荧光定量PCR技术简要 PPT课件.pptx

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1、荧光定量荧光定量PCR的化学原理的化学原理水解探针的MIXSYBR染料的MIXSYBR染料染料结合于双链核酸的小沟处与双链DNA结合后受激产生荧光在变性条件下双链分开，荧光消失背景强，非特异性较强SYBR染料法的扩增曲线染料法的扩增曲线Taqman探针类探针类水解探针-Roche cobas与ABI TaqmanScorpions AnnealingElongationEnd of ElongationDenaturationFluoresceinLC Redfor sequence specific detection of DNA杂交探针检测罗氏专利性技术杂交探针检测罗氏专利性技术荧光定量

2、荧光定量PCR仪的光学原理仪的光学原理荧光染料的光学性质ABI 7500 Real-Time PCR Systems 光学原件荧光定量荧光定量PCR的数据分析的数据分析u 标准曲线法 u 2-Ct法 相对定量 标准曲线法标准曲线法 LogX0与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据未知样品Ct值，就可以在标准曲线上计算出未知样品初始模板量。优点：优点：无需作标准曲线无需作标准曲线 实用实用适合于配对样本的相对定量分析适合于配对样本的相对定量分析2-Ct法校正值=2 病人目的基因平均Ct值病人内参基因平均Ct值正常人目的基因平均Ct值正常人内参基因平均Ct

3、值实例举例-BCR/ABL1融合基因定量检测ABL扩增曲线RnBCR/ABL1-P210扩增曲线Rn报告举例序号序号缓解分解分类缓解指解指标备注注1完全血液学缓解（CHR）血细胞计数正常，白细胞分类计数正常，无髓外白血病表现 2主要细胞遗传学缓解（MCyR）Ph 阳性细胞=(135)%分子学研究已证实不论变异、复杂或遮蔽的Ph易位，CML患者都具有和典型Ph易位相同的分子病理学基础即bcr/abl基因重排,3完全细胞遗传学缓解（CCyR）Ph 阳性细胞=0（费城染色体传阴）4主要分子学反应（MMoR）Bcr-abl转录水平下降3个对数级以上;或BCR-ABL/ABL 0.1%慢性髓系白血病(C

4、ML)是一种血液系统的恶性肿瘤，以染色体异常t(9;22)(q34;q11)为特征，通过这种染色体易位激活了一种新的酪氨酸激酶BCR-ABL嵌合蛋白，此蛋白的产生成为此病发病的原因5完全分子学反应（CMoR）Bcr-abl转录水平下降4个对数级以上，RT-PCR检测BCR-ABL 为阴性CML缓解指标28mon;23%of Ph+metaphases35mon,CCyR41mon,MMoR细胞遗传+FG分子检测监测CML治疗-举例32mon;23%of Ph+metaphases比较Ct值法-实例Pfaffl equation:if Eref=a,Etar=b,so:-Fold change=b(CTtarget)/a(CTref.)THE END!