【同济医科大学】优质课《医学微生物学》第一篇 微生物学 第3章细菌感染的检测方法与防治原则.ppt
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1、【同济医科大学】优质课全国特级教师 江新欢 博士教授医学微生物学医学微生物学细菌感染的检测方法与防治原则本章重点与难点细菌感染性标本的采集原则细菌感染性标本的采集原则细细菌感染的实验室检验程序菌感染的实验室检验程序常常用的血清学诊断方法用的血清学诊断方法适适应性免疫的获得方式应性免疫的获得方式人人工免疫的概念和常用的免疫制剂工免疫的概念和常用的免疫制剂细细菌感染的治疗原则菌感染的治疗原则2第一节第一节 细细菌感染的实验诊断菌感染的实验诊断3形态学检查形态学检查可疑细菌可疑细菌感染感染血清(双血清(双份)标本份)标本含菌含菌标本标本直接凝集试验直接凝集试验乳胶凝集试验乳胶凝集试验补体结合试验补体
2、结合试验ELISA等等细菌分离培细菌分离培养与鉴定养与鉴定细菌成细菌成分分检测检测凝集试验、凝集试验、免疫荧光技术免疫荧光技术酶酶免疫技术、免疫技术、免疫印迹试验免疫印迹试验等等细菌培养、形态学检查细菌培养、形态学检查生生物试验、物试验、血清学鉴定血清学鉴定动物试验、药物动物试验、药物敏感敏感试验试验核酸杂交、核酸杂交、PCR16S rRNA基因序列分析基因序列分析基基因芯片等因芯片等核酸核酸检测检测抗原抗原检测检测特异性抗特异性抗体检测体检测细菌感染的实验室检验方法细菌感染的实验室检验方法4一一.临床标本的采集与运送原则临床标本的采集与运送原则早期采集早期采集无无菌操作菌操作 选感染部位选感
3、染部位最佳时间采集最佳时间采集双双份血清份血清 标本采集标本采集 做好标记做好标记置置于密闭容器内于密闭容器内尽尽快送检快送检标本运送标本运送 5二、细菌的检测二、细菌的检测6(一)细菌的形态学检查(一)细菌的形态学检查暗视野暗视野显显微镜微镜相差相差显显微镜微镜主要用于检查在生活状态下主要用于检查在生活状态下细菌的动力及其运动情况细菌的动力及其运动情况不染色不染色标标本本7细菌的染色细菌的染色革兰革兰染染色色抗酸抗酸染染色色荧光金胺荧光金胺O O染色染色其他其他特特殊染色殊染色8革兰染色革兰染色葡萄球菌(革兰染色阳性葡萄球菌(革兰染色阳性)大肠埃希菌(革兰染色阴性大肠埃希菌(革兰染色阴性)9
4、细菌检查的一般程序细菌检查的一般程序标本标本脓脓/痰痰/尿尿血、血、脑脊脑脊液等液等涂片、染色、镜检涂片、染色、镜检分离培养分离培养纯培养纯培养生化生化反应反应血血清学鉴定清学鉴定药药敏试验敏试验动动物实验物实验增菌增菌(二二)细菌分离培养与鉴定细菌分离培养与鉴定10细菌的分离培养细菌的分离培养培养基的成分培养基的成分pH培养时间培养时间温温度度气气体环境体环境在血平板上的肺炎链球菌菌落在血平板上的肺炎链球菌菌落11生化试验生化试验 肠道感染细菌在含铁双糖培养基上的生化反应肠道感染细菌在含铁双糖培养基上的生化反应12血清学鉴定血清学鉴定利用已知的特异性抗体检查未知的纯培养细菌利用已知的特异性抗
5、体检查未知的纯培养细菌对对细菌进行种、群、型的鉴定细菌进行种、群、型的鉴定沙门菌血清学鉴定沙门菌血清学鉴定摘摘自自 临床微生物检验临床微生物检验(第五版)人民卫生出版社(第五版)人民卫生出版社13药物敏感试验药物敏感试验纸片扩散法、稀释法、纸片扩散法、稀释法、E-test法法最低抑菌浓度(最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)能能够完全抑制培养基中细菌生长的最低药物浓度够完全抑制培养基中细菌生长的最低药物浓度最最低杀菌浓度(低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)能能够杀死培养基中细菌的最低药物
6、浓度够杀死培养基中细菌的最低药物浓度14纸片扩散法纸片扩散法含有定量抗生素的纸片贴在已接种待检病原菌含有定量抗生素的纸片贴在已接种待检病原菌的琼脂平板上,纸片上的抗生素向周围琼脂中扩散,的琼脂平板上,纸片上的抗生素向周围琼脂中扩散,形成了逐渐减小的药物浓度梯度。由于致病菌对各形成了逐渐减小的药物浓度梯度。由于致病菌对各种抗生素的敏感程度不同,在药物纸片周围便出现种抗生素的敏感程度不同,在药物纸片周围便出现抑制病原菌生长而形成的大小不同的抑菌环。根据抑制病原菌生长而形成的大小不同的抑菌环。根据抑菌环的有无和大小来判定试验菌对该抗菌药物耐抑菌环的有无和大小来判定试验菌对该抗菌药物耐药或敏感。药或敏
7、感。15稀释法稀释法以一定浓度的抗菌药物与含有待检细菌的以一定浓度的抗菌药物与含有待检细菌的培养基进行一系列不同倍数稀释(通常为培养基进行一系列不同倍数稀释(通常为双倍稀释),经培养后观察其最低抑菌浓双倍稀释),经培养后观察其最低抑菌浓度。度。稀释法稀释法琼琼脂稀释法脂稀释法使用琼脂培养基使用琼脂培养基肉肉汤稀释法汤稀释法使用肉汤培养基使用肉汤培养基 16抗生素连续梯度法(抗生素连续梯度法(E-test法)法)将稀释法和扩散法的原理相结合,使用预先设将稀释法和扩散法的原理相结合,使用预先设定的稳定且连续的抗菌药物浓度梯度,采用琼脂培定的稳定且连续的抗菌药物浓度梯度,采用琼脂培养基培养以确定不同
8、抗菌药物对微生物的最低抑菌养基培养以确定不同抗菌药物对微生物的最低抑菌浓度(浓度(MIC)。)。17将培养基上分离的可疑致病菌配制成纯菌液,放入自动微将培养基上分离的可疑致病菌配制成纯菌液,放入自动微生物鉴定及药敏分析系统中,通过计算机自动扫描、读数、生物鉴定及药敏分析系统中,通过计算机自动扫描、读数、分析、最后报告鉴定及药敏结果。分析、最后报告鉴定及药敏结果。摘摘自自 临床微生物检验临床微生物检验(第五版)人民卫生出版社(第五版)人民卫生出版社自动微生物鉴定及药敏分析系统自动微生物鉴定及药敏分析系统18自动微生物鉴定及药敏分析系统自动微生物鉴定及药敏分析系统药敏检测原理药敏检测原理微型化的肉
9、汤稀释试验微型化的肉汤稀释试验根根据据CLSI标准得到相标准得到相应敏感度:敏感、中度应敏感度:敏感、中度敏感和耐药敏感和耐药微生物数码鉴定原理微生物数码鉴定原理计算并比较数据库内每计算并比较数据库内每个细菌条目对系统中每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率个生化反应出现的频率总和总和性能特点性能特点自动化程度较高、检测速度自动化程度较高、检测速度快、可鉴定细菌种类及药敏快、可鉴定细菌种类及药敏试验种类多、数据处理软件试验种类多、数据处理软件功能强大、结果准确可靠功能强大、结果准确可靠系统组成系统组成测试卡(板)、菌液测试卡(板)、菌液接种器、培养和监测接种器、培养和监测系统、数据管理系统
10、系统、数据管理系统自动微生物鉴自动微生物鉴定及药敏分析定及药敏分析系统系统19(三)细菌抗原(三)细菌抗原的检测的检测凝集试验凝集试验用已知抗体检测待检标本中未知的颗粒性抗原。用已知抗体检测待检标本中未知的颗粒性抗原。IgG的的Fc段与金葡菌的段与金葡菌的SPA结合,结合,Fab段与细菌抗原段与细菌抗原结合后,可使金葡菌发生肉眼可见的凝集现象。结合后,可使金葡菌发生肉眼可见的凝集现象。协同凝集试验协同凝集试验用已知的荧光抗体检测待检标本中的未知抗原,借用已知的荧光抗体检测待检标本中的未知抗原,借助荧光显微镜观察。助荧光显微镜观察。免疫荧光技术免疫荧光技术对流免疫电泳对流免疫电泳利用双向琼脂扩散
11、与电泳技术相结合的方法。由于电泳利用双向琼脂扩散与电泳技术相结合的方法。由于电泳和电渗作用,抗原向正极移动,抗体向负极移动,在比和电渗作用,抗原向正极移动,抗体向负极移动,在比例合适处形成肉眼可见的沉淀线。例合适处形成肉眼可见的沉淀线。用酶标记的抗体检测特异性可溶性抗原的实验技术。用酶标记的抗体检测特异性可溶性抗原的实验技术。酶免疫技术酶免疫技术20PCR(含(含RT-PCR、real time PCR等)等)核酸杂交核酸杂交技技术术基因芯片基因芯片技术技术16S rRNA基因序列基因序列分析分析(四)细菌核酸的检测(四)细菌核酸的检测21(五)生物芯片技术(五)生物芯片技术将核酸片段、蛋白质
12、或酶、抗原或抗体、将核酸片段、蛋白质或酶、抗原或抗体、细胞及组织等生物样品有序地固定于硅片、尼细胞及组织等生物样品有序地固定于硅片、尼龙膜等固相支持物上,在一定的条件下进行生龙膜等固相支持物上,在一定的条件下进行生化反应。用化学荧光法、酶标法或同位素法显化反应。用化学荧光法、酶标法或同位素法显示反应结果,通过特定的仪器读取与收集数据,示反应结果,通过特定的仪器读取与收集数据,并用软件进行数据分析,从而判断样品中靶分并用软件进行数据分析,从而判断样品中靶分子的种类和数量。子的种类和数量。22生物芯片的分类生物芯片的分类基基因芯片(因芯片(gene chips),又称),又称DNA芯片芯片蛋蛋白质
13、芯片白质芯片细细胞芯片胞芯片组组织芯片织芯片糖糖芯片芯片23生物芯片的用途生物芯片的用途微微生物感染的快速诊断:对某些病原体,如生物感染的快速诊断:对某些病原体,如细菌、真菌和病毒进行多重快速检查与鉴别;细菌、真菌和病毒进行多重快速检查与鉴别;微微生物变异机制和耐药机制的研究;生物变异机制和耐药机制的研究;微微生物基因分型及分子流行病学的调查;生物基因分型及分子流行病学的调查;微微生物基因组及后基因组的研究:可研究病生物基因组及后基因组的研究:可研究病原体基因的序列、转录表达、抗原的表达及原体基因的序列、转录表达、抗原的表达及细菌糖键的特异性研究;细菌糖键的特异性研究;抗抗微生物感染药物的研制
14、等。微生物感染药物的研制等。24三、细菌感染的血清学诊断三、细菌感染的血清学诊断l用已知的细菌或其特异性抗原检测病人血清用已知的细菌或其特异性抗原检测病人血清或其他体液中的抗体及其效价的变化,可以或其他体液中的抗体及其效价的变化,可以作为感染性疾病的辅助诊断。作为感染性疾病的辅助诊断。l由由于本实验多采取病人血清检测抗体,故常于本实验多采取病人血清检测抗体,故常称为血清学诊断(称为血清学诊断(serological diagnosis)。)。l一一般适用于抗原性较强的细菌,以及病程较般适用于抗原性较强的细菌,以及病程较长的感染性疾病。也可用于调查人群对某病长的感染性疾病。也可用于调查人群对某病
15、原菌的免疫应答水平以及检测疫苗接种后的原菌的免疫应答水平以及检测疫苗接种后的预防效果。预防效果。25细菌性感染的血清学诊断细菌性感染的血清学诊断血清学试验血清学试验疾病举例疾病举例直接凝集反应直接凝集反应肥达试验、外斐试验肥达试验、外斐试验乳胶凝集试验乳胶凝集试验脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌沉淀试验沉淀试验梅毒梅毒间接免疫荧光技术间接免疫荧光技术各类微生物感染各类微生物感染补体结合试验补体结合试验Q热热中和试验中和试验风湿热(抗风湿热(抗O试验)试验)酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验各类微生物感染各类微生物感染26第二节第二节 细细菌感染的特异性预防菌感染的特异性预防2
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