻璃钟罩， 将种菇柄朝下插在泡子采收器的钢丝架上，放在培养皿正中央。随即盖好玻璃罩，用纱布 将钟掌周围塞好。并在纱布上倒少许升汞或无菌水。移入20（左右恒温箱培养。褶上涂抹法：按无菌操作分离时；应选择成熟的种菇，用

4、接种针直接插入褶片之间, 轻轻抹取褶片表面子实体尚未弹射的胞子，再在培养基上划线接种。钩悬法：取成熟菌盖的几片菌褶或一小块耳片（黑木耳、毛木耳、白木耳，用无菌 不锈钢丝（或铁丝、棉线等其他悬挂材料）悬挂于三角瓶内的培养基的上方，勿使接触到 培养基或四周瓶壁。置适宜温度下培养、转接即可。贴附法：按无菌操作将成熟的菌褶或耳片取一小块，用溶化的琼脂培养基或阿拉伯 胶、浆糊等贴附在配管斜面培养基正上方的试管壁上。经612小时的培养，待泡子落在 斜面上，立即把泡子连同部分琼脂培养基移植到新的试管中培养即可。抱子分离得到的母种、必须进一步提纯复壮，当母种定植一星期左右，菌丝布满斜面 时，选择菌丝健壮、生长

5、旺盛无老化、无感染杂茵的母种试管，进而转管扩大，一般到栽 培种，转管不宜超过5次。胞子分离得到的母种，必须通过出菇试验，鉴定为优质菌种后，才可供生产使用。一般菌类如蘑菇、平菇、凤尾菇、香菇、冬菇和草菇等，都可用多泡分离法获得母种。现就银耳泡子分离略述于下：按无菌操作获取种耳后，悬挂种耳的三角瓶经12小时培养后，瓶底培养基表面就有 抱子印取出种耳，置2025。（:温箱培养23天，培养基表面会出现乳白色透明的 糊状小菌落，就是银耳的酵母状分生抱子形成的少量银耳菌丝。此时移接入试管斜面培养 基上，待长满斜面后，再移接入营养丰富，且表面比较干燥的培养基上。经30天左右， 菌落长出白色菌丝。银耳的酵母状

6、分生泡子、菌丝只有与羽毛状菌丝的子囊菌（香灰菌丝）混合培养时， 由后者帮助分解木材及其他一些纤维物质，提供营养，才能利于银耳抱子萌发，菌丝的定 植和子实体的形成。在两种菌丝交会时，先选出两种纯菌丝。羽毛状菌丝要纯化选育，一般要选取生长迅速，爬壁力强的试管斜面或种瓶，取先端 菌丝，转管移接，置25（28T上培养，重复转管几次即可得到优良纯种。银耳菌丝的特点，菌丝生长缓慢，担泡子也不易萌发。在进行两菌混合时，先取经8 I。天培养的银耳菌丝斜面按无菌操作方法在该斜面上距银耳菌丝约。5厘米处接入一小 块羽毛状菌丝。置25下培养1周即得到混合好的银耳母种。利用子实体内部组织，进行无性繁殖而获得母种的简便

7、方法，即组织分离。该法操作 简便，菌丝生长发育快，品种特性易保存下来，特别是杂交育种后，优良菌株用组织分离 法能使遗传特性稳定下来。常采用以下分离方法。(I)子实体分离：种菇要选朵大盖厚，柄短，八九分成熟的优良品种。切去菇两基部, 在无菌箱内以0.1%的升汞水浸几分钟，再用无菌水冲洗并揩干或用75%酒精棉球擦拭菌 盖与菌柄2次，进行表面消毒。接种时，只要将种菇撕开，在萌盖和菌柄交界处或菌褶处, 挑取一小块组织；移接到PDA培养基上。置25左右温度下培养3-5天，就可以看到组 织上产生白色绒毛状菌丝，转管扩大即得到菌种。如香菇、平菇等可以用此方法。(2 )菌核分离：茯苓、猪苓、雷丸等菌的子实体不

8、易采集。而常见的是它贮藏营养的 菌核。用菌核分离，同样可以获得菌种。方法是将菌核表面洗净，用酒精或升汞消毒后， 切开菌核，取中间组织一小块，约黄豆大小，接种在PDA培养基斜面上，保温培养。应 注意的是，菌核是贮藏器官，大部分是多糖类物质，只含有少量的菌丝，因此挑取的组织 块要大一些，如果组织块过小，则不易分出菌种。(3 )菌素分离：有一部分子实体不易找到，也没有菌核，可以用菌素进行分离。如蜜 环菌、假蜜环菌。其操作方法是先用酒精或升汞将菌素表面黑色皮层轻轻擦拭23次，然 后去掉黑色外皮层(菌鞘)，抽出白色菌髓部分；用无菌剪刀将菌髓剪一小段，接种在培养 基上，保温培养，即得该菌菌种。菌素分离要注

9、意：因菌素比较细小，分离素也比较细小，分离时极易污染杂菌，所以 要严格操作。利用食用菌生育的基质作为分离材料，来得到纯菌种的一种方法，叫基内菌丝分离法。此种分离方法是适宜只有在特定的季节才出现，而且是朝生暮死，不易采得的子实体。 基内分离法与组织分离法不同之点是，干燥的菇木或耳木中的菌丝常呈休眠状态。接种后 有时并不立刻恢复生长。因此，有必要保留较长的时间（约1个月），以断定菌丝是否能成 活。基内菌丝分离法又可分为，材中菌丝分离（即菇木或耳木分离法）及土中菌丝分离法 等。（1）材中菌丝分离法：就是菇木或耳木分离法，为了减少杂菌的感染，菇（耳）木在 分离之前，必须进行无菌处理。可以把菇（耳）水表

10、面用酒精灯火焰轻轻烧过，以烧死霉 菌的泡子，或再用0.1 %的升汞水浸泡几分钟，然后用无菌水冲洗后用无菌滤纸吸干。接种 块切取时应注意。接种块必须在该菌菌丝分布的范围内切取。所以，菌丝生长缓慢的种类 应浅取；菌种生长快的种类可以深取。同时。还应根据菇菌的种类、木材质地、菇（耳） 木粗细、发育时间的长短来确定菌丝分布的范围。然后用一把利刀进行切取。接种块应尽 量小些，以减少杂菌感染机会，提离菌种的纯度。接种块移到培养基上，就应该放到适合 菌丝生长的22 26的温室或温箱中培养，使菌丝恢复生长。（2）土中菌丝分离：食用菌种类很多，许多土生的食用菌；泡子不易萌发。组织分离 也不易成功，用土中菌丝分离

11、获得纯种的方法，叫土中菌丝分离。土中菌丝分离时要注意，由于土中菌丝体的周围生活着多种多样的土壤微生物，因此 分离时必须尽可能避开这些微生物的干扰，尽可能批取清洁菌丝素的尖端、不带杂物的菌 丝接种，反复用无菌水冲洗，在培养基中加入一些抑制细菌生长的药物，如40微克/升 的链霉素或金霉素。如发现感染细菌，可以把菌落边缘的菌丝挑出来，接种到木屑培养基 中。因细菌没有分解木质素的能力，因此在木屑培养基中不易扩展；只局限于接种处。待菌丝长出感染区后，就可以再进行扩大提纯了。(3)子实体基部分离：从瓶栽、袋栽或大床栽培的子实体基部分离出新菌丝的方法, 叫子实体基部分离，现以袋栽银耳为例说明：从出耳早、出耳

12、率离、无病虫害的栽培室中；选择生活力最强的幼耳5袋，移到气候 温和，有散射光的野外场所进行后期培养，以增强菌丝体的生活力。经培养710天后， 待子实体直径达45厘米时便可取回，作为分离的母体。再从中筛选最理想的一朵，用 利刀割掉银耳子实体，放置于0的冰箱或有敌敌畏的容器中过夜，以便杀死瓶中的害虫。 然后用75%酒精或升汞擦洗耳基和袋子外边的杂质，连同接种工具、接种培养基等移进无 菌室。经灭菌后，用接种刀把袋上部约15毫米厚的老菌根挖除，并进行培养。待袋口 露出白色菌丝时，用接种针挑取一块半粒米大的白色菌结体，迅速移入母种试管培养基的 中央，轻轻地脱去接种针，塞上棉塞。为了能够获得较多的母种，一

13、次接种量要有 100200支试管，以便从中选择。分离后应及时移入22(24恒温箱或温室中培养。 由于培养基内水分较多，菌丝恢复要比耳木分离得快。经2-3天后，分离物的边缘就可看到 白色菌丝。每天要至少观察两次，以便提纯。观察、提纯方法与耳木分离法担同。经适温 培养10-15天后，当接种块扭结团出现红、黄色水珠时，即可扩大原种。(二)原种和栽培种的接种培养母种获得以后，为了满足菌种生产的需要。应选出优良、纯度高的母种进一步扩大为 原种。原种培养基一般采用棉籽壳、木屑、草类等培养基。瓶装或袋装的原种培养基灭菌后，可送入灭过菌的接种箱内，待瓶中的培养基冷至30以下，可按照无菌操作程序进行接种。菌种瓶

14、（袋）放入培养室时，要经常进行检查，一经发现杂菌污染，立即取出。培养 成的原种，菌丝体必须健壮有力，紧贴瓶壁而不干缩，颜色纯正，具有一定清香味，生活 力强，扩制成栽培种时吃料快。栽培种就是将原种进一步扩大培养成三级种，它和原种的接种及培养相同。一般香菇、 平菇、冬菇、猴头、木耳、银耳的栽培种多用锯木、棉皮作培养基。蘑菇多用粪草做培养 料。栽培种要求料块不脱水干缩。菌丝体健壮有力、颜色纯正，有清香味，无老化现象， 无杂菌污染，有的种许可有少量原基，接入栽培料后，发菌快，长势好，生活力强。原种在接栽培种时，原种瓶口的一层菌丝体应挖去不用。（三）液体种的简单培养目前，用液体深层发酵法生产菌种，具有生

15、产量大、周期短、菌龄整齐、成本低廉、 接种方便等特点，是实现食用菌工厂化生产的目标。现将液体种培育过程简述于后，供参 考。简言之就是将纯正优良的菌种，接入液体培养基（固体培养基不加凝固剂），使菌丝繁 殖形成大量小菌球，然后将这种培养基拌入木屑或棉籽皮料内，制成菌块、培养其形成子 实体。还可用于制原种、栽培种。培养液体菌种，可将培养液装入三角瓶中，约占空瓶的五分之一重量。用摇瓶机（也 称摇床）来培养。摇瓶机有旋转式和往复式两种，一般多用往复式。液体培养基可用马铃薯汁（加糖）,麦芽汁配制，也可用玉米粉、豆饼粉、糖、无机盐等配制。可以混合培养基, 因适用于多种食用菌和药用菌的培养，均有好效果。组分：

16、豆饼粉2%,玉米粉1% ,葡 萄糖3% ,酵母粉0.5% ,磷酸二氢钾0.1% ,碳酸钙0.2% , pH自然，12工灭菌半小 时。然后接种培养。如果生产量较大，在三角瓶的基础上，再逐级扩大种子缸，发酵罐中进行液体深层通 气发酵，产生大量菌种。但由于生产中要求设备繁多，技术性强，我们还应创造条件；实 现食用菌栽培的现代化。（四）菌种质量的鉴定菌种质量鉴定最好的方法是，做出菇试验。但是时间比较长。在购置菌种时，或在菌 种生产中，如何能知菌丝生长情况，快速判断菌种质量？我们介绍几种方法：1 .肉眼观察：优良菌种菌丝浓白，绒状，粗壮密集，生长整齐，速度快，香味浓厚。2 .优良菌种标准可归纳为：纯、香

17、、正、壮、润五个字。检查时，打开瓶塞，从菌种 瓶中部取出小块菌丝体，观察色泽，闻其气味，手捏料块检查其含水量，看是否符合上述 要求标准。3 .显微镜检查：挑取少量菌丝，置显微镜上观察其形态，菌丝分枝，分隔情况，锁状 联合，细胞膜的厚薄。培养观察：从菌种瓶中挑取小块菌丝体，接种斜面试管培养基上， 置2325恒温中培养，经五周后检查菌种生活力。如果菌丝生长快，旺盛纯一，健壮 浓厚，长且整齐，则表示菌种的生活力强。4 .分块法：在桌上放一张白纸，把菌龄相同的菌种从瓶内取出一大块，用手分成2块, 再把2块分成4块，4块分成8块，依次进行。优良菌种整块多，碎渣少。劣次菌整块少, 碎渣多。5 .液体菌种鉴

18、别：当三角瓶或发酵缸培养3-7天后，如液面出现气泡，产生油皮、混 浊等现象，说明菌种本身带有杂菌。如菌块上浮，或迟迟长出很薄的菌丝层，则说明菌种 生活力弱。白块四周的菌丝生长快、浓白、棉絮状，表明菌种生命力强。（五）菌种生产过程中的杂茵防治在生产菌种时，要时刻注意杂菌污染，以防为主，一旦发生，根治很不容易。所以整 个制种过程都必须在无菌条件下进行。接种箱及所有分离、接种的用具、器皿，都要进行 严格的消毒灭菌。工作人员的双手要用消毒剂清洗，并穿戴消过毒的工作服、帽和口罩， 动作要敏捷、准确，尽量不要讲话走动，以防空气中的杂菌感染。分离母种时，选择出菇早、生活力强，第一潮菇是关键，因它生活力强，接种后迅速 占领阵地，无杂菌侵入的机会。被污染的菌种，原因是多方面的，一般是灭菌不彻底所致，或因接种时无菌操作不严、 瓶盖不合适造成的。所以灭菌一定要彻底，最好在接种萌将培养基置25左右温箱中做效 果检查，经2天不长杂菌，说明彻底，可以使用，接种过程中一定要严格无菌操作。污染杂菌另一个原因可能是分离母种时感染杂菌，因种菇表面带菌，消毒不彻底，通 过组织块将杂菌带入培养基。