【上海医科大学】优质课《微生物学》第四章 细菌和噬菌体的遗传重组.ppt

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1、【上海医科大学】优质课全国特级教师江新欢博士教授微生理学微生理学第四章 细菌和噬菌体的遗传重组 Inheritance in Bacteria and bacteriophages第四章 细菌和噬菌体的遗传重组 Inheritance in Bacteria and bacteriophagesn迄今为止，我们所讨论的均是有减数分裂的真核生物的遗传特点，而没有核、不进行减数分裂的原核生物（细菌、病毒等）的遗传物质又是如何传递的呢？T4 噬菌体噬菌体细菌的细胞和基因组1-2 m（长）0.5 m（宽）DNA长约1100 m；分子量约2.6109n细胞结构-与真核细胞的差异：缺乏线粒体、叶绿体，无核

2、膜。荚膜鞭毛拟核细胞壁细胞膜核糖体2 m细 菌 的 菌 落 裸露的、闭合环状、双链DNA分子，以折叠或螺旋状态的高度组装形式存在。细菌的染色体细菌的染色体（电镜照片）细菌和病毒的拟有性过程v真核生物基因分离、自由组合及连锁交换均通过有性过程(减数分裂受精)实现。细菌和病毒均属于原核生物，不存在严格意义上的有性过程。v细菌细胞内除了染色体外还有一些寄生性复制因子（如噬菌体和质粒），又称核外或染色体外因子，可以在细胞间传递，并形成细菌染色体间以及细菌染色体与核外遗传因子间的重组体。v拟有性过程引起细菌、病毒间遗传物质转移与重组的过程。细菌的细胞分裂nE.coli 基因组：nE.coli 4.6 M

3、b，4288 genesn90%编码蛋白质细菌的突变型及其筛选E.coli突变类型合成代谢功能的突变型：合成代谢功能的突变型：甲硫氨酸缺陷型甲硫氨酸缺陷型：met-（营养缺陷型）其相应的野生型其相应的野生型：met+抗性突变型：抗性突变型：青霉素抗性菌株：青霉素抗性菌株：penr（抗生素抗性突变型）青霉素敏感性菌株：青霉素敏感性菌株：pens 分解代谢功能的突变型：分解代谢功能的突变型：乳糖突变型：乳糖突变型：lac-（碳源突变型）其相应的野生型：其相应的野生型：lac+（一）营养缺陷型在营养代谢上是有缺陷的菌株，统称为营养缺陷型，而把正常的野生型叫做原养型。n基本培养基：能满足野生型菌株营养

4、要求的最低成分的组合培养基。n补充培养基：在基本培养基中有针对性地加上某一种或几种其自身不能合成的成分，以满足相应营养缺陷型生长的培养基。n完全培养基：在基本培养基中加入一些富含生长因子的物质，以满足该微生物各种营养缺陷型要求。病毒的结构病毒的一般特性 无细胞结构-为蛋白质外壳包裹核而成的颗粒 形体极微小-电子显微镜下观察 化学组成简单-核酸（DNA或RNA）和蛋白质 缺乏独立代谢能力-依赖宿主（但宿主范围比较窄）繁殖方式独特-依赖宿主活细胞的代谢机制，通过核酸复制和蛋白质合成后再装配成完整的病毒颗粒 具有双重存在方式-或专性寄生在活细胞内，或在细胞外以大分子颗粒状态进行传播 对干扰素敏感，而

5、对抗生素不敏感 细菌和病毒在遗传研究中的优越性v世代周期短-大肠杆菌（Escherichia coli）20分钟即可繁殖一代v易于管理和进行化学分析-用一支试管就可贮存数以百万计的细菌或病毒，在短期内累积大量产物，为化学分析提供条件。v遗传物质较简单-只有一个裸露的DNA或RNA分子v便于研究基因的突变-裸露的DNA分子（有的噬菌体为RNA分子），容易受环境条件的影响而发生突变；单倍体生物，不存在显性掩盖隐性问题，隐性突变也能表现出来。v便于研究基因的作用-细菌可以生活在基本培养基上，易于获得营养缺陷型，也易于测知各种营养缺陷型所需要的物质，可以从生化角度研究基因的作用。v可作为研究高等生物的

6、简单模型-可以从微生物的研究中得到模型，并从中获得启发，为开展对高等生物的的遗传研究开拓思路。细菌基因重组的方式l一个细菌细胞的DNA与另一个细菌细胞DNA的交换重组可以通过四种不同的方式进行：转化接合性导转导第一节 细菌转化 transformation一、转化的发现二、转化过程三、共同转化与遗传图谱绘制转化（transformation）l转化-是指某些细菌（或其他生物）能通过其细胞膜摄取周围供体（donor）的染色体片段，并将此外源DNA片段通过重组整合到自己染色体组的过程。l转化中，提供遗传物质的细胞称为供体（donor），接受供体遗传物质的称为受体（receptor）。l只有当整合的

7、DNA片段产生新的表现型时，才能测知转化的发生。一、转化的发现l转化的两个实验在下一章介绍。转化过程l不同细菌转化过程有一定差异，但是它们都存在几个共同特征：1.供体DNA与受体细胞结合吸附2.DNA的穿入和摄取吸收3.联会与外源DNA片段整合转化过程双链DNA与细胞表面感受位点可逆性结合联会双交换引起重组单链DNA插入受体细胞DNA中，形成杂合体杂合的DNA经复制可以形成亲本型和重组型DNA，导致转化细胞的形成与表达。进入受体细胞的供体DNA转为单链，另一条链被降解。n转化子：细菌细胞经过转化所形成的各种重组子。n转化的特点：1、转化时基因重组只发生在供体和受体的同源区域之间；2、不存在相反

8、的重组子；3、只有双交换和偶数次交换才能形成重组子。转化作图+trp2his2tyr1Rf 10058.8%196+328 196+328+367独立片段连锁片段共转化频率越高，连锁越紧密。第三节 细菌的接合 conjugationn一、E.coli 接合的发现 1946年 Lederberg 和 Tatum 发现细菌的接合。细菌接合：是指通过细菌细胞的直接接触，遗传物质从供体细胞单向转移到受体细胞的过程。接合现象的发现和证实 1946年，J.Lederberg&E.Tatum 大肠杆菌杂交试验：材料：大肠杆菌 K12菌株的两个营养缺陷型品系：菌株A甲硫氨酸缺陷型 met-和生物素缺陷型 bi

9、o-菌株B苏氨酸缺陷型 thr-和亮氨酸缺陷型 leu-方法：将A、B两菌株混和，在基本培养基（固体）上涂布培养。结果：平板上长出原养型菌落(+)。上述试验获得的原养型菌落可能产生于：亲本菌株A或B发生了回复突变；两品系细胞通过培养基交换养料互养作用；两品系间发生了转化作用；发生细胞融合，形成了异核体或杂合二倍体。为了验证这些原养型菌落产生的可能而进行的研究最终表明：这些解释均不成立。结果分析回复突变可能的排除 Lederbery和Tatum利用的双营养缺陷型菌株进行试验，已基本排除A或B品系发生回复突变产生原养型细菌的可能。因为：单基因回复突变的频率约为10-7；双基因回复突变的频率则为10

10、-14，频率很低。但试验中产生原养型菌落产生的频率非常高（10-7），因此基本可以排除回复突变的可能。互养作用及其排除试验材料 A品系：A-B+T1S(met-bio-thr+leu+T1S)；B品系：A+B-T1R(met+bio+thr-leu-T1R)。试验方法：将A、B品系混合接种在基本培养基表面，短时间后喷噬菌体T1杀死A品系，使其不能持续产生thr与leu供B品系持续生长。结果：仍然出现原养型菌落。结论：表明互养并非原养型菌落出现的原因，而可能发生了遗传重组。转化作用及其排除Lederbery和Tatum：在混合液中添加DNA酶，仍然出现原养型菌落。戴维斯(Dawis,1950)的

11、U型管试验：结果：任何一臂的培养基上均未长出原养型细菌。结论：细胞直接接触（接合）是原养型细菌产生的必要条件，从而否定了转化的可能。两种培养基中间放置一个滤片一边加压和吸引使培养液充分混合二、单向转移与F因子 1952年，W.HayesA菌株B菌株链霉素AB混合培养，原养型重组体链霉素BA混合培养，细菌接合中遗传物质转移是单向过程 （即从A B株）细菌分为两个类群（两种接合型)供体（或雄菌株）受体（或雌菌株）F因子及其转移 供体或雄性细菌细胞内有一种致育因子（fertility factor，F），用F+表示。存在于细菌细胞中，赋予细菌以性别的并能独立增殖的环状DNA分子。染色体外的一个共价环

12、状DNA分子（94.5 Kb；细菌DNA的2%；1/3基因与接合有关)。接合：原核生物中，遗传物质从供体（“雄性”）转移到受体（“雌性”）的过程。F因子 原点：转移的起始位点 致育基因群：包括性伞毛基因、转移基因等。自主复制区 配对区：与染色体配对，交换后插入染色体。自主复制区据 F 因子有无以及存在状态E.Coli 有三种类型：F-不含有 F 因子 F+含有一个自主状态的 F 因子 Hfr（高频重组菌株）含有一个整合到染色体上的 F 因子nF因子中有形成F纤毛（F pill）的基因 结合管 F+细胞中的F因子由结合管向F-传递 F-受体变成 F+F+F F+F菌毛启动细胞间的连接F因子通过复

13、制在子细胞中产生一个新拷贝在供体细胞中保持一个拷贝的F因子三、F+菌株的特点 F+细菌可以把F因子传给后代。F+细菌经吖啶橙处理F因子丢失，也可以自发丢失F因子，丢失后不再出现。F+可以和F-杂交，而不能和F+杂交。F+和F-杂交，可将F-转化为F+，但为低频重组（因为：F因子的整合频率为每代10-5 10-7）。第四节 高频重组品系 一、F+HfrHfr F-细菌染色体由一小段单链的F因子为前导而转移到F-受体边转移边合成（边交换）。一般情况下，仅小部分细菌染色体能转入接合管中断控制合成伞毛的基因没有进入受体细胞受体细胞仍为F-。HfrF-多数为F-二、部分二倍体：当F+或Hfr的细菌染色体

14、进入F-后，在一个短时期内，F-细胞内的某些位点就会成为二倍体DNA。外基因子内基因子不能复制，细菌不能繁殖重组型重组型不能复制，丢失 重组发生在部分二倍体中；单交换产生不平衡的线性染色体；只有偶数次交换才能产生平衡的重组子；相反的重组子不出。F因子可以整合到细菌染色体的不同位置上。HfrF-，Hfr使两个菌株杂交后所产生的重组体频率大大增加（比F+F-高 1000倍）。HfrF-，F因子的传递频率非常低，受体一般为F-。三、Hfr菌株的特点：四、Hfr品系与F+菌株的异同相同都能和F-杂交；杂交都要通过接合管和受体菌相联接；高剂量链霉素处理后都不影响杂交，说明它们都是作为一种供体。不同产生重

15、组子频率不同：HfrF-（10-4），FF-（10-7）。FF后代F，HfrF-后代F-。F细菌经吖啶橙处理变成F，Hfr经吖啶橙处理仍为Hfr。五、重组频率的计算原理：HfrF-杂交中染色体是定向地、均匀地、逐渐进入F-细菌的，大部分F因子并没有进入受体，随接合管断开（中断杂交）的时间不同，进入的基因也不同。目的：推断基因在细菌染色体上的排序。巴斯德实验室，Elie Wolliman和Francois Jacob（1954）。（一）中断杂交实验（interrupted mating experiment）1.接合：把Hfr菌株与F-菌株混合培养在完全培养基上。Hfr：strs thr+leu

16、+azir tonAr gal+lac+F-：strr thr-leu-azis tonAs gal-lac-中断杂交试验过程：2.中断接合：培养一定时间取样，把菌液放在搅拌器内搅拌。3.杀死Hfr菌株：稀释接种到含有链霉素的选择培养基上。4.检出F-所含供体基因5.作图中断杂交作图：根据供体基因进入受体细胞的顺序和时间绘制连锁图的技术。（二）中断杂交作图实验特点：1.Hfr菌株标志基因进入F-细胞中时间不同，达到最高水平的时间也不同；2.随时间的推迟，某3.个基因的重组率增加；4.一定程度后，重组率5.便不再增加。Hfr类型原点基因转移顺序 HfrH Othrprolacpurgalhisg

17、lythi 1 Othrthi glyhis galpur lacpro 2 Opro thr thi glyhisgalpurlac 3 Opur lac prothrthi glyhisgalAB312 Othi thr prolacgurgalhisglyWollman 和 Jacob用不同的Hfr品系进行了大量的中断杂交试验，并作出了基因的连锁图。几个Hfr菌系的中断杂交试验及其连锁图：3121thrpurgalhisglythiprolac差异原因：由于F因子插入环形染色体的位置不同以及配对方向不同（插入序列IS有极性），因此不同Hfr菌株转移的原点(O)和转移方向不同。Circul

18、ar genetic map of E.coliTotal map units=100 minutes（三）重组作图两基因转移时间间距2分钟时，中断杂交法的图距不够精确，应采用传统的重组作图法。例如：据中断杂交试验，已知 lac 和 ade 紧密连锁且lac先进入F-。重组作图实验如下：Hfr lac+ade+(strs)F-lac-ade-(strr)完全培养基混合培养无腺嘌呤、加链霉素的选择培养基ade+strr菌落lac+ade+strr未发生交换lac-ade+strr基因间发生交换ade+strr菌落lac-ade 之间的图距为：lac-ade=lac-ade+(单个整合个体数)la

19、c-ade+lac+ade+(单个整合个体数)(同时整合个体数)100%=22%两个位点间的时间约为1分钟，约相当于22%的重组值。特点：(1)不用亲本类型 ：不重组将丢失。(2)接合重组不产生交互重组类型。六、细菌的性导 sexductionnF因子nF因子整合到宿主细菌染色体的过程是可逆的，当发生环出（looping out）时，F因子又重新离开染色体。然而F因子偶然在环出时不够准确，它携带有细菌染色体的一些基因。E.Adelberg和S.Burns（1959）称这种F因子为F因子。性导性导-利用F因子将供体细胞的基因导入受体形成部分二倍体的过程。F F 因子和性导nF 因子使细菌带有某些

20、突出的特点：F 携带细菌的基因，但并不减少自身的基因。F 可携带不同长度的细菌DNA片段。F F-，F 菌株能高频传递F 因子和特定的基因，使F-变成F 菌株，并形成部分二倍体；形成的部分二倍体后代不稳定，可自发或诱发失去F因子，同时失去新性状。F+，Hfr，F 的接合比较F因子自身可以高效转移，但对供体细菌基因转移的很少。对完整F因子的转移频率很低，而对供体细菌基因转移的效率很高，但能在受体细胞里发生重组的频率低，因为线性的供体染色体要经过偶数次交换才能重组进受体的染色体中形成稳定的环状DNA。对含有少量供体细菌基因的F因子转移频率很高，因为可以形成稳定的环状部分二倍体。但对供体中其它基因转

21、移的很少。一、噬菌体的结构和形态T2噬菌体结构模式 T4噬菌体成熟颗粒头部颈部中轴外鞘基板尾丝第五节 噬菌体染色体的连锁和交换二、类型1、烈性噬菌体（virulent phage）-使宿主菌发生裂解的噬菌体。T类噬菌体。2、温和噬菌体（temperate phage）-感染细菌后，一般情况下并不使细菌破裂，与细菌形成共生关系而同步复制的噬菌体。P1（独立存在）和（整合宿主）噬菌体。温和噬菌体侵入细菌后，有两种选择途径：裂解途径和溶源途径。两种途径所产生的生活周期分别称为裂解周期和溶原周期。温和性噬菌体的生活周期裂解周期溶源周期 溶源周期的噬菌体则附着在大肠杆菌染色体的gal和bio位点之间的a

22、tt座位上，它能通过交换而整合到细菌染色体上，整合的噬菌体称为原噬菌体。含有原噬菌体的细菌称为溶源性细菌，对同种噬菌体不敏感，具有免疫性。v 原噬菌体通过诱导（induction）可转变为烈性噬菌体。诱导方式有：温度改变、与非溶源性细菌的接合等。二、T2噬菌体的基因重组与作图噬菌体遗传性状：噬菌斑的形态（plaque morphology）噬菌斑：在长满细菌的培养皿上因噬菌体繁殖裂解形成的一个个透明圈。每个斑中，一般含有107108噬菌体，这些噬菌体由一个噬菌体繁殖而来的，相当于一个克隆，遗传上均一。基因不同，噬菌斑的大小、边缘清楚程度等不同。宿主范围（host range)：噬菌体能感染和裂

23、解的细菌的范围。（1）噬菌斑形态：正常噬菌体r+：菌斑小、边缘模糊 突变噬菌体r-：菌斑大、边缘清晰（2）宿主范围突变（只能克服噬菌体抗性的突变体）：T2h+噬菌体：只侵染大肠杆菌B株半透明噬菌斑 T2h-噬菌体：能利用B和B/2株透明噬菌斑双重感染（h-r+h+r-）hr hr 总噬菌斑数去掉，作为图距。接种在同时长有B和B/2菌株的培养基上h+r-h-r+h+r-h-r+h+r+h-r-半透明,大 透明,小 半透明,小 透明,大亲组合重组合赫尔希曾得到快速溶菌T2的许多不同品系，以ra、rb和rc表示，它们分别与rh-杂交，结果见下表：每一基因型的百分数rh+rh rh rh重组值rah+

24、rhrbh+rhrch+rh 12.0 34.0 42.0 12.0 5.9 32.0 56.0 6.4 0.7 39.0 59.0 0.924.0%12.3%1.6%三种不同的重组值，表示三种r的座位是不同的，可画出四种连锁图。ra rb rc h ra rc h rb ra rb h rc ra h rc rb如何确定呢？可作下列杂交:rcrb+rcrb 根据r的多少，可算出rb和rc间的重组值。实验表明，此重组值大于Rfrb-h=12.3，故顺序为rchrb？ra在哪边?经ra与rc或杂交无法得到正确的结果，后经许多其他T2品系的研究发现，两种可能均正确。原来T2DNA也是环状的。T2图

25、距总长约有1500图距单位（map unit）。hrcrarb第六节 转导 transduction一、发现vLederberg及其研究生Zinder（1956）在鼠伤寒沙门氏菌（Salmenella typhimurium）中发现转导现象。原因?是否为接合或转化引起的？基本培养基培养是否形成原养型菌落单独培养单独培养混合培养LA22phe-trp-tyr-LA2met-his-否 是 否频率10-5U型管实验，仍得到重组体，排除了接合的可能。并说明它是一种可通过滤膜的过滤性因子（FA）。利用DNA酶处理，FA不受DNA酶影响，仍得到重组体，排除了转化作用的可能。FA与从溶源性菌分离得到的噬菌

26、体P22的质量大小相同。这些结果表明：FA就是温和噬菌体P22。寻找原因的实验n转导-是指以噬菌体为媒介，将细菌的小片段染色体或基因从一个细菌转移到另一细菌的过程。n在这一过程中，细菌的一段DNA被错误地包装在噬菌体的蛋白质外壳内，并通过感染而转移到另一个受体细菌内。n分类：n普遍性转导(generalized transduction)n特异性转导(specialized transduction)二、普遍性转导-可转导细菌染色体组的任何部分同源重组错误包装（10-5几率）转导颗粒假噬菌体转导子（形成的具有重组遗传结构的细菌细胞）n两个基因同在一起被转导称为共转导。共转导的频率愈高，表明两个

27、基因在染色体上的距离愈近，连锁愈密切；相反，共转导频率很低，就说明它们之间距离较远。n通过观察两因子转导(two-factor transduction)，计算并比较每两个基因之间的共转导频率，就可以确定三个基因或三个以上基因在染色体上的排列顺序。三、共转导 cotransduction如：a基因和b基因共转导频率高，a和c共转导频率也高，而b和c共转导频率低，则3个基因顺序为：b a cn举例：利用普遍性转导测定leu（亮氨酸），thr（苏氨酸），azi（叠氮化钠）三个基因顺序。n方法：q（1）利用普遍性转导噬菌体P1侵染带leu+，thr+和azis的供体大肠杆菌；q（2）用从该大肠杆菌释

28、放出来的假噬菌体，再侵染leu-、thr-和azir的受体大肠杆菌；q（3）将受体细菌进行特定培养，以测定该三个基因的连锁关系。没有叠氮化钠、thr+的基本培养基整合leu+细菌可生长azir与azis个数thr+与thr-个数整合thr+细菌生长leu+thr+细菌生长azir与azis个数azir与azis个数leu+与leu-个数没有叠氮化钠的基本培养基没有叠氮化钠、leu+的基本培养基1 2 3n应用普遍性转导作图是比较精确的，这是中断杂交作图所不容易办到的。n但是，普遍性转导作图仅仅是在对某个基因的位置有某些了解的前提下才能进行。所以当一个新的突变基因发现以后，首先是用中断杂交法对它

29、作粗略的定位，接着才用普遍性转导等方法作精确定位。四、特殊性转导-由温和噬菌体进行的转导 噬菌体DNA插入异常切离正常切离 噬菌体DNA的切离 defective-gal dgal n原噬菌体离开细菌染色体时，偶尔可形成某些细菌和噬菌体基因连在一起的DNA片段。这种混杂的DNA片段由噬菌体外壳包装，就形成了特殊性转导颗粒，这种颗粒能把细菌的基因由一个细胞转移到另一个细胞。n转导仅限于靠近原噬菌体附着点的基因，如专门转导大肠杆菌的gal和bio基因。所以这种转导叫做特殊性转导或局限性转导（restricted transduction）。ndg丢失25%的基因，不能复制，也不能引起细菌细胞裂解，

30、只有细菌细胞被诱导发生裂解时，它们才被释放。(a)1/3是稳定的转导子：gal重组形成gal+型 低频转导(b)2/3是不稳定转导子：是dgal+/gal-型部分二倍体 少数情况下会分离出gal-细胞。dgal+不能复制从而丢失。高频转导产生/dgal双重原噬菌体的转导型 双重原噬菌体中，正常的基因可以补偿dgal所缺失的基因功能，当细菌细胞被诱导将发生裂解时，两种噬菌体会同时获得大量复制，从而导致高频转导。比较普遍性转导和局限性转导的异同 相同：都是以病毒作为载体将遗传信息从一个细菌细胞传递到到另一个细菌细胞的过程。不同：1、细菌中断杂交实验，Hfr基因型为M N O P，F-为m n o

31、p。试验结果：基因传递次序为M，P，N，O；试验：M，O，N，P；试验：P，M，O，N。据以上结果，绘出细菌染色体示意图，标明上述基因。另外绘制3个细菌染色体图，分别标明上述三个试验的 F 因子的插入位置和方向。习题：2、用一野生型菌株提取出来的DNA转化一个不能合成丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）和精氨酸（Arg）的突变菌株。产生不同类型的菌落，其数目如下：1、ala+pro+arg+8400 2、ala+pro-arg+2100 3、ala+pro-arg-840 4、ala-pro+arg+420 5、ala+pro+arg-1400 6、ala-pro-arg+840 7、ala-p

32、ro+arg-840 试问这三个基因在基因组上的排列顺序和距离？ala pro=2+3+4+7/1+4+2+3+5+7=0.30 proarg=2+5+6+7/1+2+4+5+6+7=0.37 alaarg=3+4+5+6/1+2+3+4+5+6=0.25 根据以上的计算可以判定ala基因位于中间。这三个基因在基因组上的位置和次序为：pro ala arg 0.30 0.25解题捷径：数目最少的类型是双交换类型，直接把基因定位在中间，然后分别计算基因proala间、基因alaarg间的值即可。本 章 要 点1.转化、接合、性导与转导的概念与基本原理；2.F-菌株、F+菌株、Hfr菌株的概念、区别和用途；3.F因子、F因子的异同点；细菌遗传作图（中断杂交作图、重组作图、转化作图、转导作图）的原理和基本过程；普遍性转导和局限性转导的异同点。